2023, Vol. 44
2. 自然资源部海洋生态环境科学与技术重点实验室, 青岛 266061;
3. 青岛海洋科学与技术试点国家实验室, 海洋生态与环境科学功能实验室, 青岛 266237
2. Key Laboratory of Marine Eco-Environmental Science and Technology, Ministry of Natural Resources, Qingdao 266061, China;
3. Laboratory for Marine Ecology and Environmental Science, Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology, Qingdao 266237, China
挥发性卤代烃(volatile halocarbons, VHCs)是重要的痕量温室气体, 主要包括氯、溴和碘取代的甲烷或乙烷等.VHCs进入大气后, 吸收红外辐射引起温室效应[1]或破坏臭氧层[2, 3], 直接或间接地影响气候变化, 因此在全球气候变化中发挥着重要作用[4].
海洋释放是大气中VHCs最主要的天然来源[5].海洋释放的VHCs主要由大型藻类和浮游植物产生[6, 7], 其中海洋微藻分布广泛, 是VHCs的主要释放者[8].海洋微藻产生VHCs的机制尚没有明确的结论, 目前认为其生成机制与卤素过氧化物酶(haloperoxidase, HPO)催化有关.Wuosmaa等[9]提出在HPO的催化作用下, 生物吸收的卤化物与生物活动产生的H2 O2发生反应生成VHCs.已有多种VHCs的生成被证明与HPO有关, 如CHBr3[10].海洋环境因素如营养盐、溶解有机物含量影响微藻VHCs释放[11~13].
粒径 < 5 mm的塑料碎片被称为微塑料, 近几年来其作为一种重要污染物, 引起了国内外学者的广泛关注[14~16], 许多学者对水体、土壤、大气和生态系统中的微塑料进行了一系列研究[17~20].微塑料被认为是海洋环境的巨大威胁, 特别是对作为海洋初级生产力的主要贡献者海洋微藻生长的影响[21].有研究指出微塑料对微藻的生长影响与微塑料种类、粒径、浓度和微藻种类等有关.例如Wang等[22]研究表明聚氯乙烯微塑料影响海洋硅藻的光合作用进而对藻类产生物理伤害.Zhao等[23]研究发现纳米级的微塑料对海洋甲藻米氏凯伦藻(Karenia mikimotoi)的生长、氧化应激和细胞微观结构有严重的负面影响.Mao等[24]研究指出高浓度和小尺寸的微塑料对绿藻小球藻(Chlorella vulgaris)生长的抑制作用更大.Chae等[25]观察到高浓度PE微塑料(>200 mg ·L-1)暴露6 d后促进海洋微藻杜氏盐藻(Dunaliella salina)的生长和光合活性.此外, 微塑料短期暴露影响海洋微藻溴代甲烷的释放已经被报道, Lang等[26]研究指出48~96 h内高浓度聚苯乙烯(polystyrene, PS)微塑料抑制了三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)释放VHCs.然而, 关于微塑料长期暴露胁迫对海洋微藻释放卤代烃的影响目前尚未见报道.本文通过室内模拟实验, 以小新月菱形藻和东海原甲藻作为实验藻种, 将其长时间暴露于聚乙烯微塑料环境, 测定生长周期内微藻的生长、光合作用、氧化应激和VHCs浓度.本文研究海洋中最广泛存在的聚乙烯微塑料长时期暴露胁迫对海洋微藻释放VHCs的影响, 以期为深入了解海洋环境微塑料污染对微藻生长和天然源卤代烃排放的影响提供理论依据.
1 材料与方法 1.1 单种微藻培养近年来人类活动增加了海洋中营养盐的含量, 导致我国河口近岸赤潮频发, 危害程度也在增加[27].此外, 有研究者认为海洋硅藻贡献了全球初级生产力的20% 左右[28], 而且Lim等[29]发现硅藻能释放多种卤代烃.小新月菱形藻作为一种重要的海洋硅藻, 已被广泛应用于藻类生理研究领域.因此本实验选取引发赤潮的藻种东海原甲藻和小新月菱形藻作为实验藻种.培养所用的两种藻类取自中国海洋大学海洋污染生态化学实验室.
