2023, Vol. 44
土壤重金属污染一直是环境治理的热点问题[1, 2].重金属在各种环境介质中的含量较低, 因此也被认为是微量元素[3].重金属污染已遍及世界许多地区, 尤其是中国等发展中国家[4].与世界其他地区重金属污染相比, 我国土壤重金属污染并不严重, 然而, 相较于某些重金属, 我国似乎正在以更快的速度增加[5].此外, 重金属污染是隐蔽的、持续的和不可逆的[6].中国是最大的砷矿开采国、生产国和使用国, 土壤砷污染较为严重[7].
抗生素存在于多种环境介质中[8, 9].抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes, ARGs)污染在近二十年逐渐走入大众视野.因此, ARGs被定义为一种新型的环境污染物[10].如今, ARGs已成为全球环境健康关注的焦点[11].有研究表明, 环境中耐抗生素细菌可能会对人类健康产生风险[12, 13].自1940年青霉素问世以来, 抗生素在人类疾病的治疗和预防中发挥了至关重要的作用[14].我国每年使用抗生素总量约16.2万t, 其中兽用抗生素占总量的52%, 主要用于治疗动物疾病和促进动物生长[15, 16].医用和兽用抗生素的滥用导致环境中ARGs的种类和数量不断增加, 而ARGs也普遍存在于现代环境介质和人体微生物中[17, 18].如今, 抗生素耐药性已成为大多数人面临的重大公共卫生问题[19]. Knapp等[20]的研究表明, 自1940年以来, 所测的各种ARGs明显增加, 尤其是四环素.
随着抗生素污染问题的进一步加剧, 有研究表明, 土壤重金属含量与ARGs存在一定的相关性, 并对ARGs丰度产生一定影响[21, 22].早于抗生素时代的微生物群落对抗生素极为敏感, 而它们的移动遗传元件(movable genetic elements, MGEs)含有很少的抗性基因[23].此外, 有研究表明, 环境中的耐药菌具有对抗生素产生耐药性的特征, 这可能通过水平基因转移赋予病原体耐药性[24, 25].因此, 分析环境中ARGs和可移动遗传元件的综合分布, 对了解现代抗生素耐药性的演化和传播具有重要意义.
目前国内外对抗性基因的研究主要集中在人为活动密切、海拔低的工业化地区, 对于高海拔地区土壤重金属和抗性基因之间的关系研究较少.因此, 本研究目的是了解青海湖周边地区土壤中重金属和ARGs的污染水平和分布, 分析环境因子和重金属与ARGs的关系.
1 材料与方法 1.1 研究区域概况青海湖位于青海省西北部的青海湖盆地内, 既是中国最大的内陆湖泊, 也是中国最大的咸水湖.青海湖具有高原大陆性气候, 光照充足, 日照强烈; 冬寒夏凉, 暖季短暂, 冷季漫长, 春季多大风和沙暴; 雨量偏少, 雨热同季, 干湿季分明.湖区东部和南部气温稍高, 年均温在0.3~1.1℃之间; 西部和北部稍低, 年均温在-0.8~0.6℃之间, 平均最高气温在6.7~8.7℃之间, 平均最低气温在-6.7~4.9℃之间, 极端最高气温为25℃和24.4℃, 极端最低气温为-31~-33.4℃.湖区全年降水量偏少.但东部和南部稍高于北部和西部, 东部全年降水量是412.8 mm, 南部是359.4 mm, 西北部370.3 mm, 西部是360.4 mm和324.5 mm.全年蒸发量达1 502 mm, 蒸发量远远超过降水量.湖区降水量季节变化大, 降水多集中在5~9月, 雨热同季.采样点环境因素如表 1所示.
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表 1 采样点位信息概述 Table 1 Overview of sampling site information |
1.2 重金属的测定
本研究分别测定了Pb、Cu、Zn、Cr、Cd、Hg和As这7种重金属在土壤中的含量与分布, 方法如下.
样品的制备：除去样品中的枝棒、叶片和石子等异物, 将釆集的样品进行风干、粗磨和细磨至过孔径0.15 mm(100目)筛.
