2018, Vol. 39
, ZHANG Hai-han
, HUANG Ting-lin , CHEN Sheng-nan , SHANG Pan-lu , FENG Ji , JIA Jing-yu
随着经济社会的发展, 天然水体氮污染问题越来越严重, 氮污染问题不仅能够引起水体的富营养化[1], 且在进行氯消毒的过程中会产生氮的消毒副产物(N-DBPs), N-DBPs对人体健康会造成很大的影响[2].目前, 国内许多城市已将湖泊、水库等地表水作为主要供水水源.因此天然水体氮污染的去除成为了研究重点.湖库水体生态环境中营养循环主要受沉积物中的功能微生物种群的综合调控.在整个湖库内源污染物释放和迁移转化过程中, 沉积物扮演着非常重要的角色.而沉积物中的功能菌群(如电缆细菌、硝化细菌和反硝化细菌)是整个自然水体生态系统生源要素生物地球化学循环的“驱动泵”.因此, 研究沉积物中的功能菌群结构及其多样性, 对于解释水环境生态系统提供一个新的视角, 进而为修复受污染沉积物及改善水质提供理论数据支持[3, 4].天然水体中反硝化菌群对于改善水质发挥关键作用.传统的反硝化细菌通常在厌氧和缺氧环境下生存, 因此很难在天然水体中发挥作用.随着好氧反硝化菌的发现, 其优势也逐渐显现出来：①好氧反硝化与硝化能在同一个反应器中进行, 可以减少资金投入; ②反硝化释放出的OH-可部分补偿硝化反应所消耗的碱, 维持系统中酸碱稳定.
近年来, 国内外越来越多的好氧反硝化菌株被成功筛分[5].孙菲等[6]从活性污泥中筛选出的好氧反硝化菌通过组合成混合菌群生长快速稳定, 在相同的实验条件下脱氮效率高于单菌株, 48 h的硝氮去除率为99%;雍佳君等[7]从河流沉积物中筛分出反硝化混合菌群, 9 h内硝氮和总氮去除率为100%和91%, 表明混合菌群具有显著的氮素污染物去除优势.目前关于反硝化菌群的研究主要集中于天然河流和活性污泥中, 但淡水型湖库沉积物中好氧反硝化菌群脱氮特性及其种群结构、丰度及空间分布特征还鲜为人知.而且, 关于好氧反硝化细菌的筛分过程主要包括间歇曝气法和选择性培养基[5].目前要获得新的好氧反硝化细菌是越来越困难, 因此改进好氧反硝化细菌的筛分方法迫在眉睫.姜怡等[8]运用超声波处理土样分离放线菌, 发现土壤悬液经超声波处理后, 放线菌的种类和数量会明显增加.本研究在常规分离方法分离好氧反硝化菌群的基础上, 再对沉积物-菌悬液进行超声波处理, 提高特有菌群筛分效率.
在好氧反硝化细菌细胞内分别由硝酸还原酶、亚硝酸还原酶、氧化氮还原酶和氧化亚氮还原酶催化实现生物脱氮过程, 经过NO3-→NO2-→NO→N2O→N2 4系列生化反应将硝酸盐转化为氮气.生化反应相对应的功能基因为nar、nir、nor和nos.可见亚硝酸盐的还原是整个反硝化的制约步骤[9], nir成为限制性基因, 一种是nirK基因, 另一种是nirS基因.文献表明, 大部分反硝化细菌胞内均表达nirS基因[10~14].因此, 本研究主要诊断沉积物中nirS型反硝化菌群结构.
综合国内外研究进展, 选取金盆水库, 兴庆公园和长乐公园作为研究对象, 从沉积物中筛分出优势好氧反硝化菌群, 考察其脱氮特性, 并运用高通量DNA测序技术对沉积物中的nirS型反硝化细菌种群结构进行诊断, 结果对于阐明湖库淡水生态系统好氧反硝化菌群结构、脱氮特征提供科学依据; 筛选所得高效脱氮菌群能为城市湖库微污染水体的微生物修复工程提供菌源保障.
