2024, Vol. 45
2. 国家重金属污染防治工程技术研究中心, 长沙 410083
2. National Engineering Research Center for Control and Treatment of Heavy Metal Pollution, Changsha 410083, China
传统的污水生物脱氮系统中, 需要为硝化细菌氧化氨创造好氧条件, 为反硝化细菌去除硝酸盐提供有机碳, 既消耗大量能量又面临有机物残留的二次污染风险. 厌氧氨氧化菌能在缺氧条件下直接将氨和亚硝酸盐转化为氮气[1]. 该技术无需氧气和有机碳源, 具有经济环保的优势, 被认为是最具发展潜力的生物脱氮技术.
厌氧氨氧化菌为化能自养菌, 世代周期长（倍增时间10~12 d）, 对环境变化敏感[2]. 在污水厂运行过程中, 常常存在流量或成分波动, 以及因维护而关闭污水处理系统, 会使厌氧氨氧化菌遭遇长期饥饿, 从而恶化污水处理效果. 基于长期饥饿的视角, 重新审视与评价厌氧氨氧化（ANAMMOX）反应器的启动与恢复性能、揭示其饥饿耐受机制具有重要的现实意义. 以往的研究考察了基质类型（铵盐、亚硝酸盐、联氨）[3]、氧含量（厌氧、缺氧、好氧）[4]、温度（20℃、4℃）[5]和饥饿模式（连续、间接）[6]等生存条件对厌氧氨氧化污泥的饥饿和恢复的影响. 此外, 有研究表明饥饿持续时间的增加会加大活性恢复的难度[7, 8], 添加填料（彗星纤维填料）[9]或有机碳源（葡萄糖）[10]有利于缩短活性恢复时间. 但是关于不同接种污泥类型和操作条件对反应器长期饥饿后性能恢复影响的系统研究, 以及污泥对长期饥饿的耐受机制则鲜见报道. 明晰厌氧氨氧化性能对长期饥饿的响应、优选恢复期的运行策略并解析饥饿恢复过程中污泥特性变化, 对于反应器抵抗长期饥饿和提高脱氮性能具有重要意义.
本文以经历启动、长期饥饿和恢复过程的4个厌氧氨氧化反应器为研究对象, 探究了接种污泥类型（硝化、反硝化污泥）和反应器运行方式（流量控制、浓度控制）对启动和饥饿耐受性能的影响, 分析了恢复过程中微生物群落结构和基因表达量的变化规律, 以期为厌氧氨氧化反应器的稳定运行提供参考.
1 材料与方法 1.1 接种污泥本实验污泥取自长沙洋湖湿地公园污水处理厂的硝化和反硝化水池, 其污泥挥发性悬浮物和悬浮固体的比值分别为0.74和0.68.
1.2 模拟废水本实验用模拟废水由铵态氮（NH4+-N）、亚硝酸盐氮（NO2--N）、矿质溶液和微量元素组成[11].（NH4）2SO4和NaNO2浓度由进水氮负荷决定, 且NH4+-N和NO2--N浓度保持一致. 其他组成如下（每L）：3.5 g NaHCO3；0.3 mg MgSO4·7H2O；0.01 mg NaH2PO4；0.0056 mg CaCl2·2H2O. 微量元素Ⅰ和Ⅱ分别为1.25 mL·L-1. 微量元素Ⅰ：5.00 g EDTA、5.00 g FeSO4；微量元素Ⅱ：15 g EDTA、0.43 g ZnSO4·7H2O、0.24 g CoCl2·6H2O、0.99 g MnCl2·4H2O、0.25 g CuSO4·5H2O、0.22 g Na2MoO4·2H2O、0.19 g NiCl2·6H2O、0.21 g Na2SeO4、0.014 g H3BO4·7H2O.
1.3 反应器的长期运行4个有效容积为1 L的连续流流式厌氧污泥床反应器的接种污泥类型和运行方式见表 1, 各反应器的污泥接种量、负荷和实验条件均保持一致.
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表 1 反应器启动及运行策略1） Table 1 Strategy for start-up and long-term operation of bioreactors |
1.4 比厌氧氨氧化活性测定
将5 g相对干燥的污泥和100 mL基质[ρ（NH4+-N）和ρ（NO2--N）均为70 mg·L-1]加入玻璃血清瓶, 用橡胶塞和铝盖密封. 在37℃的恒温水浴振荡器上以170 r·min-1的转速孵育8 h. 用0.22 μm滤膜过滤后, 每隔2 h测定基质浓度. 通过基质降解曲线直线拟合的斜率和污泥浓度的比值计算污泥的比厌氧氨氧化活性（specific ANAMMOX activity, SAA）[12].
