2022, Vol. 43
, JU Ze-jia , CHEN Hui , FU Yu , SONG Yuan-meng , ZHAO Bo , ZHANG Ji-yuan , LU Meng-qi , CUI Jian-sheng , ZHANG Lu-lu
自1928年盘尼西林发现以来, 抗生素已被广泛用于人类治疗用药、兽用药和动物生长促进剂[1~3].我国作为全球最大的抗生素生产和使用国, 据统计, 2013年我国抗生素使用量高达16.2万t[4], 而抗生素生产量高达24.8万t[5].然而, 生物体对抗生素的吸收率较低, 约40% ~90%抗生素将以原药或代谢产物的形式随粪便和尿液排出体外[6, 7], 经直排或污水处理厂废水排放进入环境中, 土壤因其具有较强的吸附能力成为抗生素的重要归宿[8, 9].例如, 我国农田土壤中喹诺酮类(quinolones, QNs)总量检出范围介于ND~1527 μg ·kg-1之间[10], 部分地区高达mg ·kg-1级, 且我国土壤中QNs的含量高于瑞士(环丙沙星含量为270.0~400.0 μg ·kg-1)[11]和澳大利亚(环丙沙星含量最高值为450.0 μg ·kg-1)[12]等.然而更值得关注的是, QNs在我国京津冀地区土壤中的污染最为严重[13], 因此, 需进一步加强京津冀地区土壤中QNs的相关研究.
QNs进入土壤环境后, 经一系列吸附、迁移转化和生物累积过程, 将诱导产生抗性基因[14~17], 并破坏土壤微生物群落的组成及其生态功能[18, 19].微生物群落作为土壤生态系统中的重要组成部分, 对土壤生态系统的稳定性和恢复力极其重要[20].目前, 抗生素对微生物群落的影响主要包括4个方面：①微生物群落多样性：如聚乙烯多磺酸粘多糖和环丙沙星的联合负载能够显著降低土壤中微生物群落多样性[21]; 且随着四环素含量的增加, 污泥中微生物群落活性细胞的多样性降低[22]; ②微生物群落丰度：如在低含量四环素和土霉素作用下, 土壤细菌和真菌数量显著降低[19]; 通过室内实验研究发现磺胺甲恶唑能作为碳源促进微生物的繁殖, 使微生物群落丰度上升[23]; ③微生物群落组成：如左旋氟沙星和土霉素能够在属水平上显著改变原核微生物群落结构[24]; 高含量抗生素选择压力显著降低了微生物多样性, 改变了微生物群落结构[25]; ④微生物群落功能：如氧氟沙星等抗生素能增加沉积物中微生物群落的反硝化功能基因的丰度[26]; 恩诺沙星单一处理(0~0.80 mmol ·kg-1)能降低微生物群落的活性[27].然而, 此前研究较少关注其它理化环境因子对微生物群落结构、功能和多样性的共同作用.土壤微生物群落与氮磷循环过程密切相关, 有研究表明[28, 29], 微生物群落结构和多样性与TP、NH4+-N、NO3--N和NO2--N具有显著相关性, 土壤粒径也会影响微生物群落分布.因此, 本研究拟通过建立抗生素污染土壤中TP、NH4+-N、NO3--N、NO2--N和土壤粒径等理化参数与微生物群落的相关性, 识别长期抗生素污染土壤中微生物群落结构组成、功能和多样性的主要环境影响因子.
石家庄市作为我国典型的制药城市, 生物医药企业占全省药企总数的80%以上, 包括华北制药、以岭药业、神威药业、石药和四药等多家制药企业.在2016年, 全市化学原料药占全国市场近45%, 而抗生素、半合成抗生素等产量均处于全国领先地位[30].此前相关研究表明石家庄市水环境中的抗生素含量较高[31], 而有关石家庄市土壤中抗生素污染特征及微生物群落的研究却仍未见报道.因此, 选择石家庄市为研究区, 分析石家庄市表层土壤中典型抗生素——喹诺酮类(QNs)抗生素含量及其空间分布特征, 并利用16S rRNA高通量测序技术, 探讨抗生素污染土壤中微生物群落结构组成、功能和多样性, 识别QNs污染土壤中微生物群落结构组成、功能和多样性的主要环境影响因子, 以期为石家庄市生态修复和抗生素污染管控提供科学的理论依据和数据支撑.