微波消解：用干净的药匙取适量的土壤样品于比色管(50 mL), 加入新配王水10 mL(3∶1, HCl∶HNO3, 体积比), 摇匀使其充分接触, 放置12 h后加盖, 在100℃的水浴锅中进行消煮反应, 反应时间为2 h.待其冷却后, 用超纯水定容至50 mL, 混匀后过滤(0.45 mm).
电感耦合等离子体质谱法检测：过滤液用电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MS, Agilent 7500a, Agilent, Santa Clara, California)测量样品中重金属的浓度.校准曲线的范围(R=0.999 7)选自0.05~10 mg·L-1.所有化学分析均设置平行样品, 以确保实验的准确性.
1.3 抗性基因的测定本研究测定了氨基糖苷类(aminoglycoside)、β-内酰胺酶类(β-lactamase)、喹诺酮类氯霉素类(FCA)、重金属类(heavy metal)、遗传元件类(MGE)、大环内酯类林肯酰胺类链阳性菌素B抗性基因(MLSB)、其他类(other/efflux)、磺胺类(sulfonamide)、四环素类(tetracycline)、万古霉素类(vancomycin)共10类80种ARGs.其中, 共检测了3种MGE, intl1和intl2未检出, tnpA01基因仅在部分样品中检出.土壤抗性基因的测定由启因生物科技有限公司完成, 方法如下.
DNA提取：根据制造商的使用说明, 使用土壤基因组DNA快速提取试剂盒(TIANNAMP Soil DNA Kit)来进行土壤样品DNA的提取工作.由于样品中的DNA含量较低, 为了避免单一DNA样品提取过程产生偏差, 所以进行多次DNA制备.
实时荧光定量PCR：使用Step OnePlusTM实时荧光定量PCR(Thermo)对16S rRNA基因和ARGs进行定量分析, 每个土壤样品均设3组平行样.反应体系由5 μL的TB GreenTM Premix Ex TaqTM Ⅱ(Tli RNaseH Plus)(Takara, Code No. RR820A), 0.4 μL正向引物(优化的最终浓度为0.4 mmol·L-1), 0.4 μL反向引物(优化的最终浓度为0.4 mmol·L-1), 1 μL模板DNA、3 μL ddH2O组成. Real-time PCR的升温程序为：在95℃下初始变性30 s, 在95℃下变性5 s, 在退火温度下退火30 s, 一共进行40个循环, 最后在72℃延伸30 s.通过溶解曲线验证扩增特异性, 溶解曲线采集温度为60~98℃, 每次0.5℃读数一次.本研究制备了定量PCR的标准样品以进行阳性对照, 通过标准曲线来计算每个样品目的基因拷贝数.
ARGs丰度计算方法：ARGs丰度的表现形式分为绝对定量和相对定量两种.绝对定量是指单位样品中ARGs的基因拷贝数(对于土壤为每g), 计算方法见式(1)[26].相对定量是指单位菌体中ARGs所占的比例(无量纲), 计算方法见式(2)[26].
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从各地区的气象局网站获取降雨、气温等数据, 用于相关环境因素对微生物群落分布和ARGs相对丰度时空分布差异影响和探究.采用地理信息系统绘图软件(ArcGIS 10.6, ESRI, Redlands, California)绘制青海采样点空间分布.采用Excel 2019和SPSS 25.0对土壤重金属含量、理化性质、微生物相对丰度和抗性基因相对丰度数据进行处理, 采用相关性分析和冗余分析分析土壤微生物与环境因子间的关系及抗性基因与微生物种群丰度间的关系.
2 结果与分析 2.1 青海湖周边土壤样品中重金属含量分布15个土壤样品中Pb、Cu、Cr、Zn、Cd和Hg等重金属的含量及分布见表 2.土壤样品中ω(Zn) 最高, 范围为20~79 mg·kg-1, 平均值为(50.27± 19.88) mg·kg-1. ω(Hg) 最低, 范围为0.005~0.077 mg·kg-1, 平均值为(0.027±0.019) mg·kg-1.土壤中Pb和Cr含量相对较高, 这可能是由于Pb和Cr高积累因子导致的[27].在Ogiyama等[28]的研究中, 粪肥改良的耕地中Zn和Cu含量分别为72~170 mg·kg-1和18~109 mg·kg-1, 显著高于青海地区土壤重金属含量, 表明未受人为污染的土壤中重金属污染较低.
