2024, Vol. 45
2. 中国水产科学研究院, 农业农村部水产品质量安全控制重点实验室, 北京 100141;
3. 中国水产科学研究院北戴河中心试验站, 秦皇岛 066100
, CHENG Bo2
, LIU Yue1 , DENG Jie1 , XU Yan3 , SUN Chao-hui3 , YUAN Li-yan1 , ZUO Jia1 , SI Fei3 , GAO Li-juan1
2. Key Laboratory of Aquatic Product Quality and Safety Control, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Chinese Academy of Fishery Sciences, Beijing 100141, China;
3. Beidaihe Central Experimental Station, Chinese Academy of Fishery Sciences, Qinhuangdao 066100, China
抗生素因其具有预防疾病和促进生长的作用, 曾经以亚治疗剂量被添加于饲料中并广泛用于养殖业[1~4].进入养殖动物体内的抗生素, 并不能被充分吸收和代谢, 未被吸收和代谢的抗生素通过排泄物进入环境, 进而对环境中微生物群落的进化增加了选择压力, 使得群落结构发生改变, 同时促进了抗生素抗性基因（antibiotic resistance gene, ARGs）的传播和扩散[5~7].水产养殖系统作为一个较为复杂的小型生态系统, 一方面受到人类活动的影响, 另一方面也对人类的生存环境和赖以生存的食物产生巨大的作用.据报道, 很多海水养殖区内各类ARGs及各类抗生素抗性菌株（antibiotic resistance bacteria, ARB）的丰度要显著高于非养殖区域[8~10], 而海水养殖区域的各类耐药菌及ARGs的分布不仅威胁着人民的饮食安全, 还对地球生态环境带来了很大的隐患.已有研究表明, ARGs可以通过食物链传递给高营养级的生物, 人类通过食用鱼类等海产品将ARB或ARGs转移到人体内, 从而影响人类健康[11].
海洋微生物一方面在海洋生物地球化学循环中起到关键作用[12~14], 与此同时, 也会引起养殖动物发生病害, 进而导致抗生素抗性菌株和抗性基因的传播和扩散.在海洋环境及海洋鱼类肠道内, 细菌数量异常庞大, 而抗生素过度使用所造成的压力环境为这些抗生素抗性菌株的产生创造了条件.由突变产生的耐药菌株会在新环境中大量繁殖, 发展成为优势菌株[15].秦皇岛市昌黎县, 毗临现在的北戴河新区, 是河北省沿海渔业经济大县, 拥有丰富的海洋渔业资源, 多年来, 昌黎县依托区域资源优势大力发展浅海养殖业, 逐步形成了以扇贝养殖为主的浅海筏式养殖产业, 特别是扇贝养殖现已成为昌黎县渔业的支柱产业, 在地方农业经济中发挥着重要作用.同时, 昌黎县拥有河、海、港、潟湖、沙丘和森林等自然结合的独特景观, 具备打造世界级阳光海岸的自然资源条件, 切实保护好该地区海洋环境质量至关重要.但近年, 随着扇贝养殖密度的不断增加, 大范围高密度养殖引起的饵料不足、病害频发等, 导致海域环境恶化日趋严重.高度重视和严格控制海域污染, 确保浅海养殖业的可持续健康发展, 在保障产业经济的同时, 保障水域环境成为当前首要任务, 然而目前有关该区域海洋环境中海洋微生物多样性及微生物的耐药性鲜有研究.
本文以昌黎县浅海筏式养殖海域作为研究对象, 围绕主要核心养殖区域, 采集海域中5个不同位点的海水、底泥以及野生土著矛尾复鰕虎鱼（Symechogobius hasta）肠道内容物样本, 采用高通量测序技术对样本进行16S扩增子测序, 研究分析各个样本组间的细菌群落组成差异.同时, 把矛尾复鰕虎鱼肠道内容物样本, 并捕捞该组样本的所在位点的海水和底泥样本进行宏基因组测序, 深入分析抗生素抗性基因的种类和分布特征, 研究微生物群落与抗性基因和抗性机制之间的关联性, 以期为海水养殖区域中微生物群落组成与抗性基因分布特征的研究提供理论基础.
