2022, Vol. 43
2. 吉林大学地下水资源与环境教育部重点实验室, 长春 130012
2. Key Laboratory of Groundwater Resources and Environment, Ministry of Education, Jilin University, Changchun 130012, China
沉积物作为水生态系统的重要组成部分, 不仅给水生动植物提供了栖息地[1], 还给微生物提供了生存繁衍的环境[2, 3].沉积物微生物通过同化和异化等代谢过程来完成水生态系统中氮、磷和碳等营养元素的降解和生物地球化学循环过程[4].由于微生物对水生态系统环境的变化非常敏感, 微生物多样性和群落结构特征与环境变化密切相关[5, 6].因此, 全面系统性了解水生态系统中的沉积物微生物群落的结构组成, 对于维护水体环境具有重要的意义[7].
辽河流域是我国重要的重工业基地、粮食生产基地和畜牧业基地, 在全国的经济发展中占有举足轻重的位置.但是随着经济的发展, 水体污染问题也越来越突出.尤其是四平市因城镇污水处理能力弱、排放标准低和重污染企业缺乏监管, 因此境内辽河支流存在污染问题[8].本文将研究区域定位成辽河四平段流域, 沿着四平段河流沿线采样, 系统性地分析各点微生物群落的生长情况.应用高通量测序来实现微生物的基因定序、α多样性分析和群落结构类型; 运用层次聚类和主成分分析来分析β多样性; 运用Pearson相关分析和RDA分析来探究沉积物重金属和微生物群落结构和多样性的关系.
1 材料与方法 1.1 研究区概况辽河流域是我国的七大流域之一, 位于我国东北地区西南部, 属于温带大陆性气候, 年平均降水量约为500~650 mm, 年平均气温为4~9℃; 河流总长度为1 345 km, 流域总面积为21.9万km2.其中本研究中的四平市流域属于中部山地和下游平原, 河长199.6 km, 流域面积7 316 km2, 占总流域面积的65.3%.
1.2 样本采集本文以辽河四平市流域为研究对象, 采集该流域的水样和河底沉积物样品进行处理分析.借助全球定位系统(GPS) 于2020年10月中旬在四平市流域设置沉积物和水体采样点15个(N1~N7、M1~M3和S1~S5; 其中N点表示北河支流, S点表示南河支流, M点表示干流), 如图 1所示, 采集到水体和底泥样品, 每个样品采集3份.将采集到的样品放入干净的聚乙烯瓶和聚乙烯自封袋中冷冻保存运回实验室.其中水体样品在实验室抽滤过后马上进行分析测定; 沉积物样品在剔除砾石、贝壳及动植物残体等杂质后储存在-20℃冰箱里以备后续微生物等的测定[9].
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图 1 辽河四平段流域采样点位置示意 Fig. 1 Schematic diagram of sampling sites in the Siping basin of Liaohe River |
重金属含量的测定[10]：首先, 将沉积物样品风干后, 去除石块和植物碎片, 然后将样品打成粉末, 之后通过100目筛, 在分析前将样本粉末存放在酸洗和去离子水冲洗的玻璃瓶中.重金属元素含量测定时, 准确称取0.25 g(精确到0.000 1 g)沉积物, 放入聚四氟乙烯容器中, 用3 mL硝酸和0.25 mL氢氟酸进行消化.混合物在电消化仪上于120℃加热1 h, 另外加入2 mL硝酸、0.25 mL氢氟酸和1 mL高氯酸后于180℃加热2 h.残渣用1 mL硝酸在120℃下蒸发近干, 重复操作此赶酸步骤3次.冷却后, 将残渣用去离子水稀释至25 mL, 过0.22 μm滤膜, 然后用电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MS)分析V、Co、Cd、Cr、Pb、Cu、Zn和Ni.测试过程中每批样品均测定空白样和平行样, 且控制重金属平行样之间的相对误差在5%以下.最后的实验数据是在扣除空白值后, 取各元素平行样的平均值, 标准物质的回收率在80%~120%范围内, 标准物质选用GBW08301河流沉积物成分分析标准物质.