本实验所用的2 L锥形瓶依次在体积分数为10%的盐酸溶液中浸泡24 h及用去离子水和超纯水冲洗.培养实验所用海水为东海海水(取自126.71°E, 29.99°N), 依次用0.45 μm和0.22 μm的醋酸纤维滤膜过滤后, 再将锥形瓶和过滤后的海水放入高压蒸汽灭菌锅, 设定121℃灭菌20 min.
每个锥形瓶中倒入1.5 L灭菌海水(经过氮气鼓泡除去天然海水中本底VHCs), 并加入一定量的PE微塑料颗粒(50 μm), 使其浓度分别为10、50和100 mg ·L-1, 超声振荡30 min, 作为实验组.不添加PE微塑料的作为对照实验组, 均设置3个重复培养瓶进行实验.加入f/2配方培养基, 分别接入指数生长期的小新月菱形藻和东海原甲藻, 使其初始藻密度分别为6.85×104 cell ·mL-1和3.09×103 cell ·mL-1.将培养锥形瓶置于光照培养箱(GXZ-380B, 宁波江南), 光/暗条件为12 h/12 h, 室温恒定为16℃, 培养24 d, 每隔2 d取样, 共取样10次.
1.2 藻细胞密度的测定藻细胞密度用血细胞计数板在电子显微镜(CX31RTSF, 日本奥林巴斯)下计数.
1.3 最大光量子效率(Fv/Fm)的测定取2 mL藻液, 使用Aqua Pen手持式藻类荧光测量仪测定Fv/Fm, 测定前进行20 min的暗处理.
1.4 活性氧(ROS)的测定取2 mL藻液以3 000 r ·min-1的转速离心10 min, 弃去上清液, 加入1 mL稀释1 000倍的2, 7-二氯荧光黄双乙酸盐(DCFH-DA)溶液, 于暗环境中培养20 min, 每隔5 min混匀一次, 使其充分与藻细胞反应.再次离心收集藻细胞, 用1 mL体积分数为10%的磷酸缓冲盐溶液(PBS)冲洗3次, 洗去残余的DCFH-DA, 最后加入4 mL的PBS缓冲液重悬.用荧光分光光度计(日立F-4700, 日本日立)测定ROS.
1.5 挥发性卤代烃(VHCs)浓度的测定移取60 mL藻液至气密性的培养瓶中, 于光照培养箱上密闭培养24 h.移取30 mL藻液, 经玻璃纤维滤膜(0.7 μm)过滤后注入定制吹扫捕集装置的气提室, 用60 mL ·min-1的高纯氮气吹扫.吹扫出的气体依次经过高氯酸镁干燥剂和载体氢氧化钠干燥后, 再用液氮(-176℃)进行冷阱捕集预浓缩14 min, 最后用沸水解吸2 min, 解吸后VHCs进入连接电子捕获检测器(ECD)的气相色谱仪(GC2030, 日本岛津)分析测定.利用外标法进行定量分析(VHCs标准品购自美国o2is公司, 其中CHBrCl2, 2.019 mg ·L-1; CHBr2Cl, 4.015 mg ·L-1; CHBr3, 4.007 mg ·L-1), 具体方法见文献[30].
2 结果与讨论 2.1 聚乙烯微塑料对微藻生长的影响从小新月菱形藻细胞密度的变化可知, 0~14 d为微藻指数生长期, 培养14 d后进入稳定期(图 1). 培养第2 d, 10、50和100 mg ·L-1的PE微塑料添加开始抑制小新月菱形藻的生长, 且抑制率达到最大值, 分别为29.85%、17.23%和21.15%.随着培养时间增加, 抑制作用逐渐降低, 且不同培养时间抑制率存在明显差异(P < 0.05).培养14 d, 100 mg ·L-1的PE微塑料比10 mg ·L-1显著抑制微藻生长(P < 0.05).本实验中PE微塑料的添加对稳定期小新月菱形藻生长的促进作用不显著(P>0.05).此外, 在培养第7 d后, 对照组与低浓度(10 mg ·L-1)的实验组生长趋势较为一致, 在培养过程中低浓度组相比高浓度组更早表现出促进作用, 表明小新月菱形藻能更好地适应低浓度PE微塑料胁迫.
