抗生素抗性基因（antibiotic resistance genes, ARGs）是在生物体内表达耐药性的基因片段, 其广泛存在于水体、沉积物和土壤中^[1]. 在我国不同的流域内都检测其存在^{[2 ~ 4]}. 土壤含有丰富的微生物多样性被认为是重要的ARGs库, 是ARGs转移和传播的理想场所^[5]. 一方面, ARGs可通过微生物增殖的方式进行垂直转移（vertical gene transfer, VGT）, 另一方面也可通过可移动遗传原件（mobile genetic elements, MGEs）在不同微生物群落之间进行水平转移（horizontal gene transfer, HGT）^[6]进而重塑ARGs的结构^[7]. 携带有ARGs的耐药菌可通过食物链传播到人类, 严重威胁人类健康^[8]. 因此, 明确MGEs与ARGs在土壤中的赋存特性, 显得尤为重要.

河岸带是水域向陆域过渡的水陆交错生态系统, 承担着河流与陆地之间的物质、能量与信息传输的功能^[9]. 作为水陆交汇的中介, 河岸带极易成为ARGs污染的扩散带, 从而威胁整个流域生态安全. 土壤生态系统作为河岸带中最活跃的部分, 对外界干扰如农业、工业和旅游等有不同的敏感响应^{[10 ~ 12]}. 虽ARGs在土壤中的赋存已有大量的研究, 但河岸带的土壤类型与ARGs的关联却鲜见报道.

黄河流域是我国北方重要的生态安全屏障. 黄河兰州段作为重要的水源涵养区和补给区, 担负着黄河上游的生态修复和污染防治的重任. 本研究以黄河兰州段为研究区域, 分析河岸带典型土壤类型中细菌群落与ARGs的分布特征, 探明不同类型河岸带土壤性质、微生物和MGEs对ARGs赋存的影响, 旨在为黄河流域水生态文明建设提供理论依据.

黄河兰州段位于兰州盆地（N36°04′, E103°40′）, 全长152 km, 东西走向, 由西固区流入经兰州城区流经榆中县北部至乌金峡出境. 本研究的样品采集区域位于黄河上游兰州段, 2021年7月（夏季）采集了7个土壤样本, 采样点包括河岸带内农田（a、b、d）、工业园区（c）和黄河两侧周山土壤（e、f、g）. 样品采集区域及采样点信息见图 1. 土壤采用五点取样法, 采集3~4个混合土样, 取样深度为0~20 cm, 每个混合样品约1 kg, “四分法”弃去多余土壤后用聚乙烯袋封装. 所采样品运回实验室进行预处理.

图 1

Fig. 1

图 1 采样点分布示意 Fig. 1 Location of sampling sites

将采集到的土壤样品一式两份, 一份自然风干后除去杂质研磨, 过60目筛, 用棕色密封玻璃瓶避光保存. 取40 g研磨土样加入200 mL氯化钾浸提液（1 mol·L^-1）. 在25℃恒温水浴下振荡1 h, 经3 000 r·min^-1离心10 min, 后取上清液50 mL, 置于4℃冰箱中保存, 用于氮磷含量分析. 另一份新鲜样品直接置于-20℃冰箱中冷冻保存, 用于DNA相关分析.

按照《土壤环境监测技术规范》（HJ/T 166-2004）的国家标准方法测定理化性质（表 1）. 将10 g研磨土样与25 mL去离子水混匀, 磁力搅拌10 min后采用电极法测定其pH值（雷磁, PHS-3C, 上海）和电导率（雷磁, DDS-307, 上海）. 随后将上述混合液稀释10倍后, 用0.45 µm薄滤膜抽滤, 用碳氮分析仪（耶拿MULTI N/C, 2100, 德国）测定溶解性有机碳.硝酸盐氮采用紫外分光光度法（HJ/T 346-2007）^[13], 总磷采用钼酸铵分光光度法（GB 11893-89）^[14]测定. 采用重量法和灼烧减量法测定样品含水率与有机质（HJ761-2015）^[15]. 具体理化测试参照黄魁等^[16]的方法进行.