理化性质测定：将采集的水样在实验室抽滤过后测定其理化性质. pH值用pH计测定; 氨氮(NH4+)采用纳氏试剂分光光度法测定; 化学需氧量(COD)采用高锰酸钾法测定; 总氮(TN)用碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法测定; 总磷(TP)采用过硫酸钾消解钼锑钪比色法测定[11].
微生物活性的测定：使沉积物样品冷冻干燥后称取0.5 g于2 mL裂解管中, 使用FastDNA Spin Kit for Soil试剂盒(MPbio, USA), 按照试剂盒说明步骤提取DNA.然后用0.8%琼脂糖测定DNA提取质量, 并使用DNA分离试剂盒(Omega, Norcross, GA, USA)从0.5 g底泥样品中提取总DNA.使用NanoDrop NC 2000(Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)对DNA进行定量, 并通过电泳在0.8%琼脂糖凝胶上测定其质量.纯化后的样品被送至上海派森诺科技有限公司(中国), 使用Illumina MiSeq高通量测序平台进行测序.使用细菌16S rRNA基因V4区域的引物(515F和806R)进行PCR扩增.运用QIIME2(v1.8.0, http://qiime.org/)用于确定问题序列.QIIME2通过应用考虑每个序列的丰度及其与其他序列的相似性的误差模型, 采用DADA2来构建扩增子序列变体(amplicon sequence variants)[12].
1.4 数据分析运用SPSS24进行重金属和微生物群落多样性的描述统计和Pearson相关分析; 运用ArcGIS10.2绘制采样图; 用Canoco5.0软件绘制RDA分析.
2 结果与讨论 2.1 沉积物微生物群落多样性分析在群落生态学中, α多样性主要关注单样本的多样性分析, 可以反映微生物群落中物种的数目, 通过一系列统计学指数的分析来估计环境群落的物种丰度和多样性.其中Chao1指数和Observed species指数用来表征物种的丰富度[13, 14], Shannon指数和Simpson指数用来表征物种的多样性[15, 16].Chao1指数和Observed species指数数值越大, 表明微生物群落丰度越高.如表 1所示, 辽河四平段流域干支流Chao1指数平均值分别为：12 793[南河(S1~S5)支流]、14 237[北河支流(N1~N7)]和12 949[干流(M1~M3)]; Observed species指数平均值分别为：8 224(南河支流)、8 589(北河支流)和8 318(干流).结果表明, 在四平市流域北河支流沉积物微生物群落丰富度最高, 南河支流和干流的沉积微生物群落丰富度接近, 且均低于北河支流.Shannon指数和Simpson指数数值越大, 表明微生物群落多样性和均一性越好.在四平市流域内, 除南河支流样品S4之外, 其他沉积物样品Shannon指数范围为：10.21~12.03; Simpson指数范围为：0.989~0.999; Shannon指数平均值分别为：10.96(南河支流)、11.30(北河支流)和11.24(干流); Simpson指数平均值分别为：0.992(南河支流)、0.996(北河支流)和0.997(干流). α多样性各项指标的数值比较高, 说明辽河四平市流域干支流沉积微生物群落多样性较高, 水体环境适合微生物的生长繁殖[17].