1 材料与方法 1.1 样品采集本研究根据石家庄市的土地利用类型及地形等因素, 共选取12个代表性采样点(见表 1).并根据东部、北部、南部和中部这4个方位将其分为4个区, 即S1区(MQ, MLC, ST)、S2区(XS, ZM, LJZ)、S3区(FT, SY, GY)和S4区(NQH, BWL, GYCG).在2020年9月进行土壤样品采集, 除去表层杂质(如石子和动植物残骸)后, 用铁铲采取(0~25 cm)表层土壤样品, 每个采样点取3个平行样品(最终以3个样品的均值作为样点检测值).每个样品分为3份, 一份用于测定QNs含量, 一份用于测定粒径和TP等理化指标, 另一份用于微生物群落组成和多样性分析.运送回实验室后将样品进行低温冷冻保存直至分析.各区取3个样点的均值作为该区指标值.
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表 1 石家庄市12个采样点的空间位置 Table 1 Spatial location of 12 sampling sites in Shijiazhuang City |
1.2 样品的前处理及理化指标的测定
用于测定QNs抗生素的样品经冷冻干燥后进行粉碎过筛, 称取2.0 g过筛后的土壤样品, 同时称取2.0 g硅藻土(用Na2EDTA处理后), 将硅藻土与样品1 ∶1混合均匀后装入(36 mL)萃取池, 以乙腈-磷酸盐缓冲液(pH=3)作为萃取液, 使用ASE 350快速溶剂萃取仪(Thermo, Germany)进行萃取.萃取后使用平行浓缩蒸发仪(Buchi, Switzerland)将萃取液浓缩至小于1 mL, 将浓缩后的溶液过0.45 μm滤膜并将其转移至锥形瓶中, 用超纯水稀释200倍制成试料.
用于理化指标测定的样品经解冻后, 进行自然风干并研磨过筛, 使用粒径分析仪LE400-05(USA)(以超纯水作为流动相)测定(过40目筛)土壤粒径.根据标准HJ 634-2012测定土壤样品中的NH4+-N、NO3--N和NO2--N含量, 根据标准HJ 632-2011测定土壤样品中的TP含量.
1.3 QNs的含量测定方法使用1 mol ·L-1H2SO4溶液将QNs测定所需试料调节为酸性(pH=3), 其中一份样品加入含14种目标QNs的混合标准溶液(含量为100 ng ·L-1), 用以测定加标回收率.依次用6 mL甲醇和6 mL超纯水将InertSep HLB固相萃取柱(500 mg, 6 mL)充分活化后进行固相萃取, 萃取后在负压下抽真空干燥30 min, 然后依次用6 mL(体积比为2%)氨水∶甲醇溶液及6 mL纯甲醇溶液进行洗脱, 洗脱液经氮吹至近干后, 用甲醇水溶液(甲醇∶水=1 ∶1, 体积比)定容至1 mL, 使用高效液相色谱-三重四极杆质谱联用仪(HPLC-MS/MS)测定样品中QNs的含量.实验所需标准品均购自Sigma-Aldrich(Steinheim, Germany), 所有试剂均属分析纯(纯度大于95%).
1.4 微生物群落分析方法将适量新鲜土壤样品(过40目筛)转移至50 mL聚乙烯离心管内(V土壤样品>30 mL), 送至上海美吉生物有限公司进行16S rRNA基因测序(Illumina MiSeq).使用A.E.Z.N.A.TM土壤DNA试剂盒提取样品中DNA, 用引物341F(5′-CCTACGGGN GGCWGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTW TCTAAT-3′)进行PCR扩增, 并用2%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物, 然后经切胶、回收、建立文库并使用Illumina MiSeq平台进行基因测序, 采用Trimmomatic软件对原始DNA序列质控, 用FLASH软件拼接得到优质序列[32].通过美吉生信云分析平台进行微生物群落α多样性分析、微生物群落组成分析和PICRUSt功能基因预测.