1 材料与方法 1.1 样品采集昌黎县浅海扇贝筏式养殖起步于90年代初, 所在辖区的团林、大蒲河、刘台庄和茹菏等这4个沿海乡镇均有涉及, 2021年养殖规模曾达到4.33万hm2[16].随着近年产业发展和调整, 根据秦皇岛市人民政府公布信息, 目前昌黎县扇贝筏式养殖面积约106.67 km2, 养殖区域主要集中在滦河口、塔子口周边海域[17].基于此, 本研究针对滦河口、塔子口周边海域主要扇贝养殖海域, 依据《国家海洋监测规范》[18], 尽可能沿用历史测站, 照顾站位分布的均匀性, 遵循近岸密、远岸疏的测站布设原则, 在国家渔业资源环境秦皇岛观测实验站长期性、基础性监测站位中, 针对性围绕养殖区选择5个站位调查（图 1）. 5个样品采集点的具体坐标分别为S1：39°36'52.56″N, 119°20'43.44″E；S2：39°34'43.32″N, 119°25'32.16″E；S3：39°31'37.20″N, 119°32'16.44″E；S4：39°32'58.20″N, 119°19'05.52″E；S5：39°30'51.84″N, 119°24'07.20″E. 5个站位覆盖养殖面积为99.33 km2, 占该区域全部养殖海域的93.13%. 2022年3月, 在各位点分别采集海水和底泥样本各3份, 共计15份海水样本（每份10 L）, 15份底泥样本（每份两袋, 约2 kg）, 海水样本名称分别为：BDHW1、BDHW2、BDHW3、BDHW4和BDHW5；底泥样本名称分别为：BDHS1、BDHS2、BDHS3、BDHS4和BDHS5.样品采集方法依据《国家海洋监测规范》[18]执行, 其中海水样本利用Niskin采水器采集水下1 m表层水体, 海水样本置于无菌聚乙烯塑料桶中.底泥样本采用不锈钢抓斗式采泥器（德国HYDRO-BIOS公司：Van Veen采泥器）采集表层沉积物, 为防止样本相互污染, 选择采集底泥样本中心淤泥作为实验样本, 底泥样本置于无菌采样袋中.同时, 在S3位点捕捞矛尾复鰕虎鱼12条, 在无菌操作条件下剖开鱼的腹部, 取出肠道部分, 缓慢挤出所有肠道内容物, 置于15 mL无菌离心管中.将以上所有内容物全部混合均匀, 平均分成3等份, 置于干冰上保存, 矛尾复鰕虎鱼肠道内容物样本名称为BDHXHY.以上采集到的各样本均设置3个生物学重复.
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图 1 昌黎县养殖海域样品采集点位示意 Fig. 1 Sampling sites in the aquaculture area of Changli County |
随后, 把置于干冰上的鰕虎鱼肠道内容物和所有保存在4℃条件下的海水、底泥样本运送到实验室进行后续处理和分析.根据测序需求, 取各个位点的海水样本各500 mL, 经过0.22 μm孔径的无菌滤膜过滤后, 收集滤膜于50 mL无菌离心管中, 置于-80℃冰箱保存.各个位点的底泥样本称取20 g左右置于15 mL无菌离心管中, 置于-80℃冰箱保存.
1.2 样品核酸提取将以上所有预处理完毕的鰕虎鱼肠道内容物样品、海水过滤后的滤膜和底泥样品置于干冰上, 运送至北京诺禾致源科技股份有限公司进行核酸提取和测序工作.核酸提取后, 使用1%琼脂糖凝胶评估提取DNA的质量, 使用NanoPhotometer®分光光度计（IMPLEN, CA, USA）检测DNA纯度（D260/ D280和D260/ D230）.使用Qubit®2.0荧光计（Life Technologies, CA, USA）中的QubitA®dsDNA检测试剂盒测量DNA浓度.
核酸提取后, 分别构建宏基因组文库和16S扩增子文库, 然后按照Illumina NovaSeq6000平台的测序要求进行测序.原始数据上传至国家生物信息中心-国家基因组科学数据中心（National Genomics Data Center, China National Center for Bioinformation, CNCB-NGDC）的组学原始数据归档库（genome sequence archive, GSA）[19, 20]（GSA号：CRA009338和CRA009341）.
1.3 细菌群落结构分析根据Barcode序列和PCR扩增引物序列从下机数据中拆分出各样本数据, 截去Barcode和引物序列后使用FLASH（version 1.2.11）[21]软件对样本的reads进行拼接, Fastp[22]软件进行质控, 得到高质量的Clean Tags.最后使用Vsearch（version 2.22.1）[23]软件将Clean Tags与数据库进行比对以检测嵌合体并进行去除[24], 从而得到最终的有效数据, 即Effective Tags.使用QIIME2[25]软件中的DADA2模块进行降噪, 并过滤丰度小于5的序列, 从而获得最终的OTUs以及特征表.将得到的OTUs与Silva138.1数据库比对得到每个OTU的物种信息.使用QIIME2计算Shannon、Simpson和Chao1等指数, 使用PICRUSt2[26]（version 2.2.0）进行16S功能预测.