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不同小写字母表示不同浓度差异有统计学意义, 不同大写字母表示不同培养时间有统计学意义 图 1 不同浓度PE微塑料对小新月菱形藻细胞藻密度和抑制率的影响 Fig. 1 Effects of different PE microplastic concentrations on cell density and inhibitory rate of Nitzschia closterium f. minutissima |
东海原甲藻在0~4 d生长缓慢, 第7 d进入指数生长期(图 2).在培养过程中, 除培养的2~4 d表现出轻微的抑制作用外, PE微塑料对东海原甲藻的生长主要表现为促进作用.在培养第1 d, 微塑料对东海原甲藻生长表现出促进作用, 浓度为100 mg ·L-1的PE微塑料对东海原甲藻的促进作用显著高于50 mg ·L-1(P < 0.05).在7~14 d, 添加10~100 mg ·L-1的PE微塑料促进东海原甲藻的生长, 其中添加100 mg ·L-1高浓度PE微塑料的促进效果最明显, 尤其是第9 d的促进率高达70.90%.有研究表明, PE微塑料浸出液能促进藻类生长.Bhattacharya等[31]证明4, 4-二羟基-2, 2-二苯基丙烷(BPA)、邻苯二甲酸二丁酯(DBP)和紫外稳定剂(UV-326)均能促进杜氏盐藻生物量和叶绿素含量的增加.Chae等[25]研究发现微塑料(MPs)的渗出液存在以上几种添加剂, 然而, 这些化学物质的数量还没有确定. Kwak等[32]和Kim等[33]研究表明, 低浓度的化学物质促进了微藻的细胞生长和叶绿素含量的增加.约100~200 mg ·kg-1的BPA和100~2 000 mg ·kg-1的邻苯二甲酸(DEHP)分别略微提高了莱茵衣藻的细胞生长(生物量)和叶绿素含量.此外, 低浓度的壬基酚(塑料中使用材料的前体)促进了腰果环孢菌[34]和莱茵氏菌[35]的细胞生长.本实验中, 很可能由于PE微塑料中的BPA、DBP和紫外稳定剂等添加剂在培养过程中缓慢释出, 使得7~14 d的实验组东海原甲藻细胞密度高于对照组, 表现出生长促进作用.需要特别指出的是培养周期的末期22 d和24 d, 添加50 mg ·L-1的PE微塑料显著抑制东海原甲藻的生长(P < 0.05), 最大抑制率达21.79%.在50 mg ·L-1的PE微塑料中培养22 d和24 d, 东海原甲藻的Fv/Fm显著低于对照组和100 mg ·L-1浓度组(P < 0.05, 图 3).这与PE微塑料与藻细胞的长期相互作用有关.由于东海原甲藻藻细胞密度较低, 其与100 mg ·L-1高浓度PE微塑料发生异聚作用较弱, 使PE微塑料容易在培养体系中发生聚沉, 造成遮光效应减弱, 从而导致其对东海原甲藻Fv/Fm的抑制率低于50 mg ·L-1的PE微塑料实验组.然而, 需要进一步地研究, 以确定塑料老化后产生化学添加剂的数量以及评估化学添加剂进入海洋生态系统的情况.未来也需要进一步地研究, 以便阐明在培养周期的末期微塑料抑制东海原甲藻的生长的原因.
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不同小写字母表示不同浓度差异有统计学意义, 不同大写字母表示不同培养时间有统计学意义 图 2 不同浓度PE微塑料对东海原甲藻细胞藻密度和抑制率的影响 Fig. 2 Effects of different PE microplastic concentrations on cell density and inhibitory rate of Prorocentrum donghaiense |
总体来说, PE微塑料对硅藻生长的抑制作用更明显, 而对甲藻主要表现出促进作用.可能由于小新月菱形藻体积较小, 更易受到PE微塑料遮蔽作用的影响.这表明PE微塑料对微藻生长的影响与微藻的种类有关.
