2024, Vol. 45
2. 中国科学院大学, 北京 100049;
3. 中国科学院华南植物园退化生态系统植被恢复与管理重点实验室, 广州 510650
, ZHOU Shu-yi-dan3 , PAN Ting1,2 , ZHOU Xin-yuan1,2 , SU Jian-qiang1,2 , ZHANG Xian1,2
2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China;
3. Key Laboratory of Vegetation Restoration and Management of Degraded Ecosystems, South China Botanical Garden, Chinese Academy of Sciences, Guangzhou 510650, China
湿地广泛分布于全球各地, 是地球上生物多样性和生产力都比较高的生态环境系统.湿地可以受纳并消减环境污染物, 调节径流, 改善水质, 调节小气候, 维护生物多样性, 具有显著的生态系统服务价值.城市湿地是存在于城市区域之内的湿地, 生态服务功能与乡野湿地有着明显不同, 其受人为活动干扰强烈[1].我国城市湿地存在面积缩小、功能退化和污染严重等特点, 特别是富营养化现象突出[2].城市湿地是城市生态环境的重要组成部分, 是重要的生态基础设施或绿色基础设施.进一步地, 城市湿地公园是指被纳入城市绿地系统规划, 并且适宜作为公园的天然或人工改造的湿地, 通过合理的保护利用, 形成集保护、科普和休闲等功能于一体的公园[3], 是城市居民的公共开放空间和亲水平台环境, 人口承载量和流动性较大, 集中体现了湿地的生态效益、经济效益和社会效益, 综合效益显著, 增进了社会与环境福祉.
抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes, ARGs)被认为是一种环境新污染物[4, 5], 携带抗生素抗性基因的耐药菌和致病菌等微生物引发了人类健康和城市生物安全问题[6].抗生素抗性基因在地球环境中虽然属于古老的存在[7, 8], 但是人类活动(抗生素不合理使用、畜牧水产养殖、城市污水排放、人口迁徙和全球物流等)强化了抗生素抗性基因的选择压力, 促进了抗性微生物在更大的时空尺度的迁移传播[9, 10].基于单细胞水平拉曼结合靶向宏基因组的方法, 还发现环境中原位活性耐药菌携带了大量抗性基因、毒力因子和可移动遗传元件(MGEs)[11], 表明抗性基因与微生物及其携带的其它功能基因紧密相关.特别需要注意的是, 一些具有多重耐药性或者突破最新抗生素的“超级细菌”也不断有研究报导[12, 13], 这些致病菌可能会引发无法治疗的传染病.在过去的几十年间, 基于常规筛选分离培养手段, 没有发现新的抗生素药物, 与此同时, 原有的部分抗生素医疗效用不断降低(使用剂量还需不断增大).因此, 环境抗生素抗性基因的传播和扩散态势日趋复杂, 环境微生物安全不容乐观[14, 15].
环境微生物是抗生素抗性基因的重要来源和存储库, 水体环境具有种类繁多且数量巨大的微生物, 其中的致病菌、耐药菌和病毒等可能造成水体微生物污染[16], 影响水生态健康.近年来, 针对城市河流、河口沉积物和地下水等环境中的微生物抗生素抗性基因的赋存特征和迁移扩散机制开展了相关研究, 表明人类活动与抗生素抗性有着密切的关系[17 ~ 20].有研究表明, 环境微生物抗生素抗性组与城市化水平显著相关[21, 22].当前, 基于实验室中的构筑模拟湿地(constructed wetland)开展了很多湿地抗性基因分布与去除的相关研究[23, 24], 但是对城市湿地环境, 特别是滨海城市湿地公园水体环境抗生素抗性基因的分布特征和影响因素仍不甚清楚.城市湿地公园不仅与城市居民关系密切, 而且具有重要的水源涵养和生态功能, 与人群健康福祉紧密相关.本文基于全健康(one health)概念框架和微生物安全视角, 研究了厦门城市湿地公园水体环境中的抗性基因分布规律和微生物群落结构特征, 结合水环境质量, 深入探究了抗生素抗性基因与微生物的关系, 阐释了城市湿地水体环境抗生素抗性基因变化的驱动机制, 以期为量化评估城市湿地公园水体环境抗生素抗性风险和城市微生物安全监管提供数据支持及理论支撑.