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表 2 采样点土壤样品中重金属含量1)/mg·kg-1 Table 2 Heavy metal content in soil samples at sampling sites/mg·kg-1 |
青海湖周边土壤样品中ω(As) 较高, 范围为7.11~33.2 mg·kg-1, 平均值为(16.34±7.59) mg·kg-1, 部分地区高于国家标准[国家一级标准为ω(As)≤15 mg·kg-1].杜昊霖等[29]在西藏的研究也发现, 土壤中的As含量为中国土壤背景值的4.73倍, 世界土壤背景值的8.82倍.根据表 2可知, As在不同采样点含量(mg·kg-1)：S3为33.2、S9为31.6、S11为15.1、S13为20.8、S14为19.6和S15为20.2.以上采样点土壤中的As含量均高于国家一级标准, 由此推测青海地区As污染较为严重.
2.2 重金属含量与海拔的关系根据采样点海拔的不同, 可将采样点分为3组(L：< 3 000 m、M：3 000~4 000 m和H：>4 000 m).分别对应采样点为L：S1~S4、M：S5~S8和H：S9~S15.计算各区域不同重金属的含量平均值(见表 3), 土壤重金属Hg在不同组间差异明显, 海拔较低的采样点重金属Hg含量较高, 海拔较高的采样点重金属Hg含量较低.本研究采用SPSS软件分析土壤重金属含量与海拔的相关性, 结果表明土壤中重金属Cu和Hg的含量与海拔高度呈显著负相关(P < 0.05, 如图 1), 而其他重金属含量与海拔高度无显著相关性.
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表 3 不同海拔区域重金属含量和标准差1) Table 3 Heavy metal content and standard deviation at different altitudes |
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图 1 海拔高度与重金属含量的相关性 Fig. 1 Correlation between altitude and heavy metal content |
根据采样点土壤类型的不同, 将土壤由含水率从高到低分为湖边(S15、S8)、草地(S1、S4、S5、S6、S7和S14)、土地(S9、S10、S11、S12和S13)和沙漠(S2)这4种土壤类型.除重金属Hg以外, 其余重金属含量均随土壤类型变化出现下降的趋势(如图 2).沙漠土壤中Hg含量明显高于其他土壤, 达到0.077 mg·kg-1, 其余重金属含量显著低于其他土壤类型.
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图 2 不同土壤类型重金属含量分布 Fig. 2 Distribution of heavy metal content by soil type |
青海省只有少数地方有重金属污染源, 由此推测青海地区重金属污染可能是由远距离迁移造成的.从采样点的地理位置来看(如图 3), 甘肃省和四川省附近采样点重金属含量较高, 如S1(154.94 mg·kg-1)、S6(145.264 mg·kg-1)、S4(153.553 mg·kg-1)、S8(173.602 mg·kg-1)、S3(141.057 mg·kg-1)和S14(143.791 mg·kg-1).重金属含量低的采样点远离四川省和甘肃省, 如S2(74.867 mg·kg-1)、S13(76.1 mg·kg-1)、S12(64.215 mg·kg-1)和S10(62.327 mg·kg-1).李志涛等[30]的研究表明, 四川省硫铁矿区周边土壤重金属ω(Cd)、ω(Hg)、ω(As)、ω(Pb)、ω(Cr)、ω(Cu)和ω(Zn)的平均值分别为: 1.55、0.261、12.2、46.2、115、74和113 mg·kg-1.陈文轩等[31]的研究同样测定了四川省农田土壤中不同种重金属的含量, ω(Cd)、ω(Hg)、ω(As)、ω(Pb)、ω(Cr)、ω(Cu)和ω(Zn)的平均值分别为0.268、0.108、9.65、32.28、60.87、30.89和107.58mg·kg-1, 甘肃省农田土重金属ω(Cd)、ω(Hg)、ω(As)、ω(Pb)、ω(Cr)、ω(Cu)和ω(Zn)的平均值分别为0.213、0.084、10.46、27.52、63.01、26.83和86.43mg·kg-1.本研究重金属As的含量与杜昊霖等[29]在西藏土壤中的研究结果接近, 表明青藏高原地区土壤中As的含量背景值较高.青海地区土壤重金属含量分布符合远距离迁移趋势, 即近距离高且远距离低.由此推断, 除土壤本身含有的重金属外, 青海地区土壤重金属来源还包括周边地区(如四川省和甘肃省等)的大气远距离迁移.