表 1 (Table 1)

表 1 土壤理化性质 Table 1 Physicochemical properties of the collected soil 采样点 电导率/μS·cm-1 pH ω(有机质)/% ω(硝态氮)/mg·g-1 ω(总磷)/mg·g-1 ω(溶解性有机碳)/mg·g-1 含水率/% a 616 7.81 8.04 0.12 0.47 10.89 18.21 b 89 7.70 12.41 0.01 0.98 12.64 13.95 c 3 310 8.65 9.45 0.16 0.42 4.47 11.77 d 113 8.52 10.11 0.02 0.96 5.21 18.39 e 150 8.40 11.66 0.02 0.63 10.22 13.99 f 103 8.39 14.50 0.04 0.58 19.63 15.73 g 94 8.37 10.52 0.02 0.47 12.45 13.58

表 1 土壤理化性质 Table 1 Physicochemical properties of the collected soil

采用荧光定量PCR仪（Takara, TP700, 日本）对细菌16S rDNA（V3~V4区）、大环内酯类ARGs（ermB、ermF、ermA）、磺胺类ARGs（sul1、sul2）、四环素类ARGs（tetM、tetX）以及MGEs整合酶基因（intI1）和转座酶基因（tnpA-04）进行定量. 引物序列及PCR扩增条件参照文献[17]的方法进行. 所用引物均购置于生工生物工程（上海）股份有限公司. 25 μL的定量PCR反应体系为：TB Green Ⅱ（Takara, 日本）12.5 μL, 20 μmoL上下游引物各0.5 μL, DNA模板1 μL, DNA-free超纯水10.5 μL. 扩增效率控制在90%~110%之间. 然后通过Ct值（扩增循环次数）和标准曲线对样品中DNA的起始浓度进行定量检测. 其中绘制标准曲线的标准品为携带目的基因的质粒（Takara, pMD20-T, 大连）, 详细制备过程见文献[18].

PCR扩增使用Phusion^® High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer（New England Biolabs）的高效高保真酶进行, 反应条件为：98℃预变性30 s；30个循环包括98℃变性15 s, 58℃退火15 s, 72℃延伸15 s；72℃终延伸1 min. 之后将所得扩增产物用2%浓度琼脂糖凝胶进行电泳检测, 并利用Thermo Scientific公司的GeneJET胶回收试剂盒进行纯化. 使用Illumina公司TruSeq DNA PCR-Free Library Preparation Kit建库试剂盒进行文库构建, 通过Qubit定量和文库检测之后在NovaSeq 6000平台进行上机测序（诺禾致源生物信息科技有限公司, 北京）. 所得到的序列用FLASH（v1.2.7）进行拼接, 之后采用QIIME（v2）进行质控过滤. Tags序列通过（https://github.com/torognes/vsearch/）与物种注释数据库进行比对检测并筛去嵌合体序列, 得到有效Clean reads. 使用Uparse（v7.0.1001）对序列进行聚类, 随后通过MUSCLE 3.8.31与Silva 138数据库（http://www.arb-silva.de/）比对分类, 最终得到有效的测序数据.测序结果已上传至NCBI, 序列号为SAMN35720336.

使用SPSS 26统计软件进行相关性分析, 显著性水平P < 0.05.使用MEGA 7.0软件对DNA测序数据进行聚类, 并用HemI 1.0软件绘制热图. 使用Origin 2021绘图. 用RStudio对3种类型土壤做PCoA分析. 采用Spearman相关性检验分析2种MGEs（intI1、tnpA-04）与ARGs的相关性. 采用CANOCO 5.0软件对环境因素、微生物和ARGs之间的关系进行冗余分析.

本研究用α多样性中的Chao1、Shannon与Simpson指数分别表征细菌群落的丰富度和均匀度^[19]. 由表 2可知, 农田类型土壤细菌的平均Chao1指数与Shannon指数分别是工业类型的1.96倍和1.17倍；周山类型土壤细菌的平均Chao1指数与Shannon指数分别是工业类型的1.73倍和1.10倍.

