2023, Vol. 44
2. 中国科学院、水利部成都山地灾害与环境研究所, 山地表生过程与生态调控重点实验室, 成都 610041
2. Key Laboratory of Mountain Surface Processes and Ecological Regulation, Institute of Mountain Hazards and Environment, Chinese Academy of Sciences and Ministry of Water Resources, Chengdu 610041, China
抗生素因其高效的抑菌功能而在临床上被广泛运用, 被认为是人类医学上的伟大革命[1]. 但随着抗生素的大规模使用, 带来的问题也愈发严重, 其中最突出的便是抗生素耐药性问题[2]. 残留在环境中的抗生素会诱导细菌产生耐药性, 促使抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes, ARGs)在不同环境中传播与扩散[3, 4]. 环境微生物中的ARGs能借助整合子、转座子和质粒进行水平迁移[5], 甚至转移到一些致病菌中, 进而对公众健康造成威胁[6]. ARGs已被认为是一种新型的环境污染物[7, 8].
土壤是ARGs重要的储存库, 同时也是ARGs传播的主要媒介[9, 10]. ARGs可以通过含ARGs的有机肥施用和污水灌溉等方式进入土壤环境中[11~14]. 例如, 对宁夏某养牛场施用牛粪土壤的研究发现, ARGs的相对丰度显著高于养牛场周边土壤[15]. 然而, 土壤中抗性基因并不完全来自于外源输入. 有学者在3万年前的冻土中检测到β-内酰胺类、四环素类和万古霉素类抗性基因[16]. 在北极土壤中也检测到了131种抗性基因[17]. 在受人为活动影响较弱的林地土壤中检测到160个抗性基因[18]. 在基本无人类活动干扰的冻土层中也可检测到多种新型β-内酰胺类抗性基因[19]. 以上结果都表明ARGs天然存在于土壤中, 称之为固有抗性[20]. 土壤中固有ARGs的存在证明耐药性并非是由于现代临床使用抗生素而产生, 这也使得人们对抗生素和抗生素耐药性之间相互关系的理解更加复杂[21]. 因此, 开展土壤固有抗性研究有助于深入认识抗生素耐药性的形成和发展. 农用地土壤中的ARGs与人类健康和食品安全息息相关, 因而受到广泛关注[22~24]. 目前, 对施用粪肥和中水回用的土壤中ARGs的分布特征已有大量研究. 然而, 对于农用地中, 特别是不同类型农用地土壤中抗性基因的背景水平还鲜见报道.
本文选取高垦殖丘陵区长期施用化肥或农作物秸秆的农用地作为研究对象, 采用高通量荧光定量PCR技术分析3种不同类型农用地土壤中固有ARGs的丰度和多样性, 比较抗性基因间的差异, 并评估土地利用类型对土壤中ARGs的影响, 以期为ARGs在土壤中的分布和传播研究提供基础依据.
1 材料与方法 1.1 样点及样品采集研究区位于四川省绵阳市盐亭县, 根据当地的土地利用情况, 选取3种常见的农用地类型(菜地、果园以及耕地)作为研究对象, 每种农用地选择3块样地采集土壤样品. 菜地和果园均为当地农户的土地, 种植年限均超过6 a. 菜地以施用草木灰和化肥为主, 几乎不施用粪肥. 果园为柚子林, 施肥方式为树间填埋玉米秸秆. 耕地为中国科学院盐亭紫色土生态试验站内长期施用化肥样地(始于2013年). 研究区以雨养农业为主[25, 26], 果园与耕地不另行灌溉, 采样菜地的主要灌溉用水为井水. 在每处样地, 随机选取5个样点采集0~10 cm的表层土壤样品, 充分混合作为该样地的代表样品, 置于冰盒内带回实验室. 土壤样品分为两份, 一份风干后用于理化性质分析, 另一份保存于-20℃冰箱中用于基因组DNA提取.