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柱状图表示采样点重金属含量，不同颜色表示不同重金属种类 图 3 采样点分布示意 Fig. 3 Sample site distribution plot |
土壤样品中发现的ARGs按抗性类型分类(如图 4), 丰度最高的是β-内酰胺酶(β-lactamase)抗性基因(相对丰度为0.150 5), 占总ARGs的47.54%.四环素(tetracycline)耐药基因占ARGs总丰度的16.93%, FCA约占14.56%, MLSB约占8.77%, 其他种类耐药基因占比较低.四环素耐药基因显著高于磺胺类耐药基因, 该结果与Hu等[32]的一致.对于磺胺类ARGs, 相对丰度的变化趋势为sulⅠ>sulⅡ; 对于四环素耐药基因的变化趋势为：tetW>tetG>tetL>tetR>tetX>tetQ, 该结果与Ji等[33]的相似.有研究表明, 磺胺类和四环素类抗性基因是牛粪中最常见的抗性基因.在美国, 牛粪中磺胺和四环素抗性基因的相对丰度分别约为10-6~10-5和10-3~10-2[34].
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图 4 不同种类ARGs的相对丰度 Fig. 4 Relative abundance of different types of ARGs |
各采样点ARGs种类数分别为37、28、20、26、20、20、28、39、23、28、25、35、23、35和25, S1、S8、S12和S14号采样点显著高于其他点位, S1、S8和S14号采样点重金属含量相对较高, 可能是导致这些点位ARGs种类较多的原因[35].维恩图显示了不同海拔[图 5(a)]和不同土壤类型[图 5(b)]样品中独特和共有的ARGs. 3组海拔区域共有的ARGs有38种, 低海拔、中海拔和高海拔地区分别观察到5、4和9种独特的ARGs.沙漠土壤中ARGs的多样性显著低于其他土壤类型, 土壤类型对ARGs多样性的影响显著大于海拔高度.
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(a)不同海拔区域ARGs的种类数量，(b)不同土壤类型ARGs的种类数量 图 5 不同海拔区域和土壤类型ARGs的数量 Fig. 5 Number of ARGs in different elevation zones |
ARGs相对丰度与海拔高度呈显著负相关, ARGs丰度差异随海拔升高逐渐减小.氨基糖苷类(aminoglycoside)抗性基因的相对丰度与海拔高度呈显著负相关[r=-0.762, P < 0.05, 图 6(a)].由组间分析可知, H组土壤样品中检测到的ARGs相对丰度数量最少(在80个目标ARGs中, 平均值为0.005 2±0.034, n=15).从图 6(b)可以看出, 抗性基因相对丰度与海拔显著相关. H组(0.005 2±0.034, n=7)和M组(0.011 1±0.008 0, n=4)中检测到的ARGs平均数量显著低于L组(0.058 8±0.105 9, n=4).这些结果表明海拔的变化会改变ARGs的相对丰度.
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(a)氨基糖苷类抗性基因与海拔高度的相关性，(b)抗性基因在不同海拔区域的含量 图 6 海拔高度与ARGs的相关性 Fig. 6 Correlation of altitude with ARGs |
青海省土壤重金属Cd和Hg含量与ARGs存在显著相关性.重金属Cd与四类(氨基糖苷类、β-内酰胺酶类、MLSB和四环素类) ARGs存在显著负相关(如表 4), 相关性系数(r)分别为-0.973、-0.685、-0.651和-0.658.
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表 4 重金属Cd含量与抗性基因相对丰度对数值相关性分析1) Table 4 Cadmium content of heavy metals and relative abundance of resistance genes are analyzed as a numerical correlation |
土壤中重金属Cd含量与抗性基因亚型blaSHV-02、blaTEM、cphA、ermK、tetW、acrA、cmlA1-01和mexA存在显著相关性(如表 5), 与金属抗性基因相关性不显著.除cphA抗性基因外, 重金属Cd含量与多种ARGs相对丰度对数值均为负相关性.由此推测, 土壤中Cd含量升高可能会抑制ARGs的产生, 具体影响效应需后续实验证明.