1 材料与方法 1.1 研究区域与样品采集研究区域位于福建省厦门市, 选取了厦门市岛内外共计5个海湾型城市湿地公园(图 1), 具体分别是：厦门园博苑湿地公园(YBY)、马銮湾湿地公园(MLW)、白鹭洲湿地公园(BLZ)、五缘湾湿地公园(WYW)和下潭尾湿地公园(XTW).本研究对5个公园同时采样, 时间为2022年3月23日16：00, 此时超过日间高潮时刻38 min, 湿地公园中来自陆地和海洋的水体经过充分混合, 水环境样本具有较好代表性, 能够体现海湾型城市湿地公园的水环境特征.每个公园样点重复采集3瓶水样(550 mL, 无菌聚乙烯瓶), 置于4℃冷藏箱, 运回实验室进行预处理和后续实验.
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图 1 研究区域及城市公湿地公园位置示意 Fig. 1 Sampling sites of urban wetland parks |
采用微孔径为0.45 μm水系聚醚砜针筒式滤头(津隆, 天津), 对采集回实验室的新鲜水样进行过滤, 获得35mL左右清澈水样.一部分过滤后水样(约12 mL)直接上机(总有机碳分析仪, TOC-L, 日立)测定水中的总有机碳(TOC)和总氮(TN), 另一部分水样(12 mL)用电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MS, 7500 series, Agilent Technologies)对砷(As)、锰(Mn)、镍(Ni)和铅(Pb)等元素进行检测.
1.3 水体微生物总DNA提取与高通量测序分析采集回实验室的新鲜水样用0.22 μm孔径的混合纤维素酯滤膜(半岛实业, 上海)基于负压多联过滤器(津腾, 天津)分别过滤0.3 L体积.获得含有水体微生物的滤膜, 对折后剪碎(约1 mm × 1 mm), 装入DNA提取试剂盒的振荡破碎管(FastDNA Spin Kit, MP Bio, 美国), 后续水体微生物组DNA提取过程根据试剂盒的说明步骤进行.使用微量分光光度计NanoDrop 1000(Thermo Scientific, 美国)对水体微生物DNA的浓度和纯度进行检测和评估.
基于细菌核糖体16S rRNA基因V4-V5可变区片段, 对城市湿地水体微生物进行了高通量测序(广州基迪奥生物科技有限公司完成).测序所获得的数据用QIIME进一步进行数据过滤、序列拼接和聚类等处理, 按照97%的相似度水平, 聚类分析获得操作分类单元(operational taxonomic units, OTUs).根据基因数据库Greengene database(V13.8), 基于微生物OTUs涵盖的序列信息进行物种注释, 能在不同分类水平对微生物组成进行归类划分[25, 26].
1.4 荧光定量PCR和高通量定量PCR检测方法荧光定量PCR(qPCR)在Roche LightCycler 480 Ⅱ仪器上完成.微生物16S rRNA基因的绝对丰度可以用于评价微生物的总体丰度水平.具体的16S rRNA基因标准质粒的浓度梯度范围为1.92 × 102 ~ 1.92 × 108 copies·μL-1.qPCR实验反应体系：PCR体积20 μL, Roche SYBR Master I Mix预混试剂10 μL, PCR级超纯水7 μL, 上游(forward)和下游(reverse)引物各1 μL, DNA模板(样本和标准质粒)为1 μL.