1.5 质量控制实验采用外标法进行定量.利用甲醇水溶液(甲醇∶水=1 ∶1, 体积比)通过逐级稀释将标准储备液(1.0 mg ·L-1)制备成含量依次为0.1、0.5、1.0、5.0、10.0和100.0 mg ·L-1的标准系列, 经超高效液相色谱-质谱联用仪(HPLC-MS/MS)分析测定后, 得到基于QNs质量含量与峰面积的标准曲线(相关系数大于或等于0.99).各QNs的加标回收率介于71.3% ~110.7%之间.
1.6 数据统计与分析利用IBM SPSS Statistics 25软件进行数据处理与统计, 并利用单因素方差分析和Pearson相关性分析以进行差异显著性检验和环境因子(QNs和理化参数)与微生物群落间相关性分析.使用ArcGis软件绘制QNs含量空间分布.通过美吉生信云分析平台进行OTU(operational taxonamic unit)聚类分析(序列相似度为97%)和微生物群落物种组成分析、α多样性分析和PICRUSt功能预测分析, 得到土壤中微生物群落组成、多样性指数和COG功能水平的基因丰度; 同时利用Kruskal-Wallis秩和检验进行微生物物种组间差异显著性检验.使用Origin 2018软件绘制土壤理化参数及微生物多样性指数的柱状分布图和功能基因丰度的条形图.利用Canoco 5软件进行PCA主成分分析.
2 结果与分析 2.1 QNs的空间分布特征及残留水平就检出率而言, 检出率较高的6种QNs分别为氧氟沙星(ofloxacin, OFL, 100%)、诺氟沙星(norfloxacin, NOR, 75.0%)、环丙沙星(ciprofloxacin, CIP, 91.7%)、恩诺沙星(enroxacin, ENR, 58.3%)、喹草酸(oxolinic acid, OXO, 75.0%)和氟甲喹(flumequine, FLU, 91.7%), 而其它几种QNs的检出率均小于或等于50.0%.其中OFL在S1、S2、S3和S4区的检出率均达到了100%; NOR在S3和S4区的检出率最高(均为100%), 而在S2区检出率最低(33.3%); CIP在S1、S2和S4区的检出率最高(均为100%), 而在S3区的检出率最低(66.7%); NOR和OXO均在S1和S3区的检出率最高(均为100%), 而在S2区检出率最低(33.3%); FLU在S2、S3和S4区的检出率最高(均为100%), 而在S3区检出率最低(66.7%).就检出含量而言, 其中ω(OFL)、ω(NOR)、ω(CIP)、ω(ENR)和ω(FLU)平均值分别为16.17、91.99、9.156、4.476和6.457 μg ·kg-1, 其它各QNs的含量见表 2.
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表 2 石家庄市土壤中QNs检出率及含量 Table 2 Detection rate and content of QNs in soil of Shijiazhuang City |
就主要QNs(检出率大于50%)的空间分布特征而言(图 1), ω(OFL)、ω(NOR)、ω(FLU)和ω(OXO)在S3区平均值最高(55.72、224.5、13.17和0.623 2 μg ·kg-1), 而在S2区最低(0.367 4、0.585 4、0.088 2和1.224 μg ·kg-1). ω(CIP)在S2区平均值最高(10.15 μg ·kg-1), 而在S3区最低(6.449 μg ·kg-1). ω(ENR)在S4区平均值最高(11.75 μg ·kg-1), 而在S2区最低(0.4215 μg ·kg-1).总而言之, ω(总QNs)在S3区平均值最大(313.5 μg ·kg-1), 而在S2区最低(12.63 μg ·kg-1), 各区ω(总QNs)平均值分别为：S3(313.5 μg ·kg-1)>S4(65.54 μg ·kg-1)>S1(46.19 μg ·kg-1)>S2(12.63 μg ·kg-1).整体而言, 石家庄各区域土壤中QNs含量差异显著(P<0.01), 整体呈现出中部含量高, 而北部、东部和南部含量低的趋势.
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图 1 石家庄市土壤中主要QNs的空间分布特征 Fig. 1 Spatial distribution of main QNs in soil of Shijiazhuang City |
就土壤(过40目筛)粒径范围而言[图 2(a)], 石家庄市土壤中粉粒(2~50 μm)的占比最高(66.7% ~93.2%), 而黏粒(小于2 μm)的占比最低(2.50% ~9.10%).就粒径空间分布特征而言, 黏粒和粉粒的占比在S3区最高(分别为6.40%和86.8%), 而在S4区占比最低(分别为2.67%和67.8%); 砂粒(大于50μm)在S4区占比最高(29.6%), 而在S3区占比最低(6.77%).整体而言, 各区之间的土壤粒径组成差异显著(P<0.05).