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表 5 重金属Cd含量与抗性基因亚型相对丰度对数值相关性分析 Table 5 Numerical correlation analysis of the relative abundance of cadmium content and resistance gene subtypes of heavy metals |
青海省土壤重金属Hg含量与抗生素抗性基因存在显著相关性(P < 0.05). 3类抗生素抗性基因(重金属类、MLSB和磺胺类)与土壤Hg含量呈正相关(如图 7), 相关系数(r)分别为0.638、0.602和0.867.由此表明, 土壤中Hg含量的变化会对ARGs丰度产生一定影响.
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图 7 土壤中重金属汞含量与ARGs的相关性分析 Fig. 7 Correlation analysis of heavy metal mercury content in soil with ARGs |
土壤中重金属Hg的含量与重金属抗性基因亚型存在显著相关性(如图 8), 尤其与抗汞基因相关(P < 0.05).土壤重金属Hg的含量与cadB、czcA、merA和merP这4种重金属抗性基因呈显著正相关, 相关系数r=0.881(P=0.004)、r=0.692 (P= 0.006)、r=0.816(P=0.007)和r=0.594 (P=0.02). czcA、merA和merP这3种ARGs相对丰度较高, 是重金属抗性基因的主要亚型.
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图 8 重金属汞含量与抗汞基因相对丰度相关性分析 Fig. 8 Correlation analysis of mercury content in heavy metals and relative abundance of anti-mercury resistance genes |
土壤中汞含量的增加促进了Hg离子外排的机制.土壤中重金属Hg的含量与其他外排基因呈显著正相关(如图 9), 相关系数r=0.708(P=0.022).这些基因的主要功能是产生一种排除对生物体造成损害的物质的流出机制.根据土壤中重金属抗性基因的含量分布, S2号样品中Hg含量最高, 所有重金属抗性基因的丰度均增加, 但czcA(重金属排泄基因)、merA[汞(Ⅱ)还原酶]和merP(抗汞结合蛋白)增加最为明显, 说明土壤中Hg含量的增加促进了Hg离子外排的机制.
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图 9 重金属汞含量与其他外排基因的相关性分析 Fig. 9 Correlation analysis of heavy metal mercury with the other/efflux genes |
土壤中除重金属Cd和Hg外, 其余重金属含量与ARGs也存在显著相关性.例如, 土壤中重金属Pb含量与cphA和floR存在显著相关性, 相关系数分别为r=0.708(P =0.033)和r=-0.960(P=0.013); 重金属Cu含量与cphA和floR存在显著相关性, 相关系数为r=0.784(P=0.012)和r=-0.987(P < 0.001); 重金属Cr含量与cphA和floR存在显著相关性, 相关系数为r=0.713(P=0.031)和r=-0.853(P=0.031); 重金属Zn含量与blaSFO存在显著相关性, 相关系数为r=-0.997(P=0.048); 重金属As含量与arsM存在显著相关性, 相关系数为r=-0.897(P=0.015).
2.5.3 降雨量对土壤ARGs相对丰度的影响年平均降雨量(MAP)与土壤中的ARGs存在显著相关性.采样点位MAP与氨基糖苷类抗性基因和β-内酰胺酶类抗性基因存在显著负相关, 相关系数为-0.932和-0.585 (如图 10).
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图 10 年平均降雨量与抗性基因的相关性分析 Fig. 10 Correlation analysis of annual mean temperature and resistance genes |
基因水平转移是ARGs在细菌间传播的主要方式.MGEs是可移动的遗传元件, 可以携带ARGs在细菌间传播, 但不同的MGEs携带不同种类的ARGs[36, 37].青海环境中极少数ARGs由MGEs携带, 表明这些ARGs在细菌间转移的可能性较低[38].为了研究ARGs和MGEs之间的关系, 本研究分析了ARGs与MGEs相对丰度之间的关系.韩柳等[35]的研究发现ARGs与MGEs相对丰度呈显著正相关(P < 0.05).Pearson相关分析表明ARGs的相对丰度与MGEs的相对丰度呈显著正相关, 结果表明MGEs的相对丰度升高有利于ARGs的总丰度升高(P < 0.05, 见图 11), 该结果与Zhang等[39]的一致.青海土壤样品中仅检测到tnpA01基因, 未检测到intl1和intl2, 由于intl1和intl2基因负责复制、剪裁、运输和整合抗性基因, 推测青海ARGs水平转移潜力较弱.