抗生素抗性基因的分析测试在WaferGen SmartChip系统高通量PCR平台(TaKaRa, WaferGen, 美国)进行.研究中具体选择的功能基因(抗性基因)、高通量PCR反应扩增条件及合格数据筛选分析依据文献[19, 27]. WaferGen SmartChip高通量PCR系统平台具有分析通量高(5 184 array)、加样自动化(MSND)和节约试剂等优势.基于PCR检测通量高的特点, 特别适用于环境微生物的功能基因谱集(抗生素抗性基因、毒力因子基因、病原菌基因和重金属抗性基因)的高通量定性定量分析[15, 28 ~ 30].根据引物和仪器的特点, Ct值为31时, 定义为检测的检出限.实验过程中, 每个样品设置了3个PCR技术平行, 当Ct值都有效时, 认为该样品为有效检出.抗生素抗性基因的绝对丰度(AARGs)的计算过程与方法, 根据如下公式进行：
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(2) |
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(3) |
本研究中所涉及到的统计与计算, 如平均值和标准差等皆采用Excel 2016版本(Microsft, 美国)进行分析.样品的显著性和相关性分析基于软件SPSS V18.0(IBM, 美国)完成.微生物多样性结果的分析主要基于R (version 3.6.3)软件的各个软件包工具进行作图展示与绘制, 例如用cluster包进行抗性基因的聚类树分析等.抗性基因与微生物共现性网络分析与数据统计亦是基于R (version 3.6.3)软件来实现, 根据获得的统计分析结果, 采用Gephi (V 0.9.2)进行共现性网络相互关系的绘制.文中相关的柱状图等则是由Origin 9 (OriginLab, 美国)进行绘制完成.
2 结果与分析 2.1 湿地公园水体微生物ARGs的种类多样性高通量PCR结果显示(图 2), YBY、MLW、BLZ、WYW和XTW这5个城市湿地公园水体环境中检测出ARGs分别为120、152、104、132和120种, MGEs分别为10、11、10、8和10种.检测出的抗生素抗性基因按照其所对应的抗生素类型, 可以具体归类为8大类型, 具体为：氨基糖苷类(aminoglycoside)、β-内酰胺类(β-lactamase)、氯霉素类(chloramphenicol)、MLSB、多重耐药类(multidrug)、磺胺类(sulfonamide)、四环素类(tetracycline)和万古霉素类(vancomycin).图 2可以看出, 5个城市湿地公园水体环境ARGs具有很高的多样性, 多重耐药类、氨基糖苷类和β-内酰胺类是湿地公园水体环境最主要的3大类抗性基因.其中, MLW城市湿地公园具有最多种类的抗性基因(152种), MGEs种类也是最多(11种).从抗生素抗性的具体耐药机制来分析, 可以发现, 抗生素失活机制是水体环境微生物主导的耐药机制策略(42% ~ 49%), 其次是抗生素主动外排机制(29% ~ 38%), 再次是微生物细胞保护机制(16% ~ 18%).总体上看, 5个城市湿地公园水体微生物的3种耐药机制的相对比例比较相似[图 2(b)], 差异不大.
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图 2 抗生素抗性基因种类及其耐药机制 Fig. 2 Number of detected ARGs/MGEs and the corresponding resistance mechanisms |
基于高通量定量PCR和普通16S定量PCR的结果计算显示(图 3), 5个城市湿地公园水体环境抗生素抗性基因在丰度水平上的分布特征具有显著差异(P < 0.05).整体上看, 水体中抗性基因丰度范围为8.56 × 108 ~ 6.48 × 109 copies·L-1.其中, 丰度最高的是YBY城市湿地公园, 可能与该湿地氮素和总有机碳含量最为丰富有关；最低的是BLZ湿地公园.多重耐药类、氨基糖苷类和MLSB类是丰度最高的3大类抗性基因, 与抗性基因种类分布基本一致(图 2).此外, 各个城市湿地公园点位MGEs都低于抗生素抗性基因总的丰度, 并具有相似分布趋势特征, 暗示着MGEs与抗性基因存在紧密的关系, 表明微生物间可能存在抗生素抗性基因水平转移现象, 并与丰度水平一致.WYW和XTW城市湿地公园在抗生素抗性基因丰度水平整体比较接近, 没有显著差异(P > 0.05), 与抗性基因种类分布特点相似.
