2024, Vol. 45
2. 甘肃省治沙研究所, 兰州 730070;
3. 甘肃河西走廊森林生态系统国家定位观测研究站, 武威 733000;
4. 甘肃祁连山国家级自然保护区管护中心哈溪自然保护站, 天祝 733206
2. Gansu Desert Control Research Institute, Lanzhou 730070, China;
3. Gansu Hexi Corridor Forest Ecosystem National Research Station, Wuwei 733000, China;
4. Haxi Station of Gansu Qilian Mountain National Nature Conservation Area Management and Protection Center, Tianzhu 733206, China
退耕区是绿洲农业中不再实施耕作措施的这部分土地所占的区域（空间与面积）.主要是由于水土流失严重、粮食产量低而不稳、风沙危害严重、盐渍化程度高或者水资源缺乏等原因, 不宜作为耕地, 从而退出耕种的坡耕地、沙化地或者其他耕地[1].
石羊河流域中下游地区, 曾经是水草丰美的大片绿洲[2].但随着上游农业生产对水资源需求增加[3], 造成下游的民勤绿洲区地表来水量急剧下降[4].然而下游地区对地下水资源进行大规模开采, 导致地下水位下降、植被死亡和土地大面积弃耕撂荒[5], 使之成为新的沙尘源.然而在环境因素较为恶劣的条件下, 荒漠土壤中仍然储藏着丰富的微生物资源[6], 土壤微生物在维持生态平衡中起着至关重要的作用, 已被视为土壤环境的敏感指标[7, 8].因此, 加强对民勤绿洲边缘退耕地土壤微生物群落结构和功能的研究, 对于退耕地修复和保护具有十分重要的意义.
土壤微生物是土壤生态系统的核心, 在控制与修复土壤污染[9]、维持土壤养分平衡[10]以及促进土壤生物地球化学循环[11]等过程中发挥着重要作用.以往对荒漠土壤微生物的研究主要关注的是微生物群落结构分布特征及其影响因素, 有研究发现变形菌门、放线菌门、拟杆菌门（Bacteroides）和厚壁菌门（Firmicutes）为荒漠土壤中的优势细菌类群[12], 王礼霄等[13]研究表明, 土壤细菌群落的多样性随自然恢复年限延长显著增加, 同时群落结构也发生了显著变化；微生物的群落结构和活性变化导致土壤营养成分发生了变化[14].土壤微生物不仅能够通过产生代谢产物促进植物生长, 还可以通过诱导作用使植物发挥拮抗作用抑制病原微生物的生长, 使土壤生态系统维持动态平衡[15], 有研究发现哈茨木霉（Trichoderma harzianum）可以通过真菌寄生有效抑制马铃薯黑屑病[16].土壤微生物作为生物地球化学循环, 尤其是碳氮循环过程的重要驱动者, 在温室气体排放、调节气候变化方面发挥着重要作用[17].由于其微生物群落有高度的功能冗余, 无法准确预测微生物的功能特征[18], 而功能基因能更好地预测微生物群落对生境变化的响应[19].宏基因组测序的进展极大地提高了描述环境宏基因组的能力[20], 其直接从土壤样品中提取总DNA[21], 与扩增子测序相比较, 不仅能够更加全面、真实和精确地反映微生物群落的结构变化, 还能提供微生物功能信息, 进一步提高对微生物群落及其在环境中功能的认识[22, 23], 因此利用宏基因组测序评估微生物功能基因多样性的变化可以更好地阐明绿洲区不同阶段退耕地的修复和保护机制.
目前全球土地退化和沙漠化正在加剧, 本文以民勤绿洲不同阶段退耕地为研究对象, 借助宏基因组学测序技术, 来探究不同阶段退耕地土壤微生物的群落结构和功能多样性特征, 研究结果将有助于民勤绿洲退耕地修复管理和保护.
1 材料与方法 1.1 研究区概况选择甘肃省民勤县境内不同阶段的退耕地作为采样点.该地区平均海拔1 305 m, 多年的平均气温在7.4℃左右, 极端最低气温为-28.8℃, 极端最高气温为38.1℃；年总辐射量为6 000 MJ·m-2, 年日照时数为2 832.1 h, 光照充足、气候干旱、降雨稀少、蒸发强烈且昼夜温差大, 属于典型的温带大陆性干旱气候；年均降水量约113 mm, 年均降雨量的72%主要集中在7~9月；年均蒸发量约2 644 mm；年平均风速2.3 m·s-1, 沙尘暴日数26.8 d.土壤盐碱化程度高.主要的草本植物有碱蓬（Suaeda glauca）、骆驼蒿（Peganum nigellastrum）、骆驼蓬（Peganum harmala）、盐生草（Halogeton arachnoideus）、藜（Chenopodium album）、虎尾草（Chloris virgata）和田旋花（Convolvulus arvensis）等；主要的灌木植物有黑果枸杞（Lycium ruthenicum）、白刺盐爪爪（Kalidium foliatum）、小果白刺（Nitraria sibirica）和红砂（Reamuria soongoria）等.