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(a)石家庄市土壤中粒径的空间分布; (b)石家庄市土壤中主要理化参数的空间分布 图 2 石家庄市土壤理化参数的空间分布特征 Fig. 2 Spatial distribution characteristics of soil physical and chemical parameters in Shijiazhuang City |
就土壤其它理化参数分布特征而言[图 2(b)], ω(TP)范围为348.9~1 062 mg ·kg-1, 其含量在S2区最高(739.5 mg ·kg-1), 而在S4区最低(505.5 mg ·kg-1). ω(NH4+-N)范围为2.489~39.55 mg ·kg-1, 其含量在S2区最高(17.43 mg ·kg-1), 而在S1区最低(7.666 mg ·kg-1). ω(NO3--N)和ω(NO2--N)均在S3区最高(40.82 mg ·kg-1和1.080 mg ·kg-1), 而在S2区最低(1.975 mg ·kg-1和0.074 mg ·kg-1), 其范围分别介于3.383~59.33 mg ·kg-1和0.011~1.398 mg ·kg-1之间.整体而言, TP和NH4+-N并无显著空间差异, 而NO3--N和NO2--N空间差异显著(P<0.05和P<0.01).
2.3 土壤中微生物群落结构组成与多样性的空间分异特征就微生物群落组成而言[图 3(a)和3(c)], 优势菌门及相对丰度分别为放线菌门(Actinobacteriota, 18.3% ~34.6%)、变形菌门(Proteobacteria, 13.6% ~34.1%)、绿弯曲菌门(Chloroflexi, 7.21% ~16.0%)、泉古菌门(Crenarchaeota, 2.28% ~ 23.1%)、酸杆菌门(Acidobacteriota, 3.45% ~ 13.9%)和厚壁菌门(Firmicutes, 2.03% ~15.2%).优势菌属及相对丰度分别为阿吉利斯节肢杆菌(Arthrobacter, 3.24% ~8.61%)、嗜油性硝基海绵体(Candidatus-Nitrocosmicus, 2.93% ~9.46%)、亚硝基草科古菌(Nitrososphaeraceae, 1.93% ~7.19%)、深海芽孢杆菌(Bacillus, 2.26% ~4.89%)和鞘翅目(Sphingomonas, 2.03% ~4.98%), 其中放线菌门和变形菌门为主要优势菌门, Arthrobacter和Nitrososphaeraceae为主要优势菌属.放线菌门在S1区丰度最高(30.1%), 而在S4区丰度最低(21.1%); 变形菌门在S4区丰度最高(24.0%), 而在S3区丰度最低(18.6%). Arthrobacter在S2区最高, 而在S1区丰度最低(3.24%); Candidatus_Nitrocosmicus在S3区丰度最高(2.93%), 而在S2区最低(9.46%).Venn图分析及Kruskal-Wallis秩和显著性检验结果表明, 门水平微生物群落并无显著空间差异, 而属水平空间差异显著(P<0.05).
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(a)门水平微生物群落组成及相对丰度; (b)土壤中门水平物种组成Venn图; (c)属水平微生物群落组成及相对丰度; (d)属水平物种组成Venn图 图 3 石家庄市土壤中微生物群落结构组成 Fig. 3 Microbial community structure composition in soil of Shijiazhuang City |
就微生物多样性而言, 本研究进行了α多样性分析和OTU聚类分析, 得到4个区域的4种多样性指数(Chao 1、Coverage、Shannon和Simpsoneven)和OTU数量(图 4).其中Coverage指数值大于0.98, 表明此次测序结果可以较好代表样品中微生物的真实情况.Chao 1指数均值为3 332, 其值在S2区最大(3 456), 而在S4区最小(3 182).Shannon指数均值为6.20, 大小顺序依次为：S2(6.48)>S1(6.22)>S4(6.18)>S3(5.89).Simpsoneven指数均值为0.044, 其值在S2区最大(0.072), 而在S3区最小(0.022).OTU数量均值为2 589, 其值在S2区最高(2 713), 而在S3区最低(2 485).总而言之, 石家庄市土壤中多样性指数(Shannon和Simpsoneven)空间差异显著(P<0.05), 而OTU数量并无显著空间差异.