1.5 测定项目及方法采用美国公共卫生协会标准方法, 利用分光光度计测定NH4+-N、NO2--N和NO3--N浓度[13], 三者之和表示总氮浓度. 采用热提取法分层提取胞外多聚物[14]（extracellular polymeric substances, EPS）, 包括溶解性EPS（SB-EPS）、松结合态EPS（LB-EPS）和紧结合态EPS（TB-EPS）. 分别采用BCA试剂盒和苯酚-硫酸法测定EPS中的蛋白质（protein, PN）和多糖（polysaccharose, PS）含量[15]. 质量法测定污泥的悬浮固体（suspended solid, SS）和挥发性悬浮物（volatile suspended solids, VSS）[16]. 扫描电镜成像分析污泥的表面形貌.
1.6 实时荧光定量PCR检测及多样性分析通过逆转录酶定量聚合酶链反应定量分析了编码亚硝酸盐/一氧化氮氧化还原酶（nitrite/nitric oxide oxidoreductase, nirS）、联氨合成酶（hydrazine synthase, hzsA）和联氨脱氢酶（hydrazine dehydrogenase, hdh）的基因表达量, 并以细菌16S rRNA归一化. 用细菌DNA分离试剂盒组件提取样品DNA, 利用引物对338 f和806 r扩增V3~V4区细菌16S rRNA基因[17], 采用高通量测序检测微生物群落结构的演替（美吉生物公司）.
2 结果与讨论 2.1 厌氧氨氧化反应器的快速启动及稳定运行接种污泥类型和运行方式对反应器启动、运行和恢复的影响如图 1. 按表 1的策略运行反应器, 根据脱氮性能将运行过程分为：启动期（第1~17 d）、稳定运行期（第18~85 d）、饥饿期（第86~229 d）和恢复期（第230~260 d）.
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NLR为氮负荷（nitrogen loading rate）, NRR为氮去除速率（nitrogen removal rate）, TN为总氮（total nitrogen） 图 1 厌氧氨氧化反应器的运行性能 Fig. 1 Nitrogen removal performance of ANAMMOX reactors |
启动期4个反应器的氮负荷（nitrogen loading rate, NLR）保持一致. 以NH4+-N去除率首次由负转正所需时间作为评价启动速度的指标, 以其后NH4+-N去除率下降至0所需时间作为评价启动稳定性的指标. 接种反硝化污泥能更快结束菌体自溶阶段, 反应器启动更快速；高浓度低流速的运行方式下, 脱氮性能更稳定. 通过不同运行方式提升4个反应器的NLR. 其中, R1和R2维持水力停留时间（hydraulic retention time, HRT）为12 h, 通过提高进水N浓度来提升负荷. 相同运行方式下, 接种硝化污泥的R1对于基质浓度变化更为敏感, 进水ρ（N）由100 mg·L-1提升至200 mg·L-1时, 出水ρ（NH4+-N）从2.6 mg·L-1增加到29.7 mg·L-1；接种反硝化污泥的R2出水ρ（NH4+-N）波动则较小, 从4.9 mg·L-1增加到7.2 mg·L-1. R3和R4在第18~72d维持HRT为24 h, 通过提高进水基质浓度来提升负荷, 第73~85 d保持进水ρ（TN）为600 mg·L-1, 通过降低HRT来提升负荷. 相同HRT下, 接种反硝化污泥的R4的NH4+-N出水波动小且浓度低, 当HRT逐渐缩至12 h, 氮去除速率（nitrogen removal rate, NRR）达1.03 kg·（m3·d）-1, NH4+-N、NO2--N和总氮去除率分别高达98.7%、99.3%和89.3%, 佐证了接种反硝化污泥利于反应器的稳定运行. 此外, 与同为接种反硝化污泥的R2相比, R4氮去除率更高, 这与陈等[18]的研究结果一致, 说明高浓度低流速运行更利于氮去除.
2.2 厌氧氨氧化反应器饥饿后的恢复性能（第230~260d）因疫情封控, 实验室稳定运行85 d的反应器不得不开始长达144 d且由低温到较高温度下的停滞（2020年1~6月）. 基于这一实际情况, 为了探究接种污泥类型和运行方式对厌氧氨氧化脱氮性能的相对影响程度, 在恢复阶段保持接种污泥类型不变, 更改运行方式为：高基质浓度低流速运行R1和R2, 低基质浓度高流速运行R3和R4.