1.2 样地设置与样品采集走访调查农户并查阅民勤绿洲边缘各乡镇土地使用记录, 选择试验区土壤没有因自然因素（如地震等）而导致地形的变迁, 或因人为因素（如建砖厂等）而引起的土壤物质再分配的地段, 在保证样地沙土母质基本相同的情况下, 将退耕前期（退耕0~2 a）、中期（退耕4~13 a）和后期（退耕20~40 a）退耕地作为试验样地.
在各个样地采用环刀法取样, 按S形取样法选择有代表性的5个1 m×1 m的样地作为固定样点, 各采集点之间相距约70 m, 在每个固定样点按0~20 cm的深度采集土样, 并做3次重复, 将土壤样品混合均匀后装入无菌袋中用于土壤理化性质的测定；采集与此相配套的土壤微生物区系分析样品保存在冰箱中带回实验室, 提取DNA后送样至上海美吉生物医药科技有限公司进行宏基因组的测定.
1.3 微生物DNA提取与宏基因组测序利用E.Z.N.A.®试剂盒进行微生物DNA抽提, 按照试剂盒说明进行具体操作.完成DNA抽提后, 检测DNA浓度和纯度, 利用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性.取一定量检测合格的DNA样品送往上海美吉生物医药技术有限公司Illumina HiSeq 4000平台（Illumina Inc., San Diego, CA, USA）上进行末端配对测序.使用软件fastp（https://github.com/OpenGene/fastp）剪切序列3′端和5′端的adapter序列, 去除质量剪切后长度小于50 bp、质量平均值低于20以及含N碱基的reads, 保留高质量的pair-end reads和single-end reads用于宏基因组分析.使用MEGAHIT（https://github.com/voutcn/megahit）组装具有不同测序深度的序列.选择长度≥300 bp的Contigs作为最终组装结果, 并用于下一步的基因预测和注释.使用MetaGene（http://metagene.cb.k.u-tokyo.ac.jp/）对contigs中的开放阅读框（ORFs）进行预测.选取核酸长度≥100 bp的基因, 并将其翻译成氨基酸序列, 得到每个样本的基因预测结果统计表.使用CD-HIT对所有样本的预测基因序列进行聚类分析（相似度≥95%, 覆盖度≥90%）, 每个类别中最长序列为代表序列, 构建非冗余基因集.使用SOAPaligner（http://soap.genomics.org.cn/）将每个经过质检reads映射到非冗余基因集（相似度≥95%）, 并计算相应样本中基因的丰度信息.使用BLASTP（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）将非冗余基因集与NCBI-NR、KEGG数据库比对, 获得物种、功能注释信息, 然后使用物种或功能类别对应的基因丰度总和计算该物种分类和功能的丰度（BLAST比对参数设置期望值e-value为1e-5）.
1.4 土壤理化性质测定土壤pH值利用pH测定仪测定, 土壤有机质利用重铬酸钾-硫酸外加热法测定, 电导率利用电导率仪测定, 全氮利用凯氏蒸馏法测定, 速效钾利用原子吸收分光光度法测定.
1.5 数据处理采用SPSS 19.0软件对理化性质进行差异显著性检验和相关性分析, 采用Excel 2016软件绘图；用STAMP软件比较不同退耕阶段土壤微生物功能基因相对丰度的差异；采用R语言vegan包中rda对土壤理化性质与微生物功能群落组成进行冗余分析（RDA）.
2 结果与分析 2.1 不同阶段退耕地土壤理化特性的差异在退耕前期、中期和后期的3个样地采集土壤样品, 土壤理化性质如表 1所示.所有土壤样品pH值较高, 呈碱性, pH值在8.00~8.09之间；土壤有机质含量整体上表现为随退耕时间变长呈递减趋势；土壤电导率的值从退耕前期、中期到后期表现为剧增的趋势, 退耕前期和后期差异显著；土壤全氮含量变化不大, 而速效钾含量也呈现剧增的现象, 退耕前期和后期差异显著.