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表 1 微生物群落α多样性指数平均水平 Table 1 Average level of α diversity index of microbial community |
在群落生态学中, β多样性指数聚焦于不同生境间多样性的比较, 也就是样本间的差异.图 2为基于门水平的辽河四平市段干支流15个样品点的Venn图分析结果.从中可知, 四平市段南河支流(S1~S5)、北河支流(N1~N7)和干流(M1~M3)15个样品组共有的OTU序列为98个, 15个样品组独有的OTU序列范围为1 430~3 832个.整体而言, 独有的OTU序列平均数分别为：2 249(南河支流)、2 697(北河支流)和2 675(干流), 独有的OTU序列数排序为：北河支流>干流>南河支流.北河支流流经的地区多为四平市的郊区和农村, 相比南河支流流经四平市的城区, 环境条件更接近自然, 水体污染相对较轻, 也就更适应微生物的生长繁殖, 微生物多样性也就更高, 独有的OTU序列也就更多[18].图 2分析结果表明, 由于地理位置和外界环境条件(如水体理化性质和沉积物重金属)的不同, 干支流间的沉积微生物类型存在较大差异, 共有的OTU序列数量较少.
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图 2 河流沉积物微生物群落Venn图 Fig. 2 Venn diagram of microbial communities in river sediments |
基于属的水平上的辽河四平市段干支流15个样品点的PCA分析结果如图 3所示.特征值高于1的两个主要成分被提取, 这解释了85.65%的沉积物细菌群落组成的变化, 坐标轴PC1能解释65.55%的微生物群落组成差异, 第二坐标轴PC2能解释出20.1%的微生物群落组成差异.结果表明, 不同取样点微生物群落组成有明显差异.在PC1维度上, N4点沉积物样品与其他样品很明显分开; 在PC2维度上, N7和S5沉积物样品与其他样品明显分开, 表明两者的微生物群落存在明显差异.支流N1、N2、N3、N5、S3和干流M3群落组成相似, 其中4个北河支流样品群落组成相似度更高; 支流样品M1和N6沉积微生物群落组成也具有相似性.此外, 北河支流样品N4、N7和南河支流样品S5与其他样品组在PCA图上的距离比较远, PCA分析的结果与图 4层次聚类分析相似.表明这3个样品点的沉积微生物群落组成类型与其他样品点差别较大, 且这3个样品点微生物群落组成类型具有特异性.
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图 3 河流沉积物微生物群落PCA分析 Fig. 3 PCA analysis of microbial communities in river sediments |
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图 4 沉积微生物群落层次聚类树图 Fig. 4 Hierarchical cluster tree diagram of sedimentary microbial community |
层次聚类是常用的β多样性分析手段.如图 4所示, 使用Bray-Curtis相似度[19], 将15个基于微生物类别的辽河四平市流域干支流沉积物样本分为不同的组.结果表明, 北河支流(N1~N7)沉积物样品细菌群落组成类似, 南河支流和干流沉积物样品细菌群落组成具有差异性.第一组由样品N6、N7、S4、S5和M1组成, 包括北河、南河支流和干流.与其他组相比, 这一组的沉积物样品具有最高的硫化菌属(Thiobacillus, 5.78%)和拟杆菌属(Bacteroides_vadinHA17, 6.47%); 第二组由南河支流样品S1、S2和干流样品M2组成, 主要以Ellin6067和SC.I.84等细菌为主; 第三组全部由北河支流样品(N1、N2、N3和N5)组成, 具有较高的Ellin6067、KD4.96和Subgroup_6细菌的丰富度.第四组由样品M3和S3组成, 主组成菌属为Ellin6067、Subgroup_6和MND1.北河支流样品N4与其他样品沉积物微生物群落组成差异较大, 具有最高的黄杆菌属(Flavobacterium, 18.54%).
通过Venn图、PCA分析和层次聚类分析, 分别从门和属两个水平上来分析微生物群落的β多样性后发现, 干流、南河支流和北河支流的差异性较大.在门水平上, β多样性：南河支流＜干流＜北河支流; 在属水平上, 北河支流的各点的优势菌属差异性不大, 南河支流各点的优势菌属差异性较大, 干流与接近干流的N6和N7与S4和S5相近.