R1和R2维持HRT为14 h, 提高进水ρ（TN）为200、400和600 mg·L-1. 为了同R1和R2维持相同NLR, R3和R4缩小HRT为7 h的同时依次降低进水ρ（TN）为100、200和300 mg·L-1, 各浓度均维持10 d. 第251~260 d, 4个反应器的NLR均恢复至饥饿前, 出水ρ（NH4+-N）分别为：13.9（R1）、12.5（R2）、3.7（R3）和2.6（R4）mg·L-1, 优于饥饿前（25.6、28.5、8.0和5.9 mg·L-1）, 表明反应器有效恢复. 第260 d, R3和R4的NRR整体优于R1和R2, 说明相比运行方式, 接种污泥类型对厌氧氨氧化脱氮性能的相对影响程度更大；经历长期饥饿后, 相比高水量冲击, 污泥对高基质浓度更为敏感. 因此接种反硝化污泥, 采用高流速低基质浓度的恢复策略最优, 其NH4+-N、NO2--N和总氮去除率分别达到99.8%、99.8%和93.6%. 另外, 即使经过长达144 d的饥饿, 4个反应器的厌氧氨氧化性能均在30 d内恢复. 且饥饿8个月后恢复时间为15 d和92 d[8, 10], 说明厌氧氨氧化体系具备从长期饥饿中快速恢复活性的能力.
2.3 恢复过程的污泥特性 2.3.1 污泥形貌饥饿恢复前后的污泥形貌见图 2. 即使经历了长期饥饿, 污泥仍保持典型厌氧氨氧化菌的花椰菜形貌. 脱氮性能最差的R1中部分污泥分散, 呈黑色絮状, 且伴有刺鼻恶臭, 推测是由于长时间缺乏基质, 部分细菌通过自溶维持反应器中大部分细菌的生命活动. 其余3个反应器的污泥性状则与R1不同, 可能与细菌被EPS包裹有关. EPS中的有机成分可参与反硝化或微生物氧化[19], 消耗氧气并产生CO2, 为厌氧氨氧化菌提供厌氧环境和无机碳源. 经过30 d的恢复, 污泥由深棕色变为棕褐色. 恢复过程中出现污泥上浮现象, 可能是由于污泥内部的细胞裂解形成气穴, 使其密度小于水[20].
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第三行每张照片自左到右分别为R1、R2、R3和R4的污泥 图 2 饥饿恢复前后各反应器中的污泥形貌 Fig. 2 Sludge morphology after starvation and recovery |
饥饿恢复前后的污泥EPS含量及组分变化如图 3（a）. EPS是一种微生物分泌的高分子化合物, 是污泥的重要组成部分[21], 其中PN和PS约占总EPS的80%. EPS主要扮演“茧”的角色, 以减少外界对细胞的干扰, 在饥饿条件下使细胞达到深层休眠状态[6]. 据报道, 胞外酶可将EPS降解为低分子量化合物, 在饥饿期为微生物提供碳源和能源[6], 维持生长代谢. 厌氧氨氧化菌的生长繁殖过程中会产生大量EPS, 并紧紧包裹在细胞表面, 在厌氧氨氧化菌遭受长期饥饿时发挥重要作用.
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（a）胞外蛋白和多糖含量；（b）比厌氧氨氧化活性 图 3 饥饿恢复前后污泥性质变化 Fig. 3 Changes in sludge properties after starvation and recovery |
经30 d恢复后, 污泥的EPS分别提升了63%（R1）、85%（R2）、71%（R3）和70%（R4）. 由于长期饥饿过程中异养菌占比增加, 它们将结合较松散的S-EPS和L-EPS用作碳源, 使其在恢复期的含量减小；而结合紧密的T-EPS难以被微生物利用, 因而在恢复期相对增加量更多. 较高的PN含量可能使厌氧氨氧化菌呈现出高疏水性[22], 这有利于细胞间的聚集并进一步形成强大的微菌落结构, 从而表现出更高的适应性[22]. 虽然EPS对污泥聚集的增强作用有利于厌氧氨氧化菌的持留, 并进一步利于脱氮性能的提升, 但前文所述的R4脱氮性能最优, 其EPS含量却最少, 由此可见, 并不是EPS越多, 脱氮性能越优. 据报道, 污泥会通过减少EPS合成基因的表达以阻止颗粒的持续聚集[23], 进而优化污泥粒径. 适宜的污泥粒径有利于提高营养物从细菌表面到内部的传质效率, 从而提高厌氧氨氧化活性和脱氮性能.