2.2 聚乙烯微塑料对微藻光合作用的影响Fv/Fm表示光合系统Ⅱ(PSⅡ)的最大光量子效率, 这一比值与PSⅡ活性有关.通常情况下, Fv/Fm降低表示PSⅡ活动的减少[36], 在营养盐缺乏, 温度过高或过低, 光照强度减弱等情况下, 会造成Fv/Fm降低[16].
暴露于不同浓度的PE微塑料下, 小新月菱形藻Fv/Fm的变化见图 3(a).添加PE微塑料的实验组中, 小新月菱形藻的Fv/Fm均受到抑制, 在0~14 d的指数生长期内, 添加10、50和100 mg ·L-1的PE微塑料对小新月菱形藻Fv/Fm的最大抑制率分别为4.02%、5.65%和10.38%, 表现出一定的浓度效应.这些结果说明PE微塑料浓度增加, 降低了小新月菱形藻光合系统活性, 影响其光合作用.不添加微塑料的东海原甲藻的Fv/Fm随培养时间逐渐升高, 在11 d之后稳定在0.60左右[图 3(b)].而添加10~100 mg ·L-1 PE微塑料的东海原甲藻Fv/Fm在整个培养周期内均受到抑制, 并且Fv/Fm在培养第11 d后显著下降, 添加10、50和100 mg ·L-1的PE微塑料对东海原甲藻Fv/Fm的最大抑制率分别为9.83%、35.60%和21.57%.实验结果表明, 高浓度PE微塑料能够对小新月菱形藻和东海原甲藻的Fv/Fm起到抑制作用.可能是由于50 μm的大粒径和高浓度PE微塑料对微藻生长起到了遮光作用[37].此外, PE微塑与藻细胞结合, 使藻细胞光合作用中的光电子传输减弱, PSⅡ活性减弱.
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图 3 不同浓度PE微塑料对小新月菱形藻和东海原甲藻最大光量子效率(Fv/Fm)的影响 Fig. 3 Effects of different PE microplastic concentrations on the maximal photochemical efficiency (Fv/Fm) of Nitzschia closterium f. minutissima and Prorocentrum donghaiense |
活性氧(ROS)指生物体内氧的单电子还原产物, 如过氧化氢(H2 O2)、超氧阴离子自由基(·O2-)、羟基自由基(·OH)和单线态氧(1 O2)[38].ROS增加表明细胞处于氧化应激状态, 过量的ROS会引起细胞膜损伤[39].
小新月菱形藻在指数生长期时, 添加10 mg ·L-1和50 mg ·L-1微塑料实验组中的ROS水平与对照组相差不大, 说明其受到的微塑料胁迫不大[图 4(a)].培养14 d后ROS的相对含量开始上升, 并分别在22 d和17 d达到最大, 分别为对照组的1.23和1.32倍.而添加100 mg ·L-1微塑料实验组中ROS的相对含量在整个培养期均处于较高状态, 培养第2 d的ROS水平为对照组的1.46倍, 培养第11 d后略微降低.由此表明100 mg ·L-1高浓度PE微塑料更能刺激小新月菱形藻进行氧化应激反应, 对藻细胞造成更严重的损伤.0~4 d东海原甲藻处于生长停滞期, 藻细胞密度较低, PE微塑料能够刺激其产生氧化应激反应, 增加细胞内ROS的含量, 但ROS的相对含量与微塑料的浓度无明显关系[图 4(b)].在培养11 d后, 高浓度微塑料添加(50 mg ·L-1和100 mg ·L-1)的实验组能刺激东海原甲藻产生更多ROS.指数生长期内10、50和100 mg ·L-1微塑料的实验组中ROS含量的最大值分别为对照组的1.52、1.87和1.68倍, 明显高于小新月菱形藻的ROS相对值, 表明东海原甲藻受到微塑料刺激后, 氧化应激反应较小新月菱形藻更为明显.