表 2 (Table 2)

表 2 细菌α多样性指数的变化 Table 2 Change in α diversity indexes of bacterial community 采样点 Chao1指数 Shannon指数 Simpson指数 a 2 033.67 10.21 0.998 b 2 101.16 10.26 0.999 c 1 007.00 8.81 0.990 d 2 183.79 10.40 0.999 e 2 093.85 10.11 0.998 f 1 885.47 9.78 0.996 g 1 621.14 9.25 0.994

表 2 细菌α多样性指数的变化 Table 2 Change in α diversity indexes of bacterial community

上述结果显示工业类型土壤中细菌丰富度和均匀度低于其他类型的土壤, 这可能是由于c采样点是废弃工业园区, 其有害污染物的排放降低了土壤环境中细菌群落的多样性. 邢志林等^[20]同样研究发现工业土壤中微生物丰富度和多样性较其他土壤类型低. 农田类土壤较高的细菌多样性归结于禽畜粪肥等有机肥的施用给土壤带来了大量的有机质与肠道微生物, 增加了其细菌的多样性^[21]. 此外, 不同土壤下垫面类型的植被特征区别造成的根系分泌物差异会显著改变细菌群落结构^{[21 ~ 23]}. 这也是导致不同土壤类型细菌多样性差异的原因. 整体而言, 黄河兰州河岸带土壤细菌的α多样性指数从高到低依次为：农田 > 周山 > 工业.

由图 2可知, 黄河河岸带土壤中变形菌门（Proteobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidota）、放线菌门（Actinobacteriota）为采样点的主要菌门. 与黄河上游三江源土壤的研究结果相比, 变形菌门和放线菌门是相同的优势菌门；而其土壤的优势菌门疣微菌门（Verrucomicrobiota）在兰州段土壤中并没有表现出优势性^[24]. 变形菌门（Proteobacteria）平均相对丰度占比为30.02%, 是所检测样品中最占优势的门类. 与其他土壤相比, 农田土壤中厚壁菌门（Firmicutes）的丰度显著较高（P < 0.05）. 可能与农田中大量的粪肥施用显著增加厚壁菌门的丰度有关^[25]. 土壤中盐杆菌门（Halobacterota）的相对丰度为17.07%, 显著高出其它采样点. 是由于c采样点中高含盐量和高渗透压的土壤环境适宜盐杆菌门类微生物生存. 而酸杆菌门（Acidobacteriota）在工业土壤的相对丰度为0.77%, 较其它类型土壤低. 研究表明, 酸杆菌门宜生存在偏酸性的土壤^[26], 但c采样点的土壤偏碱性致使酸杆菌门丰度较低. 周山土壤中放线菌门的平均相对丰度分别是农田类与工业类的2.23倍和3.35倍. 放线菌门作为腐生菌是植物残体分解者与土壤生态系统固碳的主要驱动者^[27]. 周山放线菌门含量较高可能与丰富的植被残体有关. 而周山土壤类型的溶解性有机碳分布是农田与工业土壤的1.47倍和3.15倍, 这也需要较多的放线菌门来参与降解. 值得注意的是g采样点蓝藻门（Cyanobacteria）的相对丰度比其他采样点显著高出16.48 ~ 63.02倍（P < 0.01）. 但具体原因有待于进一步研究.

图 2

Fig. 2

图 2 土壤中细菌群落在门水平上的相对丰度 Fig. 2 Relative abundance of bacterial communities in soil at the phylum level

如图 3所示, 黄河河岸带土壤细菌属水平上, a、b和d采样点聚为一类, g、e和f采样点是一类, 而c采样点为单独一类. 聚类结果表明, 微生物种属多样性与河岸带土壤类型密切相关. 分别为：农田土壤中Bacillus（3.73%）和Sphingomonas（3.86%）菌属相对丰度较高. 工业土壤中则以Pseudomonas（8.36%）、Halomonas（3.03%）与Halorubrum（2.83%）为主. 而周山土壤中Chloroplast（8.87%）、RB41（5.21%）、Sphingomonas（4.87%）和Adhaeribacter（2.85%）为主要菌属. 可见, 黄河兰州段河岸带土壤属水平细菌群落结构因土壤类型而异.