1.4 抗生素抗性基因分析使用Readfq（V8, https://github.com/NovogeneMicro/readfq.v8_meta）对测序原始数据进行预处理, 获取用于后续分析的有效数据（Clean Data）.使用MEGAHIT[27]软件（v1.0.4-beta）对Clean Data进行组装分析, 然后将组装得到的Scaffolds从N连接处打断, 得到不含N的Scaftigs.使用MetaGeneMark（V2.10, http://exon.gatech.edu/GeneMark/）对各样品的Scaftigs（≥500bp）进行ORF预测, 并过滤掉预测结果中长度小于100 nt的信息, 然后用CD-HIT[28]软件（V4.5.8）进行去冗余, 得到非冗余的初始gene catalogue.使用Bowtie 2[29]软件（V2.2.4）将各样品的Clean Data比对至初始的gene catalogue, 计算得到基因在各样品中比对上的reads数目, 过滤掉各个样品中reads数目≤2的基因, 获得最终用于后续分析的Unigenes.使用CARD数据库提供的RGI（resistance gene identifier）软件将Unigenes与CARD数据库（https://card.mcmaster.ca/）进行比对, 结合Unigenes丰度信息, 统计各ARGs的相对丰度, 绘制丰度柱形图.同时, 计算细菌门类与ARGs之间的Spearman相关系数, 网络分析图采用生科云的在线数据分析平台（http://www.bioincloud.tech/）进行绘制.
2 结果与讨论 2.1 秦皇岛昌黎县水产养殖海域细菌群落α多样性分析α多样性可以反映样本中微生物群落的多样性, 通过单样本的多样性分析可以反映样本内的微生物群落的丰富度和多样性.常用的α多样性指数有Good coverage、Chao1、Shannon和Pielou E等.由表 1可知, 所有样本的Good coverage指数均大于0.98, 表明样本中绝大部分的细菌均被检出, 本次测序结果可充分反映样本中细菌的真实情况.Chao1、Shannon和Pielou E指数分别用来描述群落样品中包含的物种丰富度、群落多样性和群落均匀度, 且指数值越大, 分别表示物种越丰富, 群落多样性越高, 群落越均匀.由Shannon指数可以看出各个采样位点的底泥中细菌群落多样性明显高于海水, Chao1指数和Pielou E指数表明各个采样位点底泥中细菌物种丰富度和细菌群落的均匀度均高于海水.分析各个采样位点距离海岸线的距离与样本中细菌群落的多样性发现, 无论是海水还是底泥样本, 随着位点与海岸线之间距离的延长, 样本中细菌丰富度（Chao1指数）和群落多样性（Shannon指数）均下降, 其中距离海岸线最远的S3位点样本（BDHW3和BDHS3）的细菌丰富度和群落多样性指数在同类样本中均是最小的.同样在S3位点采集到的矛尾复鰕虎鱼肠道内容物样本（BDHXHY）的Chao1和Shannon指数介于S3位点的海水（BDHW3）和底泥（BDHS3）样本之间, 说明该样本的细菌丰富度和群落多样性均高于S3位点处的海水样本, 低于底泥样本.
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表 1 细菌群落α多样性分析 Table 1 Analysis of bacterial community α diversity |
2.2 秦皇岛昌黎县水产养殖海域细菌群落组成分析
16S扩增子高通量测序结果表明, 33个样本共获得2 673 820个序列读长（reads）, 平均reads数量为81 025.所有reads可以聚类成10 086个细菌OTUs, 以上OTUs可以注释为54个门, 127个纲, 320个目, 515个科和974个属.在门分类水平上[图 2（a）], 变形菌门（Proteobacteria）、蓝藻细菌（Cyanobacteria）、泉古菌门（Crenarchaeota）、厚壁菌门（Firmicutes）、酸杆菌门（Acidobacteriota）、拟杆菌门（Bacteroidota）、放线菌门（Actinobacteriota）、脱硫菌门（Desulfobacterota）、绿弯菌门（Chloroflexi）和粘球菌门（Myxococcota）是在所有样本中丰度排名前10的优势细菌门类.海水中以变形菌门（Proteobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）和拟杆菌门（Bacteroidota）为主要优势菌门, 这3个门类的总丰度在所有海水样本中占比高达62%~83%, 这与已报道的中国其他海域中的细菌群落组成情况基本一致[30, 31].并且, 变形菌门和拟杆菌门是海洋异养细菌的两大优势类群[32], 可能参与了众多物质的生物化学循环过程[33].拟杆菌门是一类化能有机营养型的细菌, 广泛分布于海洋环境中, 擅长降解纤维素和果胶等聚合物, 具有重要的生态学功能.在海洋生态系统中的拟杆菌门类细菌, 可以降解大分子量溶解性有机质, 促进海洋的碳、氮、硫循环[34].此外, 在本次采样的部分海水样本中还有丰度比较高的蓝藻细菌（Cyanobacteria）.底泥中以变形菌门（Proteobacteria）、泉古菌门（Crenarchaeota）、酸杆菌门（Acidobacteriota）和放线菌门（Actinobacteriota）为主.本研究中, 泉古菌仅在底泥样本中被检测到, 相对丰度为12%~86%, 是古菌的一大分支, 包括很多超嗜热生物, 同时在某些海洋里的超微浮游生物中也占相当大的比例, 只是这部分微生物尚未成功培养.据报道, 泉古菌在地下放射性热泉的氮循环中扮演着非常重要的角色[35].矛尾复鰕虎鱼肠道内容物中的细菌群落组成是以变形菌门（Proteobacteria）、蓝藻细菌（Cyanobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）和拟杆菌门（Bacteroidota）为主.目前国内外关于矛尾复鰕虎鱼的研究还不多, 且主要集中在生殖力及营养价值方面[36], 本研究将为矛尾复鰕虎鱼肠道微生物组成的研究提供一定的数据支持.