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不同小写字母表示抗性基因在不同湿地公园间的统计差异水平 图 3 ARGs与MGEs丰度水平 Fig. 3 Absolute abundance of ARGs and MGEs |
水环境样品经过16S rRNA基因高通量测序及97%相似性聚类归并后, 共得到21 555个OTUs.因此根据OTUs的序列信息进行注释, 城市湿地公园的水体微生物群落组成及结构如图 4所示.在门分类水平上, 相对丰度前5的是：蓝藻门(Cyanobacteria)、变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、放线菌门(Actinobacteria)和浮霉菌门(Planctomycetes), 共占总微生物组成的97.1%.在属分类水平上, 可以进一步测得微生物的具体组成和相对丰度, 其中Cyanobium_PCC-6307、HIMB11、Lentibacter、Mycobacterium和NS3a_marine_group为前5的优势菌属, 占全部样品相对丰度的32.5%, 未归类的菌属的比例介于33.1% ~ 48.9%.
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图 4 微生物群落结构及聚类树状关系 Fig. 4 Bacterial composition and phylogenetic analysis |
基于Bray-Curtis距离的非加权组平均法(UPGMA)的聚类分析, 能够展示厦门市岛内外5个不同湿地公园水体之间微生物的相互关系, 结果显示[图 4(c)], 位于厦门岛外的城市-工业综合开发区的MLW和XTW湿地公园的分布特征比较接近, 关系最为密切, 微生物群落结构和组成相似, 而位于岛内城市人口稠密区的BLZ和WYW湿地公园之间的微生物群落结构比较接近.此外, YBY的水域面积巨大, 兼有自然和城市特点, 其微生物群落结构与组成相对独立, 有着独特的群落组成特征.
2.4 水体理化性质湿地城市公园水质标准评价可以参考地表水环境质量标准(GB 3838-2002).由表 1可以看出, 各湿地公园水体环境的(类)重金属元素浓度都比较低, 达到了地表水Ⅰ类水的标准.而整体ρ[总氮(TN)]大于1 mg·L-1, 其中BLZ、WYW和XTW为Ⅳ类水标准, YBY和MLW属于劣Ⅴ类水.从氮素污染角度来看, 湿地公园水体处于一定程度的富营养状态, 特别是位于厦门岛外的城市湿地公园受到快速城市化和工业化的双重影响.因此, 研究区域水体氮素水平较高会导致微生物大量繁殖, 并受到滨海水力环境的影响.
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表 1 水体理化性质 Table 1 Physicochemical properties in water of wetland parks |
2.5 微生物组与抗生素抗性组的关系
基于环境微生物与抗性基因组整体关联角度, 采用普式分析(procrustes analysis), 结果表明环境微生物组与抗生素抗性组有极显著的关联映射关系(图 5), 具有良好的一致性(两组数据坐标之间的偏差平方和M2 = 0.57, P = 0.001 2), 证明微生物对于抗性基因的赋存和演变有着直接的密切关系.Mantel test检验计算也证明了上述两者的极显著相关性(P = 0.004).此外, 普式分析也证明了MLW和XTW在微生物组和抗生素抗性组的分布组成都比较相似；BLZ与WYW聚在相对更集中的区域, 因此这两个湿地公园的微生物组和抗性组最为接近；而YBY则有着相对独立于其它4个湿地公园的分布特点.以上分析结果, 与对图 4(c)的分析相一致.
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图 5 细菌微生物组与抗生素抗性组的整体相互关系 Fig. 5 Procrustes analysis among ARGs and OTUs |
进一步地, 基于共现性网络分析(co-occurrence network analysis)方法, 在微生物菌属的分类水平深入探究了微生物与抗生素抗性基因的共现性特征与规律, 基于两者的相关特点, 识别发现了多种抗生素抗性基因的潜在携带者(图 6).结果显示, 从城市湿地公园的整体角度, 有9个属水平的细菌(涵盖了5个门)是湿地水体中41种抗生素抗性基因(分属7大类ARGs)的携带者.具体从微生物菌属的水平进行分析, Marivivens和NS5_marine_group都含有10种抗生素抗性基因, Planktomarina和CL500-3则各具有8种抗性基因, Polaribacter_4含有7种抗生素抗性基因, Lentibacter有4种不同类别的抗性基因, NS3a_marine_group携带有3种抗生素抗性基因, Cyanobium_PCC-6307和Mycobacterium则各含有2种抗性基因.这些结果表明, 微生物细菌能够同时携带多种不同的抗生素抗性基因.