图 3

Fig. 3

1.RB41, 2.Skermanella, 3.Sphingomonas, 4.Vicinamibacteraceae, 5.Tychonema, 6.Candidantus Udaeobacter, 7.Chthoniobacter, 8.Rubrobacter, 9.Adhaeribacter, 10.Chloroplate, 11.Microcoleus, 12.Nitorcosmicus, 13.Microvirga, 14.Pseudarthrobacter, 15.Flavisolibacter, 16.Halolanina, 17.Natronomonas, 18.Halomicrobium, 19.Halorubrum, 20.Gallibacterium, 21.Pseudomonas, 22.Marinobacter, 23.Idiomarina, 24.Halomonas, 25.Rhodoferax, 26.Planococus, 27.Nitrososphaeraceae, 28.Nitorspira, 29.Bacillus, 30.Flavobacterium 图 3 黄河兰州段河岸带土壤属水平下的聚类分析热图 Fig. 3 Cluster analysis of the riparian soil bacterial genes in the Lanzhou section of the Yellow River

intI1和tnpA-04是ARGs在HGT转移过程中的载体, 可揭示ARGs在HGT中转移频率^[28]. 如图 4可知, intI1和tnpA-04在黄河兰州段河岸带土壤中的绝对丰度范围分别为8.40 × 10⁹ ~ 8.53 × 10¹⁰copies·g^-1和6.82 × 10⁶ ~ 3.51 × 10⁸copies·g^-1. intI1平均绝对丰度为tnpA-04的525倍. 表明intI1是黄河兰州段河岸带土壤中的主导MGEs. Yu等^[29]研究发现, 在黄河兰州段与河岸带土壤存在物质交换的水体中同样发现intI1是主导的MGEs. 周山土壤中的intI1绝对丰度最高, 其可能是在周山的游客的肠道细菌携带较多的intI1. 这表明, 黄河流域兰州段河岸带土壤中intI1是影响ARGs转移的重要因素之一.

图 4

Fig. 4

图 4 黄河兰州段河岸带土壤中ARG和MGEs的绝对丰度 Fig. 4 Absolute abundance of ARGs and MGEs in the riparian soil of the Lanzhou section of the Yellow River

如图 4所示, 黄河兰州段土壤中大环内酯类ARGs、四环素类ARGs和磺胺类ARGs的平均绝对丰度分别为1.92 × 10⁸~ 8.21 × 10⁸、3.01 × 10⁸~ 1.79 × 10⁹和5.85 × 10¹⁰~ 5.10 × 10¹²copies·g^-1. 结果显示所有采样点中磺胺类ARGs的绝对丰度显著较高（P < 0.01）, 其中sul1为土壤中绝对丰度最高的ARGs, 是其它ARGs丰度的20~36 000倍. 磺胺类抗生素难以被肠道降解^[30], 可通过粪便排泄到环境中, 从而导致土壤环境的磺胺类ARGs污染^[31]. 此外, 本研究发现sul1的含量与intI1呈显著性正相关（P < 0.01）, 暗示着intI1是加速黄河流域兰州段河岸带土壤中sul1传播的重要因素. 这可能是由于intI1与sul1的基因序列重叠, 整合子 intI1基因能够捕获sul1基因并携带它在水体和土壤等环境介质中传播^{[32 ~ 34]}.