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图 4 石家庄市土壤中OTU数量和多样性指数空间分布 Fig. 4 Spatial distribution of diversity index and OTU quantity in soil of Shijiazhuang City |
经PICRUSt功能预测分析得到COG功能水平的10种功能基因的相对丰度(图 5), 其中丰度最高的分类为通用功能预测类基因(19.9% ~20.3%), 其次是能源生产与转换类(17.6% ~18.6%)、信号转导机制类(12.0% ~15.5%)、翻译、核糖体结构与生物发生类(12.7% ~14.4%)和复制、重组与修复类(12.7% ~13.0%)功能基因.其中, 能源生产与转换类功能基因在S3区丰度最高(18.6%), 而在S4区丰度最低(17.6%); 信号转导机制类功能基因在S4区丰度最高(15.5%), 而在S3区丰度最低(12.0%); 翻译、核糖体结构与生物发生类功能基因在S3区丰度最高(14.4%), 而在S1区丰度最低(12.7%); 复制、重组与修复类功能基因在S1区丰度最高(13.0%), 而在S4区丰度最低(12.7%).且单因素方差分析结果表明, 各区的功能基因丰度并无显著空间差异.
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图 5 石家庄市土壤中微生物群落的COG功能基因相对丰度 Fig. 5 Relative abundance of main COG functional genes in soil microbial communities in Shijiazhuang City |
为研究QNs及主要理化参数对微生物群落多样性及功能的影响, 将主要QNs和理化参数进行VIF方差膨胀系数筛选后进行PCA主成分分析(图 6).结果表明, QNs和土壤理化参数与微生物群落多样性指数及功能基因存在显著相关性.图 6中的百分比分别为轴1和轴2的解释变量.就QNs和土壤理化参数与微生物群落多样性相关性而言, 其中OXO与Shannon和OTU呈显著负相关(P<0.01, r=-0.980和r=-0.987), 与Simpsoneven呈极显著负相关(P<0.01, r=-0.999); NO3--N与Simpsoneven指数呈显著负相关(P<0.05, r=-0.958); Coverage指数与黏粒和粉粒呈极显著负相关(P<0.01, r=-0.992和r=-0.998), 而与砂粒呈显著正相关(P<0.05, r=-0.998).就QNs和理化参数与微生物群落功能基因相关性而言, 其中染色质结构与动力学类和翻译、核糖体结构与生物发生类功能基因与CIP呈显著负相关(P<0.05, r=-0.954和r=-0.983), 与NO2--N呈显著正相关(P<0.01, r=0.995和P<0.05, r=0.971); 信号转导机制类功能基因与NO2--N呈显著负相关(P<0.05, r=-0.957); 能源生产和转换类和核苷酸转运与代谢类功能基因与FLU呈极显著正相关(P<0.01, r=0.997); NH4+-N与辅酶转运与代谢类和复制、重组和修复类功能基因呈显著负相关(P<0.05, r=0.963和r=0.983); 黏粒与细胞运动类和细胞内运输、分泌与囊泡转运类功能基因呈显著负相关(P<0.05, r=-0.964和r=-0.979).