2.2 沉积物微生物群落结构特征辽河四平段流域各采样点沉积物中微生物在门水平上的相对丰度如图 5(a)所示.其中干流(M1~M3)的优势菌门(平均丰度大于5%)为: 变形菌门(Proteobacteria, 50.51%)、绿弯菌门(Chloroflexi, 14.44%)、拟杆菌门(Bacteroidetes, 10.90%)、放线菌门(Actinobacteria, 7.29%)和酸杆菌门(Acidobacteria, 5.70%); 南河支流(S1~S5)的优势菌门为: 变形菌门(Proteobacteria, 51.18%)、拟杆菌门(Bacteroidetes, 13.92%)和绿弯菌门(Chloroflexi, 7.87%); 北河支流(N1~N7)的优势菌门为: 变形菌门(Proteobacteria, 43.17%)、拟杆菌门(Bacteroidetes, 13.82%)、放线菌门(Actinobacteria, 6.78%)和绿弯菌门(Chloroflexi, 6.47%).在门水平上, 辽河四平市段干流和南河、北河支流沉积物微生物群落组成体现出一定的异同性, 相似的地方体现在干支流沉积物微生物群落中, 变形菌门、拟杆菌门和绿弯菌门均为优势菌门, 其中变形菌门为丰度最高的菌落, 在干、支流所有样品中相对丰度为35.86%~70.18%, 在地表水体沉积物微生物群落中是常见的优势菌门, 这与中国黄河内蒙古段、湖北丹江口库区、辽宁双台子河、江西鄱阳湖、江苏太湖和辽宁辽河入海口以及美国密西西比河等不同河流湖泊的沉积物微生物群落组成类型相似, 但又有一定区别[20~25].例如黄河内蒙古段表层沉积物细菌主要菌群为: 变形菌门、绿弯菌门、拟杆菌门和厚壁菌门; 鄱阳湖典型湿地主要菌群为: 变形菌门、酸杆菌门、绿弯菌门、硝化螺旋菌门和厚壁菌门等; 太湖沉积物微生物群落主要菌群为: 贝氏和伽玛变形杆菌门、酸性杆菌门、芽孢杆菌门、厚壁菌门和放线菌门等; 丹江口库区表层沉积物主要菌群为: 变形菌门、绿弯菌门、拟杆菌门和硝化螺旋菌门等; 双台子河口沉积物物主要菌群是变形菌门、放线菌门、拟杆菌门、酸杆菌门和绿弯菌门; 辽河口沉积物主要菌群为变形菌门、拟杆菌门和酸杆菌门.可以看出不同河流沉积物微生物群落组成类型具有差异性, 厚壁菌门在大多数地区的河流沉积物微生物群落中均为优势菌门, 但在我国东北地区河流(双台子河和辽河入海口)沉积物微生物群落中丰度较低, 这与本研究的结果相似, 厚壁菌门在辽河四平段流域干支流沉积物微生物群落中相对丰度低于5%, 不作为优势菌门而存在.酸杆菌门在干流属于优势菌门, 而在南河、北河支流中丰度较低, 不属于优势菌门; 支流沉积物微生物优势菌门丰度较为相近, 区别在于放线菌门在北河支流是优势菌门(6.78%), 而在南河支流却不是优势菌门.