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图 4 不同浓度PE微塑料暴露下小新月菱形藻和东海原甲藻ROS相对值的变化 Fig. 4 Effects of different PE microplastic concentrations on relative levels of reactive oxygen species (ROS) of Nitzschia closterium f. minutissima and Prorocentrum donghaiense |
本实验结果表明, PE微塑料能引起小新月菱形藻和东海原甲藻的氧化应激反应, 促进微藻细胞产生ROS, 且10 mg ·L-1的低浓度微塑料的添加对于两种藻的氧化应激反应刺激并不明显.小新月菱形藻ROS相对含量随微塑料浓度的变化与其Fv/Fm抑制率随微塑料浓度的变化相同, 在高浓度微塑料环境中, 小新月菱形藻的ROS相对值和Fv/Fm抑制率均较高, 这与ROS的产生原因有关; 在叶绿体光合系统中, ROS是电子传递链的副产物, 电子转移速率降低造成电子堆积, 影响微藻的Fv/Fm, 同时导致ROS水平上升[37].
2.4 聚乙烯微塑料对微藻释放VHCs的影响 2.4.1 小新月菱形藻不同浓度PE微塑料胁迫下小新月菱形藻对CHBrCl2、CHBr2Cl和CHBr3这3种VHCs的释放量随培养时间的趋势如图 5所示, 其中CHBrCl2与CHBr2Cl的释放趋势较为一致.除第1 d外, CHBrCl2和CHBr2Cl在微藻指数生长期总体呈现出平稳释放的状态, 17 d之后释放量逐渐升高, 且添加PE微塑料的实验组中CHBrCl2和CHBr2Cl释放量在稳定期高于对照组.CHBr3释放量在4~7 d产生峰值后, 同样在第17 d后升高, 且实验组释放量高于对照组, 表明在17 d后, 微塑料能促进小新月菱形藻释放3种VHCs.对小新月菱形藻在不同浓度PE微塑料中CHBrCl2、CHBr2Cl和CHBr3释放速率进行藻密度归一化后的变化分析, 发现单个细胞的释放速率随培养时间延长逐渐下降(图 6).这与Lim等[6]通过培养实验报道的CHBr3和CHBr2Cl的释放速率变化趋势一致.受微塑料胁迫的实验组中, 第1 d, 3种VHCs的释放速率均小于对照组(P < 0.05), 这表明培养初期小新月菱形藻释放VHCs受到PE微塑料胁迫的显著影响.但在第2 d后, 实验组中CHBrCl2和CHBr2Cl的释放速率开始高于对照组, 表明微塑料胁迫的影响降低.
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图 5 不同浓度PE微塑料暴露下小新月菱形藻CHBrCl2、CHBr2Cl和CHBr3释放量的变化 Fig. 5 Changes in CHBrCl2, CHBr2Cl, and CHBr3 concentrations released by Nitzschia closterium f. minutissima under different PE microplastic concentrations |
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不同小写字母表示不同浓度差异有统计学意义 图 6 不同浓度PE微塑料暴露下小新月菱形藻CHBrCl2、CHBr2Cl和CHBr3归一化释放速率的变化 Fig. 6 Changes in normalized release rate of CHBrCl2, CHBr2Cl, and CHBr3 by Nitzschia closterium f. minutissima under different PE microplastic concentrations |
VHCs的生物生成机制如前文所述, 光合作用产生的H2 O2和细胞氧化应激产生的H2 O2能在卤素过氧化物酶(HPO)催化下产生次卤酸, 在HPO催化下与DOM发生甲基化反应可以产生多取代卤代甲烷[40], 因此VHCs的产生与细胞内H2 O2浓度直接相关[38].本实验中, 3种VHCs的释放量均在培养第17 d后逐渐上升, CHBr2Cl和CHBr3的释放量随PE微塑料浓度升高而升高, 与ROS水平随微塑料浓度的变化一致[图 4(a)].且在第2 d后, 微塑料处理的实验组中CHBrCl2和CHBr2Cl的释放量开始高于对照组, 说明在PE微塑料的刺激下, 藻细胞发生氧化应激反应, 产生的H2 O2这类非自由基ROS在HPO催化下, 与卤化物进行反应, 促进微藻释放VHCs.
此外, 本实验中观察到7~17 d, 添加100 mg ·L-1微塑料实验组中3种VHCs的释放量受到抑制, 可能与细胞的生理状态不佳有关, 在此期间微藻生长受到抑制(图 1), 导致VHCs释放量低于对照组.这与Lang等[26]研究结果类似, 48~96 h内, 在添加100 mg ·L-1和200 mg ·L-1的PS微塑料处理下, 三角褐指藻细胞受到损害, 抑制了CHBrCl2、CHBr2Cl和CHBr3的产生和释放.