1.2 土壤理化性质测定样品的pH值使用pH计测定(土壤∶水=1∶5). 铵态氮(NH4+-N)和硝态氮(NO3--N)含量采用氯化钾浸提, 分光光度法测定. 有效磷(AP)含量采用碳酸氢钠浸提, 钼锑抗比色法测定. 总磷(TP)含量采用硫酸-高氯酸消煮, 钼锑抗比色法测定. 总氮(TN)含量采用凯氏定氮法测定. 土壤有机质(SOM)含量采用重铬酸钾氧化法测定. 每个样品均做3次重复实验. 土壤基本理化性质见表 1.
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表 1 土壤样品的基本理化性质1) Table 1 Basic properties of soil samples |
1.3 DNA提取
称取0.25 g土壤, 选用Power Soil DNA Kit试剂盒(Mo Bio Laboratories, USA)按照说明书的步骤提取样品的基因组DNA, 并用1%的琼脂糖凝胶进行电泳检测. 采用超微量分光光度计(ND-1000, NanoDrop Technologies Inc., DE, 美国)检测DNA的浓度. 将DNA样品用无菌水统一稀释至20 ng·μL-1后置于-20℃冰箱冷冻保存待测.
1.4 抗生素抗性基因检测采用高通量荧光定量PCR(high-throughput QPCR, HT-QPCR)反应平台(SmartChip Real-time PCR system, Wafergen Inc., 美国)检测样品中ARGs的多样性和丰度. 共选取296对引物, 包括285对用于检测ARGs, 10对检测MGEs和1对检测16S rRNA的引物[27]. 扩增程序为: 95℃预变性10 min; 95℃变性30 s, 60℃退火30 s, 共40个循环; 熔解曲线由Wafergen软件自动运行生成. 反应结束后, 通过Cycler预设的筛选条件为: 扩增效率90% ~110%及熔解曲线单峰, 将QPCR的数据进行导出. 根据仪器的性能, 设定CT值31为仪器的检测限. 每个样品进行3次技术重复, 当3次重复的CT值均被有效检出时认定样品是有效的阳性扩增.
1.5 数据分析样品中ARGs相对丰度的计算公式如下:
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HT-QPCR的数据通过Excel 2010进行计算. 采用R 3.6.3的vegan数据包进行主坐标分析(principal coordinate analysis, PCoA). 采用IBM SPSS 23.0进行相关分析和单因素方差分析. 图片采用R软件的ggplot2包和pheatmap包, 以及Origin 2021软件进行绘制.
2 结果与讨论 2.1 高垦殖丘陵区农用地土壤中抗生素抗性基因的赋存特征3种农用地土壤中ARGs的相对丰度如图 1(a)所示. 样品中各类型基因的相对丰度(以copies/16S rRNA计, 下同)范围为0.000 1~0.041 2. 在所有样品中, β-内酰胺类抗性基因的相对丰度最高, 达到了0.002 3~0.041 2, 氟喹诺酮类/氯霉素类/胺酰醇类抗性基因(fluoroquinolone/chloramphenicol/amphenicol, FCA)次之, 为0~0.027 8, 而磺胺类抗性基因的相对丰度最低, 仅为0~0.001 2. 在3种农用地土壤中, MGEs的相对丰度达到了0.061 7, 仅次于β-内酰胺类抗性基因, 由此推测农用地土壤中ARGs发生水平迁移的可能性较大.