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图 2 在门和属分类水平样本中细菌种群结构及其相对丰度 Fig. 2 Taxonomic diversity of bacterial communities among the samples at the phylum and genus level |
从图 2（b）属水平分析可知, 海水样品中的主要优势种属为中山菌属（Zhongshania sp.）、洛克氏菌（Yoonia-Loktanella sp.）、假单胞菌属（Pseudomonas sp.）和亚硫酸杆菌（Sulfitobacter sp.）.其中, 中山菌属在本研究中仅在海水样品中存在, 在底泥和矛尾复鰕虎鱼肠道内容物中均未发现.在底泥样品的微生物种属分布中, 则是以伍斯菌属（Woeseia sp.）、假单胞菌属（Pseudomonas sp.）和亚硝基古菌（Nitrosopumilus sp.）为主, 其中亚硝基古菌是本研究中仅在底泥中发现的种属.在矛尾复鰕虎鱼肠道内容物样品中, 气单胞菌属（Aeromonas sp.）、沃尔巴克氏体属（Wolbachia sp.）和假单胞菌属（Pseudomonas sp.）属于优势菌属, 并且气单胞菌和沃尔巴克氏体属在本研究中主要分布在鰕虎鱼肠道内容物中.已有国外研究发现, 丹麦虹鳟（Oncorhynchus mykiss）常检测到的气单胞菌具有抗土霉素与磺胺嘧啶/甲氧苄氨嘧啶基因的联合抗性[37].Čížek等[38]也从鲤鱼（Cyprinus carpio）皮肤中分离培养出了具有多重耐药的气单胞菌.气单胞菌本不是鱼类和人类的致病菌, 但却可以通过水平基因转移的方式将ARGs转移到致病菌中, 最终影响鱼类和人体的健康.
2.3 秦皇岛昌黎县水产养殖海域细菌群落功能预测使用PICRUSt2软件预测秦皇岛昌黎县水产养殖海域中细菌群落的功能基因组成, 分析发现在海水、底泥和矛尾复鰕虎鱼等不同类的样本间细菌群落功能类别非常相似.COG注释结果表明, 所有样本中的细菌群落功能主要包括：糖基转移酶（glycosyltransferase）、信号转导组氨酸激酶（signal transduction histidine kinase）、NAD（P）-依赖性脱氢酶[NAD（P）-dependent dehydrogenase]、DNA结合转录调节因子（DNA-binding transcriptional regulator）、2-琥珀酸-6-羟基-2, 4-环己二烯-1-羧酸合成酶MenH和相关酯酶（2-succinyl-6-hydroxy-2, 4-cyclohexadiene-1-carboxylate synthase MenH and related esterases）、DNA结合反应调节因子（DNA-binding response regulator）、核苷二磷酸糖差向异构体（nucleoside-diphosphate-sugar epimerase）、阿拉伯糖外排渗透酶（arabinose efflux permease）、DNA介导的RNA聚合酶（DNA-directed RNA polymerase）和DNA结合蛋白（DNA-binding protein）[图 3（a）].MetaCyc代谢途径注释发现, 细菌群落功能主要与有氧呼吸Ⅰ（aerobic respiration Ⅰ）、丙酮酸发酵生成异丁醇（pyruvate fermentation to isobutanol）、L-异亮氨酸生物合成途径Ⅱ（L-isoleucine biosynthesis Ⅱ）、弓形虫生物合成途径（gondoate biosynthesis）、L-缬氨酸生物合成途径（L-valine biosynthesis）、L-异亮氨酸生物合成途径Ⅰ（L-isoleucine biosynthesis Ⅰ）、支链氨基酸生物合成的超途径（superpathway of branched chain amino acid biosynthesis）、饱和脂肪酸链延长（saturated fatty acid elongation）、顺式vaccenate生物合成途径（cis-vaccenate biosynthesis）和甲苯降解途径Ⅰ（toluene degradation Ⅰ）有关[图 3（b）].整体来看, 秦皇岛昌黎县水产养殖海域中细菌群落在多种化合物的生物合成途径中扮演着非常重要的角色, 促进了海洋系统内部的能量传递和物质代谢过程.