1 材料与方法 1.1 沉积物与培养基2016年8月, 从西安市金盆水库, 兴庆公园和长乐公园, 采用彼得森采泥器采集表层0~10 cm沉积物, 然后装于灭菌取样瓶, 放置在装有冰袋的采样箱内(8℃), 24 h内运回实验室, 待用.
DM培养基[15]：丁二酸钠, 4.7g·L-1; KNO3 1 g·L-1; KH2PO4, 1.5 g·L-1; Na2HPO4·7H2O, 5.0 g·L-1; 微量元素溶液, 2 mL·L-1; MgSO4·7H2O, 0.1 g·L-1; 调节pH=7.2.
微量元素溶液[15]：乙二胺四乙酸(EDTA), 100 mg·L-1; ZnSO4, 4.4 mg·L-1; CaCl2, 11 mg·L-1; MnCl2·4H2O, 10.2 mg·L-1; FeSO4·7H2O, 10 mg·L-1; (NH4)6Mo7O24·4H2O, 2.2mg·L-1; CuSO4·5H2O, 3.2 mg·L-1; CoCl2·6H2O, 3.2 mg·L-1.
DM固体培养基[15]：丁二酸钠, 4.7 g·L-1; KNO3 1 g·L-1; KH2PO4, 1.5 g·L-1; Na2HPO4·7H2O, 5.0g·L-1; 微量元素溶液, 2 mL·L-1; MgSO4·7H2O, 0.1 g·L-1; 调节pH=7.2.琼脂粉10g·L-1.
1.2 好氧反硝化菌群的富集本研究有效整合间歇曝气法、选择性培养基和超声波预处理的方式富集、筛分好氧反硝化菌.将3个取样点采集的表层沉积物各取200 mL放入装有500 mL液体DM培养基的1 L烧杯中, 放入若干玻璃珠, 在摇床上培养(130 r·min-1, 20 min), 以打散沉积物制成悬液.然后通过空气泵间歇曝气, 控制溶解氧在4~6 mg·L-1.每隔3 d补充新鲜的液体DM培养基, 持续间歇曝气20 d.第21 d时, 分别取10 mL菌悬液到5个装有3 mL液体DM培养基的无菌试管中[16].为了提高菌株分离效率, 将上述样品放入槽式超声波清洗器中(KQ-500DE, 温度设定为20℃; 超声功率设定为40%, 其额定功率为500 W), 分别处理0、10、20、30、40和50 s.
1.2.1 好氧反硝化菌群的初筛在无菌操作台, 采用灭菌玻璃棒将菌液搅拌均匀, 从用超声波处理过的沉积物-水混合液(菌悬液)中, 取1 mL放置到9 mL灭菌水的试管中, 抽吸6次, 混合均匀, 得到10-1梯度菌悬液, 然后再从次试管中取1 mL加入另一个含有无菌水9 mL的无菌水试管中, 得到10-2梯度的菌悬液.采用10倍稀释法依次得到10-3、10-4梯度的菌悬液; 取10-3和10-4的0.1 mL的菌悬液涂布到已制备好的反硝化固体培养基上倒置平板培养皿, 放入30℃恒温培养箱中培养[17].
1.2.2 好氧反硝化菌群的复筛待平板中长出菌落, 用PBS缓溶液将10-3梯度菌落洗下来, 作为混合菌种, 取5 mL混合菌液接种到装有150 mL液体培养基的锥形瓶中(120 r·min-1, 30℃), 至对数生长期将其再次按体积比5%接种到装有150 mL液体培养基的250 mL锥形瓶中测其脱氮特性.混合菌种保存于西安建筑科技大学环境微生物技术研究所.