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表 1 不同阶段退耕地土壤理化性质1） Table 1 Soil physical and chemical properties of abandoned farmland at different stages |
2.2 不同阶段退耕地土壤微生物群落组成特征
门水平上退耕地土壤微生物群落结构如图 1, 其中只展示相对丰度 > 2%的优势门类群, 低于2%的合并为others.在退耕前期、中期和后期的土壤中分别发现了9、5和6个优势菌门.虽然3个阶段土壤中的优势菌门基本相同, 但不同阶段退耕地的各个优势菌门的相对丰度有显著差异.例如, 放线菌门和变形菌门在退耕前、中和后期的丰度分别为18.38%和25.79%、33.93%和21.39%及44.61%和19.93%.本研究结果表明放线菌门与退耕阶段呈显著正相关, 而变形菌门与退耕阶段呈显著负相关（图 2）.
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1~3为退耕前期土壤, 4~6为退耕中期土壤, 7~9为退耕后期土壤 图 1 不同阶段退耕地土壤微生物在门分类水平上的群落结构 Fig. 1 Community structure of soil microorganisms in different stages of farmland conversion at phylum level |
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*表示在0.05水平上差异显著 图 2 不同阶段退耕地土壤微生物在门分类水平上相对丰度前3的物种差异显著性分析 Fig. 2 Analysis of the significance of species differences among the top three relative abundance of soil microorganisms in different stages of farmland conversion at the phylum level |
属水平上退耕地土壤微生物群落结构如图 3, 其中只展示相对丰度 > 1%的优势属类群, 低于1%的合并为others.在退耕前期、中期和后期的土壤中分别发现了7、6和8个优势菌, 不同阶段退耕地土壤相对丰度占比前3的微生物属存在显著差异（图 4）.
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1~3为退耕前期土壤, 4~6为退耕中期土壤, 7~9为退耕后期土壤 图 3 不同阶段退耕地土壤微生物在属分类水平上的群落结构 Fig. 3 Community structure of soil microorganisms in different stages of farmland conversion at genus level |
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*表示在0.05水平上差异显著 图 4 不同阶段退耕地土壤微生物在属分类水平上相对丰度前3的物种差异显著性分析 Fig. 4 Analysis of the significance of species differences among the top three relative abundance of soil microorganisms in different stages of farmland conversion at the genus level |
基于KEGG数据库, 对不同阶段退耕地土壤中获
得的非冗余基因集进行了基因功能预测, 共有129 735 322条reads可以对应到相应的功能注释结果中.属于代谢（metabolism）类别的reads有93 513 940条, 属于遗传信息处理（genetic information processing）类别的有12 462 910条, 属于环境信息处理（environmental information processing）类别的有8 305 020条, 属于细胞过程（cellular processes）类别的有7 176 786条, 属于人类疾病（human diseases）类别的有5 009 738条, 属于生物系统（organismal systems）类别的有3 266 928条.在level 1水平上（图 5）, 其中新陈代谢在所有处理中相对丰度最高, 前、中和后期分别达到了55.09%、55.40%和55.41%, 为土壤微生物的主要功能.新陈代谢和环境信息处理功能随着退耕阶段的推移, 其丰度逐渐增加；人类疾病和生物系统功能随着退耕阶段的推移, 其丰度逐渐减少.
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图 5 土壤微生物群落在KEGG level 1数据库下功能组成相对丰度柱状图 Fig. 5 Histogram of relative abundance of functional composition of soil microbial communities under KEGG level 1 database |
在KEGG level 3水平比较发现（图 6）, 3个退耕阶段土壤中注释到最多的KEGG功能分类都是群体感应（quorum sensing）, 其次是糖酵解/糖原异生（glycolysis/gluconeogenesis）以及半胱氨酸和蛋氨酸代谢（cysteine and methionine metabolism）.不同退耕阶段土壤中的微生物功能代谢差异显著, 群体感应（quorum sensing）、卟啉与叶绿素代谢（porphyrin and chlorophyll metabolism）、泛酸盐和辅酶A生物合成（pantothenate and CoA biosynthesis）以及苯乙烯降解（styrene degradation）随着退耕阶段的推移, 其相对丰度逐渐升高；半胱氨酸和蛋氨酸代谢（cysteine and methionine metabolism）、细菌分泌系统（bacterial secretion system）、甘油磷脂代谢（glycerophospholipid metabolism）、叶酸合成（folate biosynthesis）、牛磺酸和亚牛磺酸代谢（taurine and hypotaurine metabolism）、氰基胺基酸代谢（cyanoamino acid metabolism）、脂多糖生物合成（lipopolysaccharide biosynthesis）、阳离子抗菌肽耐药[cationic antimicrobial peptide（CAMP）resistance]、苯丙烷类生物合成（phenylpropanoid biosynthesis）以及昆虫激素生物合成（insect hormone biosynthesis）随着退耕阶段的推移, 其相对丰度逐渐降低.