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图 3 不同组样品细菌的COG功能预测和MetaCyc代谢途径预测 Fig. 3 COG function prediction and MetaCyc metabolic pathways prediction of bacterial communities |
本研究采用宏基因组测序方法, 对距离海岸线最远, 受人类活动影响最小的S3位点的海水BDHW3（3个重复分别为BDHW3.1、BDHW3.2和BDHW3.3）、底泥BDHS3（3个重复分别为BDHS3.1、BDHS3.2和BDHS3.3）和矛尾复鰕虎鱼肠道内容物BDHXHY（3个重复分别为BDHXHY.1、BDHXHY.2和BDHXHY.3）样本进行分析, 其中丰度排名前20的ARG种类如图 4所示.在丰度最高的20种ARGs中, 有5种ARGs属于多重耐药菌, 包括smeE、adeF、ermW、mexB和mexQ.β-内酰胺类ARGs（blaOXA-325、cepS、blaCARB-20、blaOXA-55和blaTRU-1）有5个, 氨基糖苷类ARGs[aac（6'）-IIb、amrA、aac（6'）-Ie-aph（2″）-Ia和aph（3'）-Vc]有4个.在有关我国水产养殖环境的报道中, β-内酰胺类ARGs的研究报道相对较少, 而在韩国沿海养殖场中已经检测到该类ARGs的存在[39, 40].事实上, 关于β-内酰胺类ARGs的相关研究是不可忽视的重要内容.四环素类、大环内酯类以及喹诺酮类等抗生素抗性基因在本研究发现较少.其中多数报道均显示, 四环素类ARGs在水产养殖环境中具有较高丰度[41], 而在本研究中仅在矛尾复鰕虎鱼肠道内容物中检测到了丰度较高的tetQ, 说明该养殖海域的ARGs赋存特征与之前报道的各类养殖海域之间存在一定差异.另外一些常用消毒剂、防腐剂的抗性基因（triC和qacH）等也在本研究中被检测到, 这一结果在以往报道中较少涉及.
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图 4 抗生素抗性基因相对丰度 Fig. 4 Relative abundance of antibiotic resistance gene |
有研究表明, ARGs会随着微生物群落的改变而改变[42], ARGs的减少一般与细菌群落的减少呈正相关.在本研究中底泥比海水和矛尾复鰕虎鱼肠道内容物都具有更丰富的细菌群落, 但底泥中ARGs的相对丰度比海水和矛尾复鰕虎鱼肠道内容物都要低, 这表明载体富集细菌群落时并没有促进底泥中ARGs丰度的升高, 这与已报道的污水处理厂中细菌群落与ARGs的关系相似[43].
2.5 秦皇岛昌黎县水产养殖海域细菌群落与ARGs间的关系S3位点的海水BDHW3、底泥BDHS3和矛尾复鰕虎鱼肠道内容物BDHXHY样本与ARGs之间的共现网络分析如图 5所示, 图中展示了丰度排名前5位的ARGs与丰度排名前20的门水平的微生物之间的相关性, 连接线表示节点与节点之间具有显著相关性（Spearman相关系数 > 0.7, 显著性P < 0.05）, 红色线条代表节点相关度最高, 绿色线条代表节点相关度最低, 节点的大小与节点间的显著相关程度成正比.
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图 5 门水平细菌群落与ARGs的网络分析 Fig. 5 Network analysis between microbial communities at phylum level and ARGs |
由图 5可知, 样本中丰度较高的ARGs如triC与放线菌门（Actinobacteria）, smeE与拟杆菌门（Bacteroidetes）, blaOXA-325与酸杆菌门等呈显著正相关关系, 这表明以上微生物可能是对应ARGs的潜在宿主.当同一种抗性基因与多个门水平的微生物存在相关性时, 意味着这种抗性基因可能有多个潜在宿主[44].tetQ、smeE和blaOXA-325是连接度较高的ARGs, 表明这些抗性基因可以在多种微生物之间进行传递.其中, smeE可以对四环素类、大环内酯类等多种类型的抗生素具有抗药性, 这种多重耐药基因的广泛传播会对人类健康产生一定的威胁[45].
3 结论（1）距离海岸线最远的S3位点的海水和底泥样本中, 细菌物种丰富度和群落多样性均是同类载体中最低的, 并且越靠近海岸线, 物种丰富度和群落多样性越高, 表明人类活动可能对开放海域中的微生物物种多样性和群落组成带来了一定影响, 近海区由于受人类活动影响更大, 故微生物多样性也更加丰富.
（2）细菌群落结构上, 海水样品中以变形菌门（Proteobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）和拟杆菌门（Bacteroidetes）为主要优势菌门；底泥样品中以变形菌门（Proteobacteria）、泉古菌门（Crenarchaeota）、酸杆菌门（Acidobacteria）和放线菌门（Actinobacteria）为主；矛尾复鰕虎鱼肠道内容物以变形菌门（Proteobacteria）、蓝藻细菌（Cyanobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）和拟杆菌门（Bacteroidetes）为主.