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图 1 不同类型农用地土壤中抗生素抗性基因和可移动基因元件的相对丰度和种类数 Fig. 1 Relative abundances and numbers of ARGs and MGEs in different types of agricultural soil |
如图 2(a)结果显示, 高垦殖丘陵区农用地土壤中共检测到70种抗性基因, 主要由多重耐药类(24.29%)、β-内酰胺类(21.43%)、MLSB类(15.71%)、四环素类(12.86%)和氨基糖苷类(11.43%)抗性基因组成. 从抗性机制来看, 抗生素失活机制(38.57%)和外排泵机制(41.43%)是农用地土壤中ARGs主要的抗性机制[图 2(b)]. 对于外排泵机制, 多重耐药类抗性基因占绝大多数. 对湖南祁阳红壤中ARGs的调查发现[28], 多重耐药类抗性基因分别占不施肥处理土壤和施化肥与秸秆土壤抗性基因总丰度的83.50%和55.20%. 未受污染的南极冻土层中检测到的177种固有ARGs中大部分为多重耐药类抗性基因[29]. 通过外排泵机制, 微生物可以将细胞内的多种抗生素排出胞外, 因此是适应抗生素胁迫下的最直接有效的途径[30].
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图 2 抗生素抗性基因种类型 Fig. 2 Profile of detected antibiotic resistance genes |
有研究发现, 长期施用猪粪、鸡粪和牛粪土壤中ARGs的多样性(140种ARGs)和丰度(最高0.369)保持在较高水平[31]. 对长江三角洲农田土壤的调查指出, 土壤中ARGs的相对丰度最高可达0.231, 主要来源是污水灌溉及粪肥施用[32]. 这些结果均高于本研究中的数值, 其原因可能有两方面. 首先, 粪肥和污水的土地利用会将残留在其中的抗生素和ARGs引入土壤, 增加土壤微生物的选择压力[1]. 其次, 粪肥和污水改善土壤的养分条件, 促进土著微生物的生长, 从而提升土壤固有抗性基因的水平[33~35]. 因此, 本研究与已有研究农用地土壤施肥类型的不同可能是造成上述结果差别的主要原因.
2.2 农用地类型对土壤中抗生素抗性基因的影响3个样地中, 果园土壤的ARGs相对丰度最高, 达到0.132 9, 其次是菜地(0.110 4)和耕地(0.010 3). 从基因相对丰度占比来看, 菜地和果园土壤中β-内酰胺类抗性基因占比最高, 而在耕地中则以氨基糖苷类抗性基因占比最高. 不同土壤中抗性基因的检出数量变化趋势与其相对丰度相似, 也表现为: 果园(57)>菜地(29)>耕地(18)[图 1(b)]. 有研究发现, 作物种类会对农田土壤的ARGs的赋存特征产生影响[36]. 相似地, 对太湖流域不同农用地的调查结果表明, 果园土壤中ARGs的数量和丰度明显高于稻-麦轮作的耕地土壤[37].
对不同ARGs亚型相对丰度进行分析, 结果表明, 不同土壤样品中ARGs组成各有差异(图 3). 3种类型土壤中共有的优势ARGs亚型为aacC(氨基糖苷类)、ampC-04(β-内酰胺类)、blaSHV-01(β-内酰胺类)、tetD-02(四环素类)和tetPB-02(四环素类)基因. 菜地和果园土壤中, 以cphA-01和cmx(A)基因的相对丰度最高, 分别占ARGs总丰度的47.04%和46.15%. 而在耕地土壤中, 优势ARGs则主要以aacC基因为主, 其丰度达到0.003 7, 占ARGs总丰度的35.58%.
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图 3 不同类型农用地土壤中抗生素抗性基因亚型的相对丰度热图 Fig. 3 Heatmap showing the relative abundance of ARGs subtypes in different types of agricultural soil samples |
相比菜地和耕地土壤, 本研究中果园土壤检出了更丰富的ARGs, 这可能与不同土壤的养分条件差异有关. 例如, 对美国某长期添加牛粪草地的研究发现, 动物是否饲喂抗生素对施用其粪便的土壤中抗性基因的组成没有影响[21]. 此外, 有研究发现NH4+-N和NO3--N含量升高会引起土壤中ARGs丰度的增加[38]. 以上结果表明土壤养分条件可能是影响土壤ARGs水平的重要因子[39]. Pearson相关分析的结果表明(表 2), 土壤中不同类型抗性基因的相对丰度及其总丰度与土壤生源要素含量之间存在显著的正相关关系(P＜0.05), 而与土壤pH值显著负相关(P＜0.05). 方差分析的结果表明(表 1), 果园土壤的pH值显著低于其他两种土壤, 而不同土壤的NO3--N、AP、SOM和TP含量呈现相反的趋势(P＜0.05). 因此, 果园土壤中较高的养分含量可能是果园土壤中ARGs水平高于菜地和耕地土壤的原因之一.