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*表示在0.05水平上差异显著 图 6 不同阶段退耕地土壤功能基因（KEGG level 3）相对丰度的STAMP分析 Fig. 6 STAMP analysis of the relative abundance of functional gene at KEGG level 3 obtained under in different stages of abandoned farmland |
不同阶段退耕地土壤微生物功能组成之间的重叠情况采用Venn图呈现（图 7）, 然而发现所有的样本共有的微生物功能群落有376种, 占所有微生物功能群落的94.95%.在退耕前期和中期土壤中有8种微生物功能群落共享, 功能群落的相似性为2.02%, 在退耕后期和退耕中期土壤中有6种微生物功能群落共享, 功能群落的相似性为1.52%, 而在退耕前期土壤中仅有2种微生物功能群落和后期土壤共享, 功能群落的相似性明显降低, 仅为0.51%, 这个结果说明土壤微生物功能组成随退耕时间有显著变化.
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图 7 不同阶段退耕地土壤微生物功能分类水平维恩图 Fig. 7 Venn map of soil microbial function classification levels in different stages of returned farmland |
RDA分析结果表明EC、AK和TN对土壤微生物群落功能组成具有显著影响（P < 0.05, 图 8）, 第一和第二排序轴分别解释了59.79%和16.10%的微生物功能组成, 说明本研究选取的土壤理化因子具有一定的代表性.从3个阶段退耕地土壤样地在图 8中的分布可知, 退耕前期和后期土壤样地分布的距离较远, 说明退耕前期和退耕后期土壤微生物功能组成差异显著, 与Venn图的结果一致.土壤理化因子对微生物功能组成的相关性分析表明, EC、TN和AK与土壤微生物功能组成都具有显著的相关性（表 2）, 且土壤EC与微生物功能组成的相关性最大（R2=0.895 5, P=0.003）.
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图 8 不同阶段退耕地土壤微生物功能组成与土壤理化性质的冗余分析 Fig. 8 RDA between soil microbial functional composition and soil physicochemical properties in different stages of farmland conversion |
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表 2 土壤理化性质与微生物群落功能组成的相关性 Table 2 Correlation between soil physical and chemical properties and microbial community functional composition |
3 讨论
本研究中, 不同阶段退耕地的土壤中都有放线菌门、变形菌门、芽单胞菌门和绿弯菌门（Chloroflexi）等优势微生物, 而且优势微生物菌门的相对丰度排序并没有较大的差异；本研究发现, 放线菌门与退耕阶段呈显著正相关, 而变形菌门与退耕阶段呈显著负相关, 可见放线菌门作用于土壤肥力的形成和提高[24, 25], 表明在不同退耕阶段, 优势菌门的相对丰度发生了变化.放线菌门在所有土壤中的占比都是最多的, 其次是变形菌门和绿弯菌门, 这与前人的研究结果是相同[26, 27].刘洋等[28]对黄土高原不同植被类型下土壤细菌群落特征的研究发现, 碱性土壤中的主要优势菌门为放线菌门, 本研究发现放线菌门在民勤绿洲边缘退耕地中丰度达34%, 这是由于荒漠地区土壤含水量极低且太阳辐射强度大, 造成土壤盐碱化严重、营养物质含量少且植被覆盖度低, 而放线菌具备孢子生殖、多个UV修复机制和竞争优势的次级代谢合成能力, 产生的孢子能够抵抗外界不利的环境条件, 使其成为优势菌群[29, 30]；另外, 放线菌门属于革兰氏阳性细菌, 被认为是世界上最大的菌门[31], 保持着较高的物种丰富度和功能多样性, 能够对木质素和纤维素进行分解[32], 进而为土壤微生物的生长提供更多的营养物质, 该试验区土壤呈碱性, 而放线菌门喜欢微碱性环境[33], 这为放线菌门的生长提供了良好环境, 使其在民勤绿洲退耕区分布较广.本研究中芽单胞菌门相对丰度含量较高, 赵娇等[34]研究发现, 黄河三角洲盐生植物根际土壤中芽单胞菌门相对丰度较高, 说明芽单胞菌门具有嗜盐或耐盐的特征.前人研究发现绿弯菌门具有耐贫瘠与抗旱性强的特点[35], 本研究中绿弯菌门相对丰度也较高, 体现出其具有光能自养的特点, 通过3-羟基丙酸途径固定CO2产生能量.在属水平, 芽单胞菌属在所有土壤样品中相对丰度最高, 为4.62%, 芽单胞菌属是芽单胞菌门唯一正式命名的属, 其作用与多磷酸盐积累有关[36]；其次是腈基降解菌属（Nitriliruptor）, 相对丰度为3.13%.不论是在门水平还是属水平不同退耕阶段对土壤微生物群落组成有显著差异, 表明这些微生物类群在民勤绿洲退耕地土壤生态系统中发挥着重要作用, 在维持生态系统稳定中占据重要的地位.