（3）秦皇岛昌黎县水产养殖海域中细菌的功能以新陈代谢, 初级和次级代谢产物生物合成等生化反应过程为主, 说明海洋环境中的微生物特别是细菌在海洋系统内部的能量传递和物质代谢过程中扮演着非常重要的角色.
（4）微生物是ARGs存在和传播的重要载体, S3位点的海水、底泥和矛尾复鰕虎鱼肠道内容物样本中ARGs丰度最高的是triC、smeE、edeQ、tetQ和blaOXA-325等, 其中tetQ、smeE和blaOXA-325是潜在宿主种类最多的3种ARGs.
| [1] | Khardori N, Stevaux C, Ripley K. Antibiotics: from the beginning to the future: part 2[J]. Indian Journal of Pediatrics, 2020, 87(1): 43-47. DOI:10.1007/s12098-019-03113-0 |
| [2] | Khardori N, Stevaux C, Ripley K. Antibiotics: from the beginning to the future: part 1[J]. Indian Journal of Pediatrics, 2020, 87(1): 39-42. DOI:10.1007/s12098-019-03087-z |
| [3] | Reis A C, Kolvenbach B A, Nunes O C, et al. Biodegradation of antibiotics: the new resistance determinants - part Ⅰ[J]. New Biotechnology, 2020, 54: 34-51. DOI:10.1016/j.nbt.2019.08.002 |
| [4] | Reis A C, Kolvenbach B A, Nunes O C, et al. Biodegradation of antibiotics: the new resistance determinants-part Ⅱ[J]. New Biotechnology, 2020, 54: 13-27. DOI:10.1016/j.nbt.2019.08.003 |
| [5] | Nava A R, Daneshian L, Sarma H. Antibiotic resistant genes in the environment-exploring surveillance methods and sustainable remediation strategies of antibiotics and ARGs[J]. Environmental Research, 2022, 215. DOI:10.1016/j.envres.2022.114212 |
| [6] | Zainab S M, Junaid M, Xu N, et al. Antibiotics and antibiotic resistant genes (ARGs) in groundwater: a global review on dissemination, sources, interactions, environmental and human health risks[J]. Water Research, 2020, 187. DOI:10.1016/j.watres.2020.116455 |
| [7] | Zhang R, Yang S, An Y W, et al. Antibiotics and antibiotic resistance genes in landfills: a review[J]. Science of the Total Environment, 2022, 806. DOI:10.1016/j.scitotenv.2021.150647 |
| [8] | Pan X, Qiang Z M, Ben W, et al. Residual veterinary antibiotics in swine manure from concentrated animal feeding operations in Shandong Province, China[J]. Chemosphere, 2011, 84(5): 695-700. DOI:10.1016/j.chemosphere.2011.03.022 |
| [9] | Suzuki S, Nakanishi S, Tamminen M, et al. Occurrence of sul and tet(M) genes in bacterial community in Japanese marine aquaculture environment throughout the year: profile comparison with Taiwanese and Finnish aquaculture waters[J]. Science of the Total Environment, 2019, 669: 649-656. DOI:10.1016/j.scitotenv.2019.03.111 |
| [10] | Wu J J, Su Y L, Deng Y Q, et al. Prevalence and distribution of antibiotic resistance in marine fish farming areas in Hainan, China[J]. Science of the Total Environment, 2019, 653: 605-611. DOI:10.1016/j.scitotenv.2018.10.251 |
| [11] |
李云莉, 高权新, 张晨捷, 等. 养殖水域抗生素抗性基因污染的研究概况与展望[J]. 海洋渔业, 2017, 39(3): 351-360. Li Y L, Gao Q X, Zhang C J, et al. Current status and prospect ofantibiotic resistance genes (ARGs) pollution in the aquaculture[J]. Marine Fisheries, 2017, 39(3): 351-360. DOI:10.3969/j.issn.1004-2490.2017.03.013 |
| [12] |
赵旺, 黄星美, 邓正华, 等. 夏季美济礁潟湖养殖区海水细菌多样性及其与环境因子的相关性[J]. 中国水产科学, 2022, 29(5): 720-731. Zhao W, Huang X M, Deng Z H, et al. Analysis of bacterial diversity and correlation with environmental factors in the aquaculture area of Mischief Reef Lagoon in summer[J]. Journal of Fishery Sciences of China, 2022, 29(5): 720-731. |
| [13] | Biller S J, Berube P M, Dooley K, et al. Marine microbial metagenomes sampled across space and time[J]. Scientific Data, 2018, 5. DOI:10.1038/sdata.2018.176 |
| [14] | Zhang X X, Xu W, Liu Y, et al. Metagenomics reveals microbial diversity and metabolic potentials of seawater and surface sediment from a Hadal Biosphere at the Yap Trench[J]. Frontiers in Microbiology, 2018, 9. DOI:10.3389/fmicb.2018.02402 |