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图 5 河流沉积物微生物群落结构组成 Fig. 5 Composition of the microbial community structure in river sediments |
辽河四平段流域各采样点沉积物中微生物在纲水平上的相对丰度如图 5(b)所示.其中干流的优势菌纲(相对丰度大于5%)分别为: γ-变形菌纲(γ-Proteobacteria, 35.30%)、厌氧蝇菌纲(Anaerolineae, 10.74%)、拟杆菌纲(Bacteroidia, 9.82%)、α-变形菌纲(α-Proteobacteria, 7.77%)和δ-变形菌纲(δ-Proteobacteria, 7.23%); 南河支流的优势菌纲与干流基本相同, 但是丰度分别为: 42.04%、5.70%、12.98%、5.99%和8.97%; 北河支流的优势菌属分别为: γ-变形菌纲(γ-Proteobacteria, 34.62%)、拟杆菌纲(Bacteroidia, 13.16%)、α-变形菌纲(α-Proteobacteria, 9.30%)和δ-变形菌纲(δ-Proteobacteria, 7.44%).由此可见, 在辽河四平市段干支流沉积物中, γ-变形菌纲占据着比较重要的生态位置.变形菌门不同纲的菌群在沉积物中的丰度变化也是微生物群落结构研究中的一个重要指标. α-变形菌纲是淡水细菌群落中一个典型的优势类群, 包括了能与植物共生的固氮细菌, 可为土壤提供更强的固氮能力[26]. δ-变形菌纲大部分成员生活在厌氧条件下, 很多还是严格的厌氧菌属[27]. β-变形菌纲更易存活于受污染的环境中, 可作为环境质量监测与评价的生态指标[28], β-变形菌纲广泛存在于松花江和海宁长山河等[29, 30], 但是在辽河四平段流域β-变形菌纲并非优势菌纲.有研究发现, 海洋及近海沉积物中变形菌门以γ-变形菌纲为主[31], 且γ-变形菌纲在沉积物厌氧氨氧化过程中起着重要作用[32]; γ-变形菌纲还包含了大量的致病菌, 如沙门氏菌属、军团菌属和弧菌属等[33].因此在本研究中, γ-变形菌纲在微生物群落中的大量存在表明辽河四平市干支流沉积物中碳、氮含量较高且碳氮循环较为频繁, 同时γ-变形菌纲的大量存在对人民群众的身体健康也有很大的风险.
辽河四平段流域各采样点沉积物中微生物在属水平上的相对丰度如图 5(c)所示, 从微生物菌属组成图和层次聚类分析可知, 干支流沉积物环境中的优势菌属是有一定的差异性的.干流沉积物样本中丰富度最高的是SC.I.84(2.56%)、拟杆菌属(Bacteroidetes_vadinHA17, 2.38%)和KD4.96(2.06%); 南河支流沉积物样本中丰度度最高的是拟杆菌属(Bacteroidetes_vadinHA17, 4.00%)、Ellin6067(3.04%)和SC.I.84(2.07%); 北河支流沉积物样本中丰富度最高的是黄杆菌属(Flavobacterium, 3.65%)、Ellin6067(2.87%)和硫化菌属(Thiobacillus, 2.86%).拟杆菌属是在人体和动物体的消化系统中发挥重要作用的菌属, 主要分布在口腔和肠道等处, 其中一部分细菌主要用来分解糖类[34].硫化菌属常见于矿山的水坑中, 可使金属硫化物氧化成硫酸, 使矿物中的金属被溶解, 其氧化作用提供了植物可利用的硫酸态硫素营养[35].从分析结果来看, Ellin6067广泛存在于南河支流、北河支流和干流的部分地区, Ellin6067在微生物分类上属于β-变形菌纲, 在生物的脱氮除磷和去除其他污染物的过程中起关键性作用[36]; 辽河四平段流域部分采样点的氮元素和COD轻度超标, 沉积物碳氮循环交流也很频繁, 但是β-变形菌纲在辽河四平段流域并不是优势菌纲, 据此可以推测, 辽河四平段流域存在轻度的水体富营养化问题.