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(a)QNs与微生物多样性指数相关性, (b)理化参数与微生物多样性指数相关性, (c)QNs与功能基因丰度相关性, (d)土壤理化参数与功能基因丰度相关性; 红色箭头表示多样性指数、OTU和功能基因, 蓝色箭头表示QNs和土壤理化参数等环境因子, 两箭头夹角为锐角则表示存在正相关性, 夹角为钝角则表示存在负相关性; (c)和(d)中B表示染色质结构与动力学类功能基因, C表示能源生产与转换类功能基因, F表示核苷酸转运与代谢类功能基因, H表示辅酶转运与代谢类功能基因, J表示翻译、核糖体结构与生物发生类功能基因, L表示复制、重组与修复类功能基因, N表示细胞运动类功能基因, R表示仅通用功能预测类基因, T表示信号转导机制类功能基因, U表示细胞内运输、分泌与囊泡转运类功能基因 图 6 石家庄市土壤中QNs及理化参数与微生物多样性指数及功能基因之间PCA主成分分析 Fig. 6 Principal component analysis (PCA) among QNs, physicochemical parameters, microbial diversity index, and functional genes in soil of Shijiazhuang City |
为建立QNs含量和主要理化参数等环境因子与土壤微生物群落组成的相关性, 将进行VIF方差膨胀系数筛选后的环境因子与微生物群落进行Pearson相关性分析(图 7).结果表明, QNs、TP和土壤粒径与土壤中门水平微生物群落具有显著相关性.其中CIP与髌骨细菌门(Patescibacteria)和厚壁菌门呈显著正相关(P<0.05, r=0.601和r=0.580), 而与疣微菌门(Verrucomicrobiota)呈显著负相关(P<0.05, r=-0.653); TP与变形菌门和类杆菌门(Bacteroidota)呈显著正相关(P<0.05, r=0.582和r=0.608); 砂粒与芽单胞菌门(Gemmatimonadota)呈显著负相关(P<0.05, r=-0.601), 而粉粒与其呈显著正相关(P<0.05, r=0.612).此外, QNs、TP、NH4+-N、NO3--N、NO2--N和土壤粒径均与属水平微生物群落存在广泛相关性, 如OXO、FLU、NO3--N和NO2--N均与Roseiflexaceae呈显著负相关(P<0.05, r=-0.645, r=-0.831, r=-0.762和r=-0.654), 详见图 7(b).
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(a)环境因子与门水平微生物群落相关性, (b)环境因子与属水平微生物群落相关性; 横坐标表示QNs和理化参数等环境因子, 纵坐标表示微生物群落的物种组成; *表示P<0.05, **表示P<0.01, ***表示P<0.001 图 7 石家庄市土壤中QNs和主要理化参数与微生物群落组成相关性分析 Fig. 7 Correlation analysis between QNs, main physicochemical parameters, and microbial community composition in soil of Shijiazhuang City |
就具体的QNs而言, 石家庄市土壤中以ω(NOR)最高(平均值为91.99 μg ·kg-1), 其次为ENR和CIP, 这与已有的研究结果一致[10], 可能与NOR在土壤中较高的吸附性和累积能力有关[33, 34].此外, Ghirardini等[35]的研究表明, ENR是生粪肥和处理粪肥中含量最高的QNs, 而本研究中ω(ENR)较低(平均值为4.476 μg ·kg-1), 说明石家庄市农业生产活动中粪肥的施用较少.此外, S3区的ω(QNs)平均值大于300.0 μg ·kg-1, 且石家庄市的制药企业集中分布于S3区域, 说明QNs的含量分布可能与制药企业有关.
整体而言, 石家庄市中部地区的ω(总QNs)最高(平均值为313.5 μg ·kg-1), 含量水平高于同处华北地区的北京和天津等城市[36~40], 同时也高于华东、华南及西南等地城市[10, 41~47](见表 3), 如南京某设施菜地ω(总QNs)平均值为169.3 μg ·kg-1[42], 上海某菜田土壤中ω(总QNs)平均值为62.50 μg ·kg-1[41], 广东惠州蔬菜基地土壤中ω(总QNs)平均值为50.06 μg ·kg-1[46], 而西南地区城市土壤中QNs总含量更低, 如昆明某菜地土壤中ω(总QNs)平均值仅为15.20 μg ·kg-1[10].QNs在我国土壤中的空间差异可能与当地抗生素的使用量有关, 如2013年我国华北(6 700 t)和华东(7 290 t)地区的QNs使用量远高于华南地区(1 970 t)和西南地区(3 850 t)[48], 而石家庄市作为华北地区典型制药城市, 造成抗生素等抗菌类药物的大量生产及使用, 引起部分区域的抗生素含量显著高于其它地区.
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表 3 我国不同地区土壤中QNs的含量 Table 3 Detection content of QNs in soil from different regions of China |
3.2 土壤中微生物群落组成和多样性特征及其主要影响因素
本研究土壤中最优势菌门为放线菌门和变形菌门.在不同地区土壤中最优势菌门并无显著差异[49~52].如湖北、上海、浙江、四川施用有机肥的土壤中及欧亚大草原(放牧、未放牧)和北方农牧交错带的土壤中的最优势菌门均为放线菌门和变形菌门[53~55], 与本研究的结果一致.然而不同地区的优势菌属具有显著空间差异, 且本研究中微生物群落多样性指数(Shannon和Simpsoneven)呈显著空间分布差异, 可能与土地利用类型及土壤理化性质有关[56~61].此外, 地理位置及气候条件的不同也会导致微生物群落组成的差异[32, 62].