| [15] | Nikaido H. Multidrug resistance in bacteria[J]. Annual Review of Biochemistry, 2009, 78: 119-146. DOI:10.1146/annurev.biochem.78.082907.145923 |
| [16] | 张丽敏. 昌黎县扇贝养殖业现状及发展策略[J]. 河北渔业, 2013(7): 60-61. DOI:10.3969/j.issn.1004-6755.2013.07.028 |
| [17] | 秦皇岛市人民政府. 河北昌黎: 扇贝"肥美"上市渔民"点海成金"[EB/OL]. http://mail.qhd.gov.cn/front_pcthi.do?uuid=2DE30BC98D5E5B2EE7B46ED49770E3D8, 2022-11-08. |
| [18] | GB 17378.1-2007, 海洋监测规范 第1部分: 总则[S]. |
| [19] | . Database resources of the national genomics data center, China national center for bioinformation in 2022[J]. Nucleic Acids Research, 2022, 50(D1): D27-D38. DOI:10.1093/nar/gkab951 |
| [20] | Chen T T, Chen X, Zhang S S, et al. The genome sequence archive family: toward explosive data growth and diverse data types[J]. Genomics, Proteomics & Bioinformatics, 2021, 19(4): 578-583. |
| [21] | Magoč T, Salzberg S L. FLASH: fast length adjustment of short reads to improve genome assemblies[J]. Bioinformatics, 2011, 27(21): 2957-2963. DOI:10.1093/bioinformatics/btr507 |
| [22] | Chen S F, Zhou Y Q, Chen Y R, et al. fastp: an ultra-fast all-in-one FASTQ preprocessor[J]. Bioinformatics, 2018, 34(17): i884-i890. DOI:10.1093/bioinformatics/bty560 |
| [23] | Rognes T, Flouri T, Nichols B, et al. VSEARCH: a versatile open source tool for metagenomics[J]. PeerJ, 2016, 4. DOI:10.7717/peerj.2584 |
| [24] | Haas B J, Gevers D, Earl A M, et al. Chimeric 16S rRNA sequence formation and detection in Sanger and 454-pyrosequenced PCR amplicons[J]. Genome Research, 2011, 21(3): 494-504. DOI:10.1101/gr.112730.110 |
| [25] | Hall M, Beiko R G. 16S rRNA gene analysis with QIIME2[A]. In: Beiko R G, Hsiao W, Parkinson J (Eds.). Microbiome Analysis: Methods and Protocols[M]. New York: Humana Press, 2018. 113-129. |
| [26] | Douglas G M, Maffei V J, Zaneveld J R, et al. PICRUSt2 for prediction of metagenome functions[J]. Nature Biotechnology, 2020, 38(6): 685-688. DOI:10.1038/s41587-020-0548-6 |
| [27] | Li D H, Liu C M, Luo R B, et al. MEGAHIT: an ultra-fast single-node solution for large and complex metagenomics assembly via succinct de Bruijn graph[J]. Bioinformatics, 2015, 31(10): 1674-1676. DOI:10.1093/bioinformatics/btv033 |
| [28] | Fu L M, Niu B F, Zhu Z W, et al. CD-HIT: accelerated for clustering the next-generation sequencing data[J]. Bioinformatics, 2012, 28(23): 3150-3152. DOI:10.1093/bioinformatics/bts565 |
| [29] | Langmead B, Salzberg S L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2[J]. Nature Methods, 2012, 9(4): 357-359. DOI:10.1038/nmeth.1923 |
| [30] | Wang C, Chuprom J, Wang Y, et al. Beneficial bacteria for aquaculture: nutrition, bacteriostasis and immunoregulation[J]. Journal of Applied Microbiology, 2020, 128(1): 28-40. DOI:10.1111/jam.14383 |
| [31] | Xu C Y, Lv Z Q, Shen Y B, et al. Metagenomic insights into differences in environmental resistome profiles between integrated and monoculture aquaculture farms in China[J]. Environment International, 2020, 144. DOI:10.1016/j.envint.2020.106005 |
| [32] |
赵秀, 胡晓娟, 任丽娟, 等. 汕头南澳海域龙须菜栽培系统细菌群落结构特征[J]. 中国水产科学, 2022, 29(9): 1312-1325. Zhao X, Hu X J, Ren L J, et al. Characteristics of bacterial community structure in the cultivation system of Gracilaria lemaneiformis in the Nan'ao area, Shantou[J]. Journal of Fishery Sciences of China, 2022, 29(9): 1312-1325. |
| [33] |
徐秋鸿, 刘曙光, 娄厦, 等. 长江口近岸地区抗生素抗性基因与微生物群落分布特征[J]. 环境科学, 2023, 44(1): 158-168. Xu Q H, Liu S G, Lou X, et al. Distributions of antibiotic resistance genes and microbial communities in the nearshore area of the Yangtze River Estuary[J]. Environmental Science, 2023, 44(1): 158-168. |