2.3.3 污泥活性及比厌氧氨氧化活性经过30 d的恢复后, 污泥VSS/SS下降（表 2）, 说明微生物量下降. 与接种硝化污泥的R1和R3不同, 接种反硝化污泥的R2和R4中的污泥VSS下降, 导致VSS/SS分别下降45%和32%. 经30 d后厌氧氨氧化性能有效恢复[图 3（b）], SAA分别提升了123%（R1）、147%（R2）、101%（R3）和192%（R4）. 接种反硝化污泥的R2和R4恢复效果更优, 其中, 低基质浓度高流速运行的R4最优, SAA铵态氮、SAA亚硝酸盐氮和SAA总氮分别提高了208%、174%和192%. 值得注意的是, 随着基质的变化, 厌氧氨氧化菌逐渐恢复并占据优势地位, 而生长较快的异养菌则被淘洗, 使VSS/SS降低.
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表 2 饥饿恢复前后污泥浓度变化 Table 2 Changes in sludge concentration after starvation and recovery |
2.4 恢复过程的组学分析
饥饿恢复前后, 总丰度前20的微生物群落组成变化如图 4（a）, 样本按照反应器运行时间聚类为“饥饿”与“恢复”两大类. 此外, ANOSIM分析结果表明[图 4（b）], 按照反应器运行时间分类, 组间差异显著大于组内差异, 即, 相比接种污泥类型和运行方式, 反应器运行时间是微生物群落结构演替的主要驱动因素. 后文将主要探究反应器恢复前后污泥中微生物组成的变化.
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（a）微生物群落组成分析（数字为反应器序号, s表示饥饿期, r表示恢复期）；（b）ANOSIM分析（距离算法为bray-curtis）；（c）Venn图分析 图 4 饥饿恢复前后污泥微生物特性变化 Fig. 4 Changes in sludge microbial characteristics after starvation and recovery |
通过统计多样本中所共有和独有的物种（用OTU表示）数目, 直观地展现不同样本中物种组成相似性及重叠情况[图 4（c）]. 相比饥饿期, 恢复期独有的OTU数由233骤降为86. 这可能是由于饥饿期间污泥裂解释放有机物, 利于异养菌的生存, 微生物组成更为多样；恢复后生存环境较为单一, 依赖有机物生长的异养菌被淘洗, 微生物组成多样性下降. 经过30 d的恢复后, 反映群落多样性的Shannon指数、反映群落丰富度的Chao和Ace指数均显著下降（P < 0.01）, 进一步佐证了污泥的多样性和丰富度降低.
2.4.2 厌氧氨氧化菌属分布本研究中的厌氧氨氧化菌属分布情况如表 3所示：以Candidatus Kuenenia为主, Candidatus Brocadia次之, Candidatus Jettenia极少. 由于接种污泥类型和反应器运行方式不同, 各反应器内厌氧氨氧化菌在属水平上的分布不同, 可能导致协同脱氮性能的差异. 整体而言, 恢复30 d后Candidatus Brocadia相对丰度整体下降, 而Candidatus Kuenenia则大幅提升（表 3）, 提升比例分别为119%（R1）、129%（R2）、105%（R3）和86%（R4）, 说明Candidatus Kuenenia在饥饿胁迫下节省能量和维持基本代谢过程的能力更优, 利于恢复脱氮性能. 这与Kang等[24]的研究结果一致, Candidatus Kuenenia在高负荷（恢复期）生存能力更强, 而Candidatus Brocadia则在低负荷下（饥饿期）生长更好.
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表 3 饥饿恢复前后厌氧氨氧化菌属分布/% Table 3 Distribution of ANAMMOX bacteria at genus level after starvation and recovery/% |
厌氧氨氧化菌代谢过程中编码联氨合成酶、联氨脱氢酶和亚硝酸盐还原酶的hzsA、hdh和nirS基因的mRNA水平如图 5. 在饥饿过程中, 基质限制阻碍了参与主要代谢途径的基因转录. 虽然水平较低, 但饥饿期间稳定的mRNA表达可以保证相应的蛋白质合成过程的稳定进行, 仍有利于细菌在饥饿期间的存活和饥饿后的恢复. 上述3种基因的mRNA丰度在饥饿恢复后有明显的提高, 说明厌氧氨氧化菌活性提高. 其中R4污泥样品的基因表达量提升幅度最大, nirS、hzsA和hdh的基因表达量分别提升为饥饿期的67、18和4倍.