就具体影响因素而言, 本研究结果表明, 土壤中微生物群落结构组成和多样性受QNs、TP、NO3--N和土壤粒径等理化参数的共同影响.就QNs对微生物群落多样性和结构组成的影响而言, 本研究中的QNs对微生物群落多样性具有抑制作用[63], 与多数室内培养研究结果一致, 如：单独施用CIP(1~10 mg ·kg-1)能降低微生物群落多样性[64]; 且NOR(1~10 mg ·kg-1)在第7 d开始对微生物群落多样性具有明显的抑制作用[65].此外, 本研究中ENR含量虽低, 但随着其含量升高, Chao 1指数逐渐降低, 说明低含量QNs也可能降低微生物群落的丰度[66].同时, QNs能显著影响土壤中微生物群落结构组成[63], 可能与不同菌群对不同含量QNs的响应差异有关.此外, 本研究结果表明, NO3--N和土壤粒径会显著影响微生物群落的多样性指数, 同时TP、NH4+-N、NO3--N、NO2--N和土壤粒径均会对微生物群落结构组成产生影响, 如：粉粒对芽单胞菌门表现为促进作用, 而砂粒对其表现为抑制作用, 说明粒径越小越有利于部分微生物群落的生长繁殖.
3.3 土壤中微生物群落的功能基因分布特征及其主要影响因素整体而言, 石家庄市土壤中各类功能基因并无显著空间分布差异.其中染色质结构与动力学类、能源生产与转换类、核苷酸转运与代谢类和翻译、核糖体结构与生物发生类功能基因与QNs存在广泛相关性, 说明QNs会影响土壤中微生物群落的相关遗传及代谢功能[67].此外, 信号转导机制类功能基因对于微生物群落应对外界环境条件变化至关重要[68], 而该类功能基因在S3区丰度最低, 同时QNs含量在S3区最高, 说明QNs可能作为一种信号分子干扰微生物群落的信号转导功能[67], 从而影响其应对外界条件变化的能力.就土壤理化参数对微生物群落功能影响而言, 其中NO2--N与染色质结构与动力学类功能基因和翻译、核糖体结构与生物发生类功能基因呈显著正相关, 而与信号转导机制类功能基因呈显著负相关, 说明NO2--N可能对微生物群落的遗传功能具有促进作用, 而对其信号转导功能具有抑制作用.此外, 复制、重组与修复类功能基因作为微生物群落抵抗抗生素等抗菌剂的影响的重要基因分类[68], 本研究结果表明该类功能基因与NH4+-N存在负相关关系, 而S2区较高的NH4+-N含量可能导致该区微生物群落抵抗抗生素等外界干扰能力的降低.此外, 土壤粒径与微生物群落功能基因存在显著相关性, 说明粒径的差异也会对微生物群落的功能产生影响.总而言之, 微生物群落的功能受QNs和土壤理化参数的共同影响.
4 结论(1) 就空间分布而言, QNs整体呈中部含量高, 而其余区域含量低的特征.整体而言, 石家庄市土壤中以OFL检出率最高, 而NOR检出含量最高.
(2) 石家庄市土壤粒径以粉粒占比最高, 而黏粒占比最低.就理化参数空间分布特征而言, NO3--N、NO2--N和土壤粒径空间差异显著.
(3) 土壤中微生物群落的主要优势菌门为放线菌门和变形菌门, 主要优势菌属为Arthrobacter和Nitrososphaeraceae.不同地区属水平微生物群落组成差异显著, 且多样性存在显著空间差异.
(4) 石家庄市土壤中微生物群落结构组成、多样性和功能受QNs和土壤理化参数的共同影响.其中QNs、TP、NH4+-N、NO3--N、NO2--N和土壤粒径均会对微生物群落组成产生影响, OXO、NO3--N和土壤粒径是微生物群落多样性的主要影响因子, 而FLU、NO2--N、NH4+-N和土壤粒径是微生物群落功能基因的主要影响因子.
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