2.4.2 东海原甲藻不同微塑料浓度下东海原甲藻CHBrCl2、CHBr2Cl和CHBr3释放量的变化见图 7. 3种VHCs在培养1 d和2 d时释放量较大, 而之后释放量较为平稳.与小新月菱形藻类似, 培养1 d和2 d时, 10 mg ·L-1和50 mg ·L-1微塑料的添加抑制了东海原甲藻释放3种VHCs.在11 d后, 不同浓度微塑料的存在均促进了3种VHCs的释放.东海原甲藻在不同浓度PE微塑料中CHBrCl2、CHBr2Cl和CHBr3释放速率随培养时间的变化见图 8.与小新月菱形藻类似, CHBrCl2、CHBr2Cl和CHBr3释放速率随培养时间增加而下降.并且在第14 d后, 添加50 mg ·L-1和100 mg ·L-1的实验组中3种VHCs的单体释放速率大于对照组和低浓度实验组(P < 0.05).这与同时期50 mg ·L-1和100 mg ·L-1实验组ROS水平大于对照组和低浓度实验组的趋势一致[图 4(b)], 结合该时期50 mg ·L-1和100 mg ·L-1实验组Fv/Fm的抑制情况更严重[图 3(b)], 推测50mg ·L-1和100 mg ·L-1的高浓度微塑料通过抑制光合作用, 刺激东海原甲藻细胞发生氧化应激反应, 促进CHBrCl2、CHBr2Cl和CHBr3的释放.
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图 7 不同浓度PE微塑料暴露下东海原甲藻CHBrCl2、CHBr2Cl和CHBr3释放量的变化 Fig. 7 Changes in CHBrCl2, CHBr2Cl, and CHBr3 concentrations released by Prorocentrum donghaiense under different PE microplastic concentrations |
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不同小写字母表示不同浓度的释放速率差异有统计学意义 图 8 不同浓度PE微塑料暴露下东海原甲藻CHBrCl2、CHBr2Cl和CHBr3归一化释放速率的变化 Fig. 8 Changes in normalized release rate of CHBr2Cl, CHBrCl2, and CHBr3 by Prorocentrum donghaiense under different PE microplastic concentrations |
上述实验结果表明, 10 mg ·L-1和50 mg ·L-1微塑料的添加在培养第1 d和第2 d抑制东海原甲藻释放VHCs, 在11 d后3种浓度微塑料均能促进东海原甲藻释放3种VHCs, 这可能与光合作用受到抑制, 引起细胞内的氧化应激反应有关.对比两种藻的释放速率, 发现东海原甲藻3种VHCs的释放速率均高于小新月菱形藻, 表明不同藻类释放VHCs的速率有差别, 可能与藻细胞大小有关.有研究发现, 同种藻类对于不同种VHCs的释放也存在差异, 这可能与海水中VHCs的不同生成机制有关[6, 12].如CHBr2Cl可由热带微藻直接释放[29], 也可通过CHBr3氯代生成[12].东海原甲藻CHBrCl2和CHBr2Cl释放量变化趋势较为一致, 与CHBr3释放量趋势不同, 推测CHBr2Cl的生成机制可能与CHBrCl2相似, 而与CHBr3不同.
3 结论(1) PE微塑料对小新月菱形藻生长的抑制作用更明显, 对东海原甲藻生长主要表现出促进作用.
(2) 50 μm ·L-1的PE微塑料的添加对微藻起到遮光作用, 降低小新月菱形藻和东海原甲藻的Fv/Fm, 抑制其PSⅡ活性, 且对东海原甲藻的抑制作用更显著.
(3) PE微塑料能引起小新月菱形藻和东海原甲藻的氧化应激反应, 促进藻细胞产生ROS, 且100 mg ·L-1的高浓度微塑料的添加对于两种藻的氧化应激反应刺激更明显, 细胞内高ROS水平能促进微藻释放VHCs.
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