1.3 混合菌群的脱氮特性将筛选出的优势好氧反硝化菌群H-30、X-10和C-30按体积比5%分别接入装有150 mL液体培养基的250 mL锥形瓶中进行反硝化脱氮实验(130 r·min-1, 30℃).混合菌群菌液样品首先使用超声波细胞破碎仪(Scientz-IID)进行处理[17], 然后在4℃、8000 r·min-1下离心10 min, 将上清液用0.22 μm的醋酸纤维滤膜过滤, 滤液用于分析总氮(TN)、氨氮(NH4+-N)、硝氮(NO3--N)、亚硝氮(NO2--N)和总有机碳(TOC).
1.4 好氧反硝化菌群结构诊断 1.4.1 微生物总DNA提取分别取培养至对数生长期的菌液10mL经0.22 μm醋酸纤维滤膜过滤, 采用EZ Spin柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒(美国, Omega)提取微生物总DNA, 具体抽提步骤按操作说明进行[18].利用2%琼脂糖凝胶电泳检测抽提总的DNA, 测量DNA浓度(Nano Drop 2000), 保存于-20℃冰箱、备用.
1.4.2 Illumina高通量测序好氧反硝化混合菌液中亚硝酸还原酶nirS功能基因采用引物对(Cd3AF/R3cdR)进行扩增[19, 20]. PCR扩增体系(20 μL)为：DNA模板10ng、dNTPs 2 μL(2.5 mmol·L-1)、缓冲液4 μL、DNA聚合酶0.4 μL、R3cdR引物0.8 μL(5 μmol·L-1)、Cd3AF引物0.8 μL(5 μmol·L-1)、ddH2O补至20 μL.扩增条件为：95℃预变性4 min, 95℃变性40 s, 56℃退火30 s, 72℃延伸40s, 28个循环, 72℃延伸10 min.将同一样品的PCR产物混合, 然后用琼脂糖凝胶电泳(1%)检测, 使用凝胶回收试剂盒(Axygen, USA)纯化回收PCR产物, Tris-HCl洗脱、琼脂糖凝胶电泳(1%)检测.将PCR产物用Quanti FluorTM-ST蓝色荧光定量系统(Promega, USA)分析产物浓度[20]. Illumina MiSeq高通量DNA测序在上海美吉生物公司进行.
1.4.3 高通量数据分析首先对nirS功能基因测序的原始数据进行质控, 通过Fast QC软件进行质量控制, 低质量的序列被舍弃.优质序列通过QIIME进行处理, 根据序列的相似度, 将有效数据在97%水平下聚类为OTU(operational taxonomic units)[21~23], 依据数据库(ribosomal database project, RDP)明确OTU分类学信息[22], 丰度小于0.001的去除.
1.5 菌群生长和脱氮特征测定以未接种菌种的DM培养基作为对照, 菌体生长采用紫外分光光度法测定D600(日本岛津, UVmini-1240);总氮(TN)、硝氮(NO3--N)、亚硝氮(NO2--N)和氨氮(NH4+-N)等均参照文献[24]测定(日本岛津, 紫外-可见分光光度计, UVmini-1240).其中, TN采用碱性过硫酸钾消解-紫外分光光度法; NO3--N采用紫外分光光度法; NO2--N采用N-(1-萘基)-乙二胺光度法; NH4+-N采用纳氏试剂比色法测定. TOC采用总有机碳测定仪(日本岛津, TOC-L), pH和DO采样HQ30d(美国, Hach)测定, 溶解性总氮、硝氮、亚硝氮和氨氮的样品经0.22μm醋酸纤维滤膜过滤进行预处理, 重复3次(n=3).
2 结果与讨论 2.1 高效好氧反硝化菌群的筛分3种不同的好氧反硝化混合菌群从不同的生态环境中筛分出来.在传统的利用间歇曝气富集, 选择培养基筛选好氧反硝化细菌的基础上, 将泥水菌悬液置于槽式超声波清洗器中(KQ-500DE, 温度设定为20℃; 超声功率设定为40%, 其额定功率为500 W), 分别处理0、10、20、30、40和50 s.共得到12组混合菌种, 经初步脱氮实验, 发现3组混合菌种(H-30、X-10和C-30)的脱氮效果最佳, 并进行深入研究.