如图 4可见, 黄河兰州段河岸带土壤中ARGs的绝对丰度平均值为1.57 × 10¹¹~5.12 × 10¹²copies·g^-1. 3种土壤类型的总ARGs绝对丰度由大到小为：农田 > 工业 > 周山, 其中采样点的ARGs总绝对丰度从高到低为：d > a > b > c > g > f > e. 图 5的分析（PCoA）揭示了黄河兰州段河岸带ARGs在不同土壤类型的差异性. 证明3种土壤类型存在的ARGs分布具有显著差异（R²= 0.42, P < 0.01）；其中农田和周山二者间的差异性最为显著（R²= 0.45, P < 0.01）, 其次是工业和周山也具有显著差异性（R²= 0.35, P < 0.01）. 本研究中, 农田中ARGs绝对丰度维持在了较高水平, 可能与当地土壤中粪肥的施用有关. 诸多相关研究证实, 畜禽粪便是土壤环境中ARGs的主要来源^[32], 粪肥含有的大量抗生素可胁迫细菌在环境压力下富集ARGs. 此外, 农田较高的微生物多样性指数增加了ARGs水平转移几率, 亦是ARGs丰度较高的原因. 工业土壤中ARGs总绝对丰度较高是sul1的绝对丰度较高所致. 磺胺类ARGs通过获得（基因突变或水平转移）替代二氢叶酸合成酶（DHPS）基因表达来实现耐药性^[35]. 工业土壤丰富的intI1携带sul1基因在细菌间传播扩散, 导致sul1丰度较高. 在周山类型下, 其作为游览景区ARGs污染来源少且单一, 主要为游客粪便排放所致. 另外, 周山表面丰富的植被可吸附土壤中ARGs^[36]. 这可能是周山相较于其他类型土壤ARGs丰度较少的原因. 基于黄河兰州段河岸带不同土壤类型下ARGs分布的显著差异, 表明典型的人类活动对ARGs赋存有重要影响. 有研究发现无论在何种类型土壤中, 人类活动都是加快土壤中ARGs的富集和扩散的主要原因^[37]. 因此, 在黄河兰州段河岸带土壤中如何平衡不同土壤的可持续利用与ARGs赋存的关系, 达到生态健康值得进一步研究.

图 5

Fig. 5

**表示极显著性差异, P < 0.01 图 5 不同土壤中ARGs的主坐标分析 Fig. 5 PERMANOVA of ARGs abundance in different soil

由表 3可知, 整合子intI1分别与sul1、sul2、ermF和ermA呈显著性正相关（P < 0.01）. 转座子tnpA-04与大环内酯类基因ermB（P < 0.05）具有显著正相关, 与四环素类基因tetM、ermA和tetX具有极显著正相关性（P < 0.01）. 上述结果表明, 整合子intI1与转座子tnpA-04是黄河兰州段河岸带土壤中微生物细胞之间ARGs水平扩散的重要参与者. 已有研究表明^[38], intI1同样也是黄河兰州段水体中ARGs传播的重要因素, 而水体与河岸带土壤密切相关. tnpA-04与四环素类ARGs极显著的正相关关系暗示着tnpA-04是四环素类ARGs的重要遗传元件. 这2种MGEs和大环内酯类ARGs都具有相关性, 表明intI1和tnpA-04对大环内酯类ARGs传播可能具有协同作用. 此外, 土壤含水率与ARGs丰度变化趋势相同（表 1和图 4）, 湿润的土壤类型其微生物多样性较高, 导致ARGs水平转移的几率增加. 因此, MGEs作为ARGs的水平转移中的驱动因子, 在黄河流域河岸带土壤中的ARGs传播发挥了重要的作用.

表 3 (Table 3)

表 3 可移动遗传元件与ARGs相关性分析1） Table 3 Correlation analysis of mobile genetic elements and ARGs 类型 参数 sul1 sul2 ermB ermF ermA tetM tetX intI1 r 0.765** 0.929** 0.323 0.929** 0.857** 0.07 0.426 P < 0.01 < 0.01 0.153 < 0.01 < 0.01 0.763 0.054 tnpA-04 r 0.714 0.378 0.606* 0.643 0.929** 0.893** 0.656** P 0.098 0.092 < 0.05 0.051 < 0.01 < 0.01 < 0.01 1）r 表示相关系数；*表示显著性差异, P < 0.05, **表示极显著性差异, P < 0.01