由于微生物群落内部存在高度的功能冗余, 因此群落结构并不一定决定了微生物群落的功能[37], 应同时进行微生物分类学和功能分析, 以便更好地理解土壤微生物这个“黑匣子”[38].本研究通过与KEGG数据库进行比对, 将功能基因进行分类注释, 来确定微生物群落组成差异是否会影响微生物群落水平的功能变化.分析结果表明：微生物群落的总体功能代谢特征的差异显著, 说明微生物群落的功能多样性对不同阶段的土壤修复敏感.这与前人的研究结果不同, Delmont等[39]研究发现, 季节和土层深度对草地土壤微生物的功能影响不显著, 微生物的总体功能相对保守.通过与KEGG level 1数据库做比对发现, 新陈代谢是荒漠土壤微生物的主要功能, 在3个不同退耕阶段丰度最高, 分别达到了55.09%、55.40%和55.41%, 说明代谢是民勤绿洲退耕地土壤微生物在土壤中主要的活动过程.Chen等[40]研究发现微生物功能基因的丰度是影响呼吸、硝化和反硝化等土壤过程速率的主导因素；Xiang等[41]研究发现碳氮磷硫功能基因丰度与微生物多样性存在显著正相关关系, 表明功能基因丰度的高低在一定程度上可暗示其微生物群落结构的复杂性[42].相较于退耕前期, 退耕后期新陈代谢的功能丰度提高了0.32%, 说明退耕时间的长短可以影响土壤微生物的代谢能力, 而土壤微生物代谢能力的提高有利于植物对土壤养分的吸收利用.新陈代谢功能丰度的增加可能使植物多样性增加, 产生了较多的腐殖质, 其在腐殖化过程中需要大量的化合物参与, 而化合物分解则需要微生物释放能量进行代谢[43], 因此导致其丰度增加, 这也表明土壤微生物对逆境胁迫与干扰的适应性.
土壤特性是塑造土壤微生物群落的最重要因素之一[44], 有研究表明土壤理化性质对土壤微生物群落的形成具有较大影响[45, 46], 土壤为微生物群落的生长繁殖提供微环境, 其理化性质又间接地影响土壤微生物群落结构的组成和功能[47, 48], 特别是盐分的改变会成为影响微生物群落结构和功能多样性的主要因素[49, 50], 而本研究对民勤绿洲边缘退耕地土壤理化性质进行测定分析可知, 民勤绿洲边缘退耕地随退耕时间增加呈现土壤含盐量剧增现象, 增幅高达448.91%, 而土壤养分含量处于较低或极低水平, 从而对荒漠生态系统造成影响.本研究中RDA分析表明, EC是土壤微生物群落功能结构的重要影响因子, 表明较高的含盐量是荒漠地区重要的限制因素, 这与Yang等[51]的研究结论一致.
不同阶段退耕地土壤微生物群落结构和功能多样性变化较大, 土壤理化性质在塑造微生物群落方面发挥着重要作用, 而盐渍环境中的微生物有着特殊的结构、生理机制以及特殊的代谢产物, 利用耐盐碱微生物修复盐碱土壤已经成为生物改良盐碱地的重要手段, 土壤耐盐碱微生物在土壤中数量庞大、种类丰富并且适应能力强[52], 一方面促进植物生长发育, 另一方面可以提高盐碱地土壤肥力、进一步缓解土壤盐碱危害[53], 在退耕地生态修复中可以进一步考虑从土壤中分离筛选出耐盐碱的菌株, 然后对其进行鉴别与功能性评价分析, 从而为改良民勤绿洲退耕地提供微生物资源和理论基础.
4 结论（1）不同阶段退耕地土壤微生物群落结构存在明显的变化, 放线菌门、变形菌门和芽单胞菌门等优势菌门的相对丰度存在显著差异.
（2）退耕过程中土壤微生物群落功能组成和丰度有明显变化, 退耕后期群体感应、卟啉与叶绿素代谢、泛酸盐和辅酶A生物合成和苯乙烯降解的基因相对丰度显著高于退耕前期.
（3）不同阶段退耕地土壤微生物功能结构存在显著差异.通过冗余分析发现, EC、AK和TN对土壤微生物功能组成具有显著影响, 其中土壤EC对微生物功能组成的影响最大.
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