2.2 混合菌群的脱氮特性将活化好的优势好氧反硝化混合菌种转接于液体培养基中, 于30℃恒温振荡培养箱摇瓶培养, 期间每隔3 h测定D600和氮素指标用以监测菌体长势及氮素降解率变化.
由图 1可知, 混合菌群H-30经过短暂的迟缓期, 大约6 h后菌体生长活跃, 菌群总量迅速增长, 培养48 h菌密度D600达到最大, 为1.26, 显著高于单菌株的菌密度. 48 h后, 菌体进入衰亡期.通过生长曲线可掌握了该混合菌群的生长规律, 为研究它的脱氮特性奠定基础.第6~24 h, 硝氮、总氮浓度下降明显, 总有机碳也表现出同样的下降趋势, 表明异养-好氧-反硝化的发生; 菌体对氮素降解速率在此范围内迅速增大, 这与该时期菌体总量的不断增多有关.在此阶段, 硝氮、总氮和总有机碳去除速率分别达到7.30、6.52和29.94 mg·(L·h)-1. 24 h时, 93.81%的硝氮、83.04%的总氮、63.29%的总有机碳被去除.在反硝化初期, 亚硝氮有短暂积累, 但很快消失.这可能是由于反硝化初期硝氮去除率较高造成亚硝氮大量积累, 之后随着硝氮的去除达到平衡, 而亚硝氮的去除率提高.菌体生长比硝氮的去除有个滞后过程, 可能是菌体在吸收完硝氮以及其他营养物质后需要一个同化时间.这和Huang等的研究相一致[17].
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图 1 好氧反硝化菌群H-30氮素、总有机碳去除及生长曲线 Fig. 1 Nitrogen, TOC removal, and microbial growth performance of the aerobic denitrifier community H-30 |
图 2解释了好氧反硝化混合菌群X-10细胞生长和好氧反硝化能力.在起始的6 h, 细菌处于迟缓期, 硝氮浓度从147.92 mg·L-1缓慢地降到140.96 mg·L-1, 同时D600值从0缓慢增长到0.15.随后6~24 h, 观察到硝氮显著地从140.96 mg·L-1降到2.64 mg·L-1, 平均硝氮去除速率达到7.68 mg·(L·h)-1. TN和TOC的去除具有和硝氮相同的趋势, 在24 h时其去除率分别为83.40%和73.43%, 在此阶段, D600值从0.15增长到1.43.这表明好氧反硝化混合菌群X-10具有异养好氧反硝化能力. 30 h后, 混合菌群进入稳定期.在反硝化整个过程中, 有个短期的亚硝氮积累, 但很快消失.相比好氧反硝化混合菌群H-30和C-30, 好氧反硝化混合菌群X-10的亚硝氮积累要显著小.这可能是nirS基因的丰度相对较高的缘故.
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图 2 好氧反硝化菌群X-10氮素、总有机碳去除及生长曲线 Fig. 2 Nitrogen, TOC removal, and microbial growth performance of the aerobic denitrifier community X-10 |
由图 3可知, 经过6 h细菌增殖, 细菌D600值增长到0.15.随后细菌进入对数期, 在6~18 h, D600值从0.15急剧增长到1.29, 在此阶段, 硝氮从137.39 mg·L-1降到29.06 mg·L-1, 可以得出细菌NO3--N降解能力与表示细菌生长情况的D600是呈正相关关系.在好氧条件下, 总氮和总有机碳去除模式和硝氮去除相一致.经过24 h的培养, TN和总有机碳的去除率分别达到82.68%和83.01%.