表 3 可移动遗传元件与ARGs相关性分析1） Table 3 Correlation analysis of mobile genetic elements and ARGs

如图 6（a）所示, 前两个RDA成分可以解释理化性质驱动细菌变化的72.8%, 表明细菌的结构受土壤理化性质的影响较大. 其中EC（electrical conductivity）和TP（total phosphorus）对微生物的分布贡献率分别为48.7%和23.7%. EC可表征土壤含盐量的程度, 且不同种类的细菌对含盐量的响应不同. 以马兰黄土为主的兰州地区, 较其他地方土质的含盐量高^[39], 这决定了黄河兰州段河岸带土壤中无机盐离子的含量是驱动细菌群落结构变化的主要影响因子. 另外, 细菌的生长发育需要大量的磷^[12], 同样解释了TP对土壤细菌结构有显著影响, 特别是对农田土壤类型. Sui等^[40]的研究结果也发现TP浓度是影响细菌群落变化的主要驱动因素. 此外, 从图 6（a）中同样可以印证DOC与周山中的微生物结构有着密切的关联. 图 6（b）显示微生物结构对ARGs丰度变化的贡献. 前两个RDA成分可以解释细菌驱动ARGs和MGEs变化的97.2%, 表明微生物是驱动ARGs和MGEs变化的主要影响因子. 其中盐杆菌门和酸杆菌门对ARGs和MGEs分布的贡献率分别为37.6%和60.9%. 盐杆菌门耐盐的特性造成其适宜生存在兰州地区的土壤中. 而酸杆菌门是一类抗逆性强的细菌, 在不同土壤中广泛存在^[41]. 因而, 这两种菌群是调控黄河兰州段河岸带土壤中ARGs赋存的主要菌群. 此外, 由图 6（b）中可见, 黄河兰州段土壤微生物主要调控的是磺胺类和大环内酯类ARGs, 并且intI1与磺胺类ARGs紧密相关. 这表明MGEs水平转移机制对于ARGs在土壤中的扩散传播也有促进作用^[42]. 已有研究表明, 不同微生物结构对ARGs有着不尽相同的赋存特征和驱动机制^[38], 微生物可以直接或间接通过MGEs来改变黄河兰州段河岸带ARGs的赋存格局. 总之, 环境因子、微生物和MGEs共同决定土壤中ARGs的分布. 此外, 河岸带的土壤理化性质与黄河的水文情势、地貌特征和人类活动密切相关, 关于环境因子如何驱动ARGs在河岸带土壤中的传播, 影响其赋存仍有待于进一步研究.

图 6

Fig. 6

（a）土壤理化因子与门水平微生物的冗余分析（红色表示理化因子, 蓝色表示门水平微生物）；（b）门水平微生物与ARGs和MGEs的冗余分析（红色表示门水平微生物, 黑色表示ARGs和MGEs） 图 6 环境因子、微生物、ARGs和MGEs的冗余分析 Fig. 6 Redundancy analysis revealing the relationship among bacterial communities, environmental factors, ARGs, and MGEs

（1）黄河流域兰州段河岸的微生物种群结构与土壤类型（农田、周山和工业）密切相关. 农田类土壤微生物种群多样性最高. 土壤含盐量和TP主导了黄河兰州段河岸带土壤中微生物分布.

（2）黄河流域兰州段河岸带土壤是ARGs重要的储存库. 农业生产活动对ARGs赋存影响最显著. 遗传元件intI1和tnpA-04是调控黄河兰州段河岸带土壤中ARGs传播的重要影响因子.

（3）黄河流域兰州段河岸带土壤中微生物主导着ARGs的赋存. 盐杆菌门和酸杆菌门是黄河流域兰州段河岸带土壤中驱动ARGs赋存变化的主要微生物门类. 人类活动是改变ARGs在黄河兰州段河岸带土壤中赋存格局主要因素.