2.3 环境因子对微生物群落差异的影响由于微生物对水生态系统环境的变化非常敏感, 微生物多样性和群落结构特征与环境变化密切相关, 研究环境因子对微生物群落差异性的影响具有现实意义.本研究选取沉积物重金属(V、Cr、Co、Ni、Cu、Zn、Cd和Pb)和河流水体的化学需氧量(COD)、氨氮(NH4+)、总氮(TN)、总磷(TP)和pH作为环境因子, 具体情况如表 2和表 3.环境因子与沉积物微生物群落α多样性指数的Pearson相关分析如表 4所示.其中Cr、Cu和Chao1指数, Cu和Observed species指数呈负相关性(P＜0.05), 水体NH4+与Chao1指数、Observed species指数呈显著负相关(P＜0.01); 据此笔者可以推测出, 沉积物Cr、Cu和水体NH4+会降低沉积物中微生物的丰富度[37, 38].沉积物Ni和Cu对Shannon指数和Simpson指数呈负相关性(P＜0.05), 水体NH4+对Shannon指数呈负相关性; 笔者推测, 沉积物Cu、Ni和水体NH4+会对沉积物中微生物群落的均一性和多样性造成不利的影响[38, 39].
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表 2 沉积物重金属含量 Table 2 Heavy metal content in sediments |
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表 3 水体理化性质 Table 3 Physical and chemical properties of water body |
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表 4 环境因子与微生物α多样性指数的Pearson相关性1) Table 4 Pearson correlation between environmental factors and microbial α diversity index |
利用Canoco5.0软件对四平段流域细菌门水平丰度与环境因子进行冗余分析(RDA), 结果如图 6所示.箭头长度表示环境因子对微生物群落结构的影响强度, 箭头越长就说明相关性越强, 箭头连线之间的锐角表示是正相关, 钝角表示是负相关[40].结果说明, 该流域的微生物群落受沉积物金属元素Cu、V、Ni和水体的NH4+的影响较大, 其中NH4+与绿弯菌门、拟杆菌门和厚壁菌门呈正相关, 与变形菌门和酸杆菌门呈负相关; Cu与拟杆菌门和厚壁菌门呈正相关, 与变形菌门、绿弯菌门和酸杆菌门呈负相关; V、Ni与拟杆菌门和厚壁菌门呈正相关, 与绿弯菌门和放线菌门呈负相关.微生物对金属离子的耐性值是一定的, 当金属离子浓度过高超过微生物的耐性值时, 会引起微生物群落结构发生变化[41], 如在高浓度的Cu离子的胁迫下, 对Cu离子敏感的微生物的生长会受到明显的抑制作用, 从而导致微生物群落的衰亡和多样性的降低[42].氨氮的浓度变化也会影响部分微生物群落的生长, 例如高浓度氨氮会抑制与自养型硝化作用有关的β-变形菌纲细菌的活性, 进而降低变形菌门的丰富度和多样性[43].
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Pro：Proteobacteria(变形菌门), Bac：Bacteroidetes(拟杆菌门), Chl：Chloroflexi(绿弯菌门), Act：Actinobacteria(放线菌门), Aci：Acidobacteria(酸杆菌门), Fir：Firmicutes(厚壁菌门) 图 6 环境因子和门水平上优势菌的RDA分析 Fig. 6 RDA analysis of dominant bacteria at environmental factor and phylum level |
(1) 对辽河四平段流域沉积物微生物群落α多样性来说, 群落丰富度和多样性: 北河支流﹥干流﹥南河支流; β多样性表现为干流、南河支流和北河支流微生物群落的相似度较低, 差异性较大.
(2) 变形菌门是沉积物微生物群落占比最高的门类, 在其他流域常为优势菌门的厚壁菌门在本流域丰度较低; 包含大量的致病菌的γ-变形菌纲是该流域沉积物微生物群落占比最高的菌纲, 流域内存在着沉积物释放大量病原菌进入水体影响人体健康的风险; 而生态恶化的指标β-变形菌纲在该流域丰度很低, 属于β-变形菌纲Ellin6067菌属在该流域分布很广.
(3) 沉积物Cr、Cu、水体NH4+会降低沉积物中微生物的丰富度, 沉积物Cu、Ni和水体NH4+会对沉积物中微生物群落的均一性和多样性造成不利的影响; 沉积物Cu、V、Ni和水体NH4+会通过影响部分微生物的生长, 进而影响微生物群落结构的变化.
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