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图 3 好氧反硝化菌群C-30氮素、总有机碳去除及生长曲线 Fig. 3 Nitrogen, TOC removal, and microbial growth performance of the aerobic denitrifier community C-30 |
相比分离的单一好氧反硝化菌株, 混合菌株的脱氮能力更显著且混合菌群H-30、X-10和C-30的菌密度(D600)显著大于纯菌株的[17].混合菌群生长及降解曲线测定结果表明, 菌群长势越好, 降解能力越强; 相关研究结果表明, 混合好氧反硝化菌群反硝化速率显著高于单株好氧反硝化[6].单一菌种在实际工程应用中, 不能很好地适应生态环境, 但是混合菌群对生态环境的适应能力要显著强于单一菌种.
2.3 反硝化菌群结构组成解析采用Illumina MiSeq高通量DNA测序分析测定两种优势好氧反硝化菌群结构及比例.在种水平, 优势好氧反硝化菌群H-30的类别如下, 枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis, 59.9%)、斯氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri, 39.5%)、Pseudomonas xiamenensis(0.5%)、Paracoccus pantotrophus(0.1%); 优势好氧反硝化菌群X-10的类别如下, P. pantotrophus(58.8%)、斯氏假单胞菌(P. stutzeri, 37.9%)、枯草芽胞杆菌(B. subtilis, 3.3%)优势好氧反硝化菌群C-30的类别如下, 斯氏假单胞菌(P. stutzeri, 81.7%)、P. pantotrophus(18.2%)、Bacillus subtilis(0.04%); 由图 4可知, 3组优势好氧反硝化菌群结构存在显著差异, 但都是主要的好氧反硝化菌属.这可能是3组优势好氧反硝化菌群所处的自然生态环境不同的缘故.不同的自然生态环境支持不同的优势菌种.经过长时间的富集过程, 枯草芽胞杆菌(B. subtilis)、Paracoccus pantotrophus、斯氏假单胞菌(P. stutzeri)和Pseudomonas xiamenensis成为优势菌种, 其他nirS型好氧反硝化细菌被逐渐淘汰.优势混合菌种H-30, X-10和C-30的最优势菌种分别是枯草芽胞杆菌(B. subtilis), Paracoccus pantotrophus和斯氏假单胞菌(P. stutzeri), 其中斯氏假单胞菌(P. stutzeri)在H-30和X-10两种混合菌种中所占比例基本一致, 而Pseudomonas xiamenensis相对丰度最低为0.5%, 而且仅在H-30中检测到.在受污染水体微生物修复过程中, 将复合微生物菌剂进行城市富营养化湖泊的治理修复, 可以在一定程度上降低富营养化程度、改善城市湖库水质, 作为一种安全、经济高效、无二次污染的治理手段具广阔的市场前景.因此, 本研究所筛选高效菌群可以作为高效微生态菌剂, 扩充现有菌剂库, 并应用于我国城市湖库富营养化水体的微生物修复工程.
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图 4 好氧反硝化细菌群落结构组成 Fig. 4 Aerobic denitrifier community structure |
通常生活在沉积物中的细菌被沉积物颗粒包裹着, 经过前期的振荡和间歇曝气, 细菌不易从沉积物颗粒中释放出来.因此, 采用超声波处理沉积物-水悬液, 使沉积物颗粒中的细菌扩散出来, 再用平板稀释法分离好氧反硝化混合菌群, 显著提高了菌体筛分效率和稀有高效菌株的筛出率.另外, 传统的好氧反硝化菌筛选均为采用稀释涂布平板技术、然后通过纯化过程得到单一好氧反硝化菌株, 研究其脱氮特性, 再通过菌株配对方式形成混合菌群.这样存在人为配对因素, 而不是自然配对的菌群.本研究设计出在无需得到单一纯菌的基础上, 通过筛选混合菌群来研究脱氮效果, 该过程省时省力, 并且所得菌群是自然筛分过程配伍形成的、具有稳定性和高效性.不同种属的好氧反硝化细菌组成的混合菌群具有更稳定、更高效的氮污染去除效果.不同的好氧反硝化细菌形成了共生关系, 菌株之间产生群体感应、相互之间产生协同作用, 更有利于水体中氮、有机物的去除.