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图 5 饥饿恢复前后厌氧氨氧化的相关基因表达量变化 Fig. 5 Changes in ANAMMOX-related gene expression after starvation and recovery |
基于样本中群落丰度数据, 通过Wilcox秩和检验分析饥饿期和恢复期相对丰度均值前15的微生物在属水平的差异显著性（图 6）. 恢复期反硝化菌的相对丰度整体下降, 而厌氧氨氧化菌的相对丰度则整体上升, 说明反硝化作用逐渐减少, 厌氧氨氧化作用逐渐恢复. 经30 d的恢复后, Thiobacillus、Parcubacteria、Denitratisoma、norank_c_Bacteroidetes_vadinHA17和unclassified_k_norank的相对丰度显著低于饥饿期（P < 0.05）. 其中, Thiobacillus是利用硝酸根和亚硝酸根作最终电子受体将硫化物氧化为硫酸盐的自养反硝化菌[25], 能在厌氧条件下通过反硝化作用氧化无机硫类化合物[26]. 这说明厌氧氨氧化和硫的代谢密切相关, 这可能是由于长期以来, NH4+以硫酸铵形式输入的缘故, 也暗示着厌氧氨氧化菌与硫代谢细菌可能存在互利共生关系. 此外, Parcubacteria能将糖发酵成有机酸为异养菌提供碳源[27, 28], Denitratisoma能利用细菌的裂解物进行反硝化, 其饥饿期丰度高, 佐证了细菌裂解现象的发生. Anaerolineaceae常以厌氧氨氧化菌的胞外多糖为碳源[29], 经过恢复后, 其相对丰度显著高于饥饿期（P < 0.05）, 佐证了恢复期厌氧氨氧化菌大量生长繁殖使EPS大幅增加, 这些丰富的EPS有利于厌氧氨氧化菌度过长期饥饿期. 恢复后厌氧氨氧化菌属水平上无显著差异, 说明经历长期饥饿后厌氧氨氧化菌没有大量消亡, 仍具有一定的抗饥饿冲击能力. 这可能得益于丰富的EPS含量和厌氧氨氧化功能基因（nirS、hzsA和hdh）的稳定表达, 使厌氧氨氧化菌能保持细胞完整并维持厌氧氨氧化活性以抵抗长期饥饿胁迫.
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*表示P < 0.05 图 6 饥饿恢复前后物种差异分析（属水平） Fig. 6 Analysis of species after recovery from starvation (genus) |
（1）采用接种反硝化污泥, 高基质浓度低流速启动的运行策略, 144 d的长期饥饿后转为低基质浓度高流速运行的恢复策略, 反应器启动速度快、运行稳定性优且恢复性能好. 稳定运行85 d后NH4+-N、NO2--N和总氮去除率分别高达98.7%、99.3%和89.3%, 饥饿144 d后, 经30 d运行NH4+-N、NO2--N和总氮去除率可恢复至99.8%、99.8%和93.6%.
（2）丰富的EPS和稳定的厌氧氨氧化功能基因（nirS, hzsA和hdh）的表达, 使厌氧氨氧化菌保持细胞完整并维持活性以抵抗长期饥饿胁迫. 其中, Candidatus Kuenenia具有更强的抵抗饥饿的能力, 经30 d恢复后相对丰度提升了86%以上. 饥饿过程中异养反硝化菌以EPS和细胞水解产物作为电子供体, 通过微生物氧化作用提供无机碳源, 供厌氧氨氧化菌生长. 恢复过程中异养菌被淘洗, 污泥活性降低, 比厌氧氨氧化活性恢复.
（3）饥饿恢复后一些以厌氧氨氧化菌胞外多糖作为碳源的微生物, 如异养菌Anaerolineaceae、厌氧氨氧化菌Candidatus Kuenenia和硫代硫酸盐还原菌Limnobacter的相对丰度大幅增加；硫自养反硝化菌Thiobacillus、能将糖发酵成有机酸从而为异养菌提供碳源的Parcubacteria和能利用细胞水解产物的异养反硝化菌Denitratisoma的相对丰度则显著下降.
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