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表 2 抗生素抗性基因与土壤基本理化性质和可移动基因元件的相关关系1) Table 2 Correlation of ARGs with basic properties of soil samples and MGEs |
采用主坐标分析法分析本研究中3种农用地土壤的ARGs分布情况, 结果显示, 第一轴和第二轴的解释量分别为84.22%和6.61% [图 4(a)]. 3种农用地土壤在排序图上按照农用地类型有明显的聚类. 此外, 在排序图上耕地土壤与菜地和果园土壤距离较远, 说明耕地土壤中ARGs的分布特征与其他两种土壤具有明显差别. 为了进一步探明3种农用地土壤中抗性基因的关系, 绘制了韦恩图, 如图 4(b)所示, 结果表明在所有检测到的ARGs中3种农用地的共有基因只有5种, 果园独有的基因最多, 占果园检出数的64.15%.
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图 4 不同类型农用地土壤中抗生素抗性基因的主坐标分析和韦恩图分析 Fig. 4 PCoA analysis and Venn diagram analysis of ARGs in the soil samples of different types of agricultural land |
目前, 环境中ARGs风险评估尚未有成熟的方法. 本研究参考已报道的方法[40], 以ARGs的可移动性来评估其风险性. 有研究发现[41~43], 土壤环境中ARGs与MGEs之间存在着较强的相关性, 表明ARGs存在水平转移的可能[44, 45]. 因此, 本研究采用ARGs与MGEs之间的相关关系来评估不同土壤中ARGs的迁移风险. 为了在同一水平上表征不同农用地土壤ARGs的风险性, 本文选取5种共有ARGs亚型进行分析. 如表 3所示, 菜地和耕地土壤中5种ARGs与MGEs之间均无显著的相关关系. 而在果园土壤样品中, ampC-04基因和转座子tnpA-05基因呈显著正相关. 此外, tnpA-05基因还与tetD-02和tetPB-02基因呈极显著正相关(P＜0.01). 这些结果说明果园土壤中ARGs的风险性强于菜地和耕地土壤.
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表 3 不同土壤中MGEs亚型与共有ARGs亚型的相关性1) Table 3 Relationships between MGEs and shared ARG subtypes |
进一步的相关分析表明, 土壤中MGEs的相对丰度与β-内酰胺类、FCA类、多重耐药类、其他类耐药基因相对丰度以及耐药基因总丰度存在显著的正相关关系(表 2), 这说明高垦殖丘陵区农用地土壤中ARGs发生水平迁移的潜在可能性较大. 然而考虑到所取样点较少, 以及不同类型的农用地土壤的养分条件、细菌群落组成和人为干预程度不同, 上述结果是否具有普遍性需以更多类型的农用地为研究对象加以验证.
3 结论(1) 高垦殖丘陵区农用地土壤中抗生素抗性基因主要类型为多重耐药类、β-内酰胺类、MLSB类、四环素类和氨基糖苷类抗性基因, 抗生素失活和外排泵机制是其主要的抗性机制.
(2) 果园土壤中抗生素抗性基因丰度和数量均高于菜地和耕地, 可能与土壤本身养分条件有关. 同时, 果园土壤中抗生素抗性基因的迁移风险性也高于其他两种农用地.
(4) 可移动基因元件与抗生素抗性基因之间有显著的正相关关系, 高垦殖丘陵区农用地土壤中较高的可移动基因元件丰度可能促进了抗生素抗性基因的水平转移.
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