史佳媛[25]从河道沉积物中筛选出优势好氧反硝化菌群, 从优化培养和扩大培养的菌液中共检测到204种菌.其中, 假单胞菌属(Pseudomonas sp.)、粪产碱菌属(Alcaligenes sp.)、牦牛瘤胃菌属(Proteiniclasticum sp.)、无色杆菌属(Achromobacter sp.)、甲基芽孢杆菌属(Methylobacillus sp.)为菌液中的优势菌.本次筛选的优势好氧反硝化菌群中的细菌种类显著少于史佳媛从河道沉积物中筛选出的优势好氧反硝化菌群.这可能是运用超声波对作为菌种源的沉积物进行前期处理和长时间的间歇曝气的缘故, 使得其他劣势菌属逐渐被淘汰.枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)通常在生活废水中, 很少存在于天然水体中[26]. Kim等[27]从夜间土壤处理系统中分离出来好氧反硝化细菌——枯草芽孢杆菌(B. subtilis), 并且发现具有异养硝化-好氧反硝化的能力[26].文献检索表明, 在天然水体中枯草芽孢杆菌(B. subtilis)作为nirS型反硝化细菌的研究报道极为罕见.因此, 枯草芽孢杆菌(B. subtilis)作为可培养的新型反硝化菌种, 扩充天然水体菌种资源库, 为后续的菌剂制备提供菌源保障.
本研究发现与优势混合菌群H-30相比, 好氧反硝化细菌Paracoccus pantotrophus在混合菌群X-10和C-30中的占比要显著高, 可能是不同湖库沉积物具有不同的理化性状所决定的.副球菌属(Paracoccus sp.)通常存在于高氮素的环境中[28, 29], 而兴庆公园和长乐公园污染严重的沉积物为高占比的P. pantotrophus提供了一个合理的解释.假单胞菌属作为已知反硝化菌中最大的分类群之一.该属中的多个种已被作为研究反硝化过程的典型模式菌株.假单胞菌属的好氧反硝化细菌广泛存在于自然生态环境中, 目前, 在活性污泥[30]、河流沉积物、水库沉积物[17]、湖泊沉积物[31]和海洋沉积物[32]中均筛分出假单胞菌属(Pseudomonas sp.)的好氧反硝化菌.斯氏假单胞菌(P. stutzeri)在混合菌群H-30和X-10中的占比分别为39.5%和37.9%, 是两种混合菌群的主要优势菌属, 在脱氮过程中起到十分重要的作用.而斯氏假单胞菌(P. stutzeri)在混合菌群C-30中的占比为81.7%, 表明在混合菌群C-30的脱氮过程中起到最主要的作用.前期关于西安市区6个典型景观水体nirS型反硝化细菌种群结构的研究表明副球菌属(Paracoccus sp.)、假单胞菌属(Pseudomonas sp.)同样是水体的优势菌属, 从侧面也说明了水体和沉积物之间的相互影响关系.而从水库中筛选出的混合菌群中的枯草芽孢杆菌(B. subtilis)却不是景观水体中的优势菌[33].
3 结论(1) 基于传统的好氧反硝化菌筛分技术, 本研究首次将超声波处理方法引入湖库沉积物好氧反硝化菌群的筛分过程, 提高了筛出效率, 并成功筛分出3组高效好氧反硝化菌群H-30, X-10和C-30.
(2) 3组混合好氧反硝化菌群具有高效的脱氮能力, 在好氧条件下, H-30、X-10和C-30菌群总氮去除率分别达到83.04%, 83.40%和82.68%.
(3) Illumina MiSeq高通量DNA测序结果表明, 3组nirS型好氧反硝化优势混合菌群种群结构差异显著, H-30, X-10和C-30菌群的优势菌种分别是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、Paracoccus pantotrophus和斯氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri).
(4) 筛选的3组高效好氧反硝化菌群将为我国城市湖库污染水体的微生物修复工程提供菌源保障.
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