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图 6 菌属水平的微生物与抗性基因的共现性网络关系 Fig. 6 Co-occurrence network analysis between bacterial genus and antibiotic resistance genes |
城市湿地公园水环境中总共检测到104 ~ 152种抗生素抗性基因, 总计检出217种抗性基因, 总体检出率为76.7%.抗生素抗性基因丰度介于8.56 × 108 ~ 6.48 × 109 copies·L-1, 城市湿地公园水环境中抗性基因呈现种类多样和丰度较高的分布特征(图 1和图 2), 因此城市湿地湖泊水体环境是抗生素抗性基因的重要存储库[31, 32], 有些城市湿地湖泊甚至检测出含有抗性基因和毒力基因的病原菌[16, 33].有研究表明, 城市湿地等景观水体抗生素抗性基因丰度仅次于污水厂进水, 处于较高的污染水平[31].本研究中, 这些丰度高且种类多样的抗生素抗性基因在5个城市湿地公园的广泛分布, 且相互关系非常紧密(图 7), 其中181种抗性基因是城市湿地公园所共有的(shared ARGs), YBY、MLW、BLZ、WYW和XTW分别单独检测出8、10、4、5和9种独有抗性基因.此外, 有12种MGEs也是在至少2个湿地公园水体中检出, 表明ARGs和MGEs在城市湿地公园环境是普遍存在, 并且抗性基因在水体微生物中存在水平基因转移的潜在关联.因此, 抗生素抗性基因在城市湿地公园水体分布特征受到多种因素影响, 形成了相互关系复杂的分布态势.
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图 7 城市湿地公园之间抗生素抗性基因的分布特征 Fig. 7 Patterns and shared ARGs of urban wetland parks |
城市湿地水体环境抗生素抗性基因的分布情况与微生物、水体理化性质和周边土地利用类型等紧密相关.冗余分析(redundancy analysis)结果显示, TOC、TN、Cyanobium_PCC⁃6307、HIMB11和Lentibacter这5个影响因子, 对于抗性基因整体特征在第一轴和第二轴的解释量分别达到了33.14%和14.20%, 其中前三者对于YBY湿地水体呈现正相关关系, 红细菌科的HIMB11属与WYW和XTW的抗性基因组都是显著正相关的关系, 红细菌科的Lentibacter属则与MLW水环境抗性基因关系密切[图 8(a)].本研究显示, 微生物群落能够独立解释51%湿地水体抗生素抗性基因的分布态势, 而水体理化性质(TOC、TN和重金属)则能够解释6%, 前述两者还能够共同阐释抗生素抗性基因变化的31%, 这两者的总计解释量达到了88%.因此, 微生物自身的增殖与传播是抗性基因存续的最重要驱动力[20, 34].有研究表明, 城市景观水体是抗生素抗性基因的分布热区, 而且微生物群落及其随机过程具有指示环境抗生素抗性基因传播强度与进化的潜力[35, 36].因此, 水质状况直接影响微生物的群落结构及其组成, 进而影响城市湿地水体抗生素抗性基因的赋存特征和演变过程.
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图 8 抗生素抗性基因分布的影响因子及定量化解释分析 Fig. 8 Redundancy analysis and variance partitioning analysis for profile of ARGs |
基于高通量PCR和16S rRNA基因高通量测序技术, 本文深入研究了厦门城市湿地公园水体环境抗生素抗性基因污染特征及其驱动影响因子.人类活动背景下的城市湿地水环境质量变化和微生物群落结构动态等共同塑造了城市湿地公园抗性基因的整体分布格局.本研究显示, 城市湿地公园水体环境具有丰度较高、种类多样以及大量共有的抗生素抗性基因, 微生物菌属间可能存在抗性基因水平转移现象, 城市湿地是抗生素抗性基因的重要分布热区和存储库.在菌属分类水平上, Marivivens、NS5_marine_group和Planktomarina等9种微生物是多种抗生素抗性基因的潜在携带者, 微生物群落结构对城市湿地公园水体环境抗性基因变化的单独解释量达到了51%, 微生物群落是城市湿地公园抗生素抗性基因赋存和演化最主要的驱动力.
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