| [34] |
尹霞, 许晓晴, 王勋功, 等. 潮汐作用对黄河口滨海浅层地下水细菌群落结构的影响[J]. 海洋环境科学, 2022, 41(4): 526-533. Yin X, Xu X Q, Wang X G, et al. Tide effects on bacterial community structure in the shallow groundwater from Yellow River Estuary[J]. Marine Environmental Science, 2022, 41(4): 526-533. |
| [35] | Weidler G W, Gerbl F W, Stan-Lotter H. Crenarchaeota and their role in the nitrogen cycle in a subsurface radioactive thermal spring in the Austrian Central Alps[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2008, 74(19): 5934-5942. DOI:10.1128/AEM.02602-07 |
| [36] |
潘鑫伟, 尹增强, 李效恒. 唐山海洋牧场附近海域矛尾鰕虎鱼生长特征与资源利用[J]. 安徽农学通报, 2020, 26(2-3): 81-85. Pan X W, Yin Z Q, Li X H. The growth characteristics and resource assessment of Chaeturichthys stigmatias Richardson in marine ranch area of Tangshan[J]. Anhui Agricultural Science Bulletin, 2020, 26(2-3): 81-85. |
| [37] | Schmidt A S, Bruun M S, Dalsgaard I, et al. Incidence, distribution, and spread of tetracycline resistance determinants and integron-associated antibiotic resistance genes among motile aeromonads from a fish farming environment[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2001, 67(12): 5675-5682. DOI:10.1128/AEM.67.12.5675-5682.2001 |
| [38] | Čížek A, Dolejská M, Sochorová R, et al. Antimicrobial resistance and its genetic determinants in aeromonads isolated in ornamental (koi) carp (Cyprinus carpio koi) and common carp (Cyprinus carpio)[J]. Veterinary Microbiology, 2010, 142(3-4): 435-439. DOI:10.1016/j.vetmic.2009.10.001 |
| [39] | Huang L, Xu Y B, Xu J X, et al. Antibiotic resistance genes (ARGs) in duck and fish production ponds with integrated or non-integrated mode[J]. Chemosphere, 2017, 168: 1107-1114. DOI:10.1016/j.chemosphere.2016.10.096 |
| [40] | Jang H M, Kim Y B, Choi S, et al. Prevalence of antibiotic resistance genes from effluent of coastal aquaculture, South Korea[J]. Environmental Pollution, 2018, 233: 1049-1057. DOI:10.1016/j.envpol.2017.10.006 |
| [41] |
李十盛, 高会, 赵富强, 等. 水产养殖环境中抗生素抗性基因的研究进展[J]. 中国环境科学, 2021, 41(11): 5314-5325. Li S S, Gao H, Zhao F Q, et al. Research progress on the occurrence and influencing factors of antibiotic resistance genes in aquaculture environment[J]. China Environmental Science, 2021, 41(11): 5314-5325. DOI:10.3969/j.issn.1000-6923.2021.11.040 |
| [42] | Zhao Q, Guo W Q, Luo H C, et al. Deciphering the transfers of antibiotic resistance genes under antibiotic exposure conditions: driven by functional modules and bacterial community[J]. Water Research, 2021, 205. DOI:10.1016/j.watres.2021.117672 |
| [43] |
杜文琰, 姚俊芹, 马辉英, 等. 寒冷地区IFAS+磁混凝污水厂菌群结构和抗生素抗性基因分析[J]. 环境科学, 2022, 43(11): 5123-5130. Du W Y, Yao J Q, Ma H Y, et al. Bacterial community structure and antibiotic resistance gene changes in IFAS+magnetic coagulation process wastewater treatment plant in cold regions[J]. Environmental Science, 2022, 43(11): 5123-5130. |
| [44] |
王龙飞, 程逸群, 胡晓东, 等. 江苏省代表性水源地抗生素及抗性基因赋存现状[J]. 环境科学, 2021, 42(2): 749-760. Wang L F, Cheng Y Q, Hu X D, et al. Occurrence of antibiotics and antibiotic resistance genes in representative drinking water resources in Jiangsu Province[J]. Environmental Science, 2021, 42(2): 749-760. |
| [45] |
陈红玲, 张兴桃, 王晴, 等. 宏基因组方法分析医药化工废水厂中抗生素耐药菌及耐性基因[J]. 环境科学, 2020, 41(1): 313-320. Chen H L, Zhang X T, Wang Q, et al. Metagenomic analysis of antibiotic resistant bacteria and resistance genes in a pharmaceutical and chemical wastewater treatment plant[J]. Environmental Science, 2020, 41(1): 313-320. |