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图 11 MGEs与ARGs的相关性分析 Fig. 11 Correlation analysis of MGEs with ARGS |
在受人类影响的环境中, ARGs的种类和丰度远高于环境背景值.此外, MGEs的种类和丰度也高于没有人为影响的原始环境.由此推测人为活动不仅导致了环境中ARGs种类和相对丰度升高, 更加快了ARGs在多种生物体间的快速传播, 对此需严格控制抗生素类药品的滥用.
2.7 冗余分析本研究通过多变量冗余分析方法来研究主要环境因子对土壤中ARGs的影响.如图 12所示, 第一轴主要由年平均降雨量(MAP)来解释, 占ARGs总方差的30.98%, 第二轴由海拔高度和年平均温度(MAT)来解释, 占ARGs总方差的7.238%.本研究表明, ARGs在第一轴上载荷率较高, 表明该地区土壤样品中ARGs主要受到年平均降雨量的影响.
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1.年平均温度, 2.重金属, 3. mexF抗性基因, 4. mexE抗性基因, 5.年平均降雨量, 6.pH值, 7. merA抗性基因, 8.海拔高度, 9. aioA抗性基因, 10. merC抗性基因, 11. ermK抗性基因, 12. tetW抗性基因, 13. blateM抗性基因, 14. mexA抗性基因, 15. czcA抗性基因 图 12 RDA分析 Fig. 12 RDA analysis |
本研究对青海湖周边土壤中重金属和ARGs进行检测和痕量分析.共检测了7种重金属在土壤中的含量, 其中Zn含量最高, 汞含量最低.彭驰等[40]研究表明, 我国城市土壤重金属ω(Pb)、ω(Cd)、ω(Cu)和ω(Zn)的平均值为58.5、0.49、42.1和156.3 mg·kg-1, 青海湖周边土壤样品中这4种重金属分别为15.8、0.129 1、13.0和50.266 7 mg·kg-1.青海地区土壤重金属含量与其他城市差异较大, 表明青海地区人为活动影响较小.环青海湖土壤中重金属含量与海拔高度存在显著相关性, 该结果与张利瑞[41]等的相似.张利瑞等[41]对兰州市耕地土壤重金属进行研究, 分析不同环境因子对土壤重金属及其风险的影响.其结果表明, 采样季平均降雨量、GDP和海拔高度对耕地土壤重金属风险空间差异的影响最显著.
本研究共检测了80种ARGs, 与绵阳市的紫土丘陵区畜禽养殖土壤检出79种ARGs种类结果相似[42].通过皮尔森相关性分析发现, 土壤中重金属含量与ARGs的相对丰度呈显著相关性, 该结果与Ji等[33]的研究结果相符, 其对上海养殖场畜禽粪便和周围土壤ARGs研究表明, 重金属Cu与土壤微生物的多样性存在显著相关性, 从而影响土壤中ARGs的种类和丰度.除重金属外, 其余环境因子与ARGs相对丰度间也存在显著相关性, 例如海拔高度和年降雨量等.
4 结论(1) 青海湖土壤样品中重金属Cu和Hg的含量与海拔高度存在显著相关性, 其余重金属与海拔高度无著相关性.重金属含量在土壤类型分布上差异较为明显, 青海地区土壤重金属除了本身固有外, 可能主要来源是大气的长距离迁移.环青海湖土壤样品中重金属含量相对较低, 所形成的生态风险相对较低.
(2) 土壤样品中共检测出80种ARGs, 其中β-内酰胺酶类抗性基因丰度最高.土壤中抗性基因的相对丰度受多种环境因素的影响, 年均降雨量是土壤中ARGs相对丰度的主要影响因素.
(3) ARGs与MGEs存在显著正相关.由此表明, 抗生素的滥用不仅会加大环境中耐药基因的储存量, 还会增加耐药基因在生物链中的传播风险.
(4) 本文分析了环青海湖周边土壤样品重金属含量与ARGs的相对丰度, 并与其他地区进行比对, 表明青海地区土壤重金属及ARGs的污染相对较低, 所造成的健康风险相对较低.探究了重金属及环境因子与ARGs相对丰度的相关性, 探寻了土壤ARGs可能的影响因素, 对青海地区土壤ARGs污染做了系统的评估.
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