环境科学  2025, Vol. 46 Issue (3): 1716-1728   PDF    
引用本文
苏芝凤, 黄德周, 朱芷仪, 陈荣枢, 代廷皓, 梁建宏, 朱婧. 亚热带森林不同土壤类型团聚体酶活性及化学计量特征的差异[J]. 环境科学, 2025, 46(3): 1716-1728.
SU Zhi-feng, HUANG De-zhou, ZHU Zhi-yi, CHEN Rong-shu, DAI Ting-hao, LIANG Jian-hong, ZHU Jing. Activity and Stoichiometry of Soil Enzymes in Aggregates of Different Soil Types in Subtropical Forests[J]. Environmental Science, 2025, 46(3): 1716-1728.
亚热带森林不同土壤类型团聚体酶活性及化学计量特征的差异
苏芝凤1,2, 黄德周2, 朱芷仪2, 陈荣枢1,2, 代廷皓2, 梁建宏3, 朱婧1,2,4     
1. 广西师范大学珍稀濒危动植物生态与环境保护教育部重点实验室, 桂林 541006;
2. 广西师范大学环境与资源学院, 桂林 541006;
3. 中国地质科学院岩溶地质研究所, 自然资源部/广西岩溶动力学重点实验室, 桂林 541004;
4. 广西生态脆弱区环境过程与修复重点实验室, 桂林 541006
收稿日期: 2024-01-05; 修订日期: 2024-05-09
基金项目: 国家自然科学基金项目（41967005）；广西自然科学基金项目（2020GXNSFBA159029）
作者简介: 苏芝凤（1999~）, 女, 硕士研究生, 主要研究方向为环境生态与生物修复, E-mail：2411217827@qq.com
通信作者: 朱婧, E-mail：zhuj@gxnu.edu.cn
摘要: 为揭示我国亚热带森林生态系统不同土壤类型和团聚体土壤微生物养分限制和养分有效性的差异及其驱动因素, 以亚热带森林典型酸性红壤和中性石灰性土壤的O/A层（分别为0~3和0~7 cm）和AB层（O/A层以下至20 cm）为研究对象, 分析不同粒径团聚体中碳获取酶[蔗糖酶、淀粉酶、β-1, 4-葡萄糖苷酶（BG）]、氮获取酶[脲酶、乙酰葡糖胺糖苷酶（NAG）、亮氨酸氨基肽酶（LAP）]和磷获取酶[植酸酶、酸性磷酸酶（AP）]的活性, 揭示土壤酶化学计量特征的变化规律. 结果表明, 石灰性土壤比酸性红壤的氮获取酶活性更高, 其中石灰性土壤脲酶、NAG酶和LAP酶活性分别比酸性红壤高38.84%、123.89%和4.06%, 而两者的碳和磷获取酶活性差异不大. 红壤与石灰性土壤O/A层土壤酶活性整体上均高于AB层. 土壤总有机碳和pH值是影响土壤酶活性的关键环境因子. 多数碳、氮、磷转化水解酶（BG、脲酶和NAG以及植酸酶）活性在微团聚体（0.1~0.25 mm和 < 0.1 mm）中活性更高；这凸显了小团聚体在促进有机质的分解, 加快土壤养分循环中的作用；相比红壤, 石灰性土壤中NAG和植酸酶在不同团聚体中呈现了显著的差异性. 红壤和石灰性土壤及其团聚体的ln（BG）: ln（NAG+LAP）: ln（AP）均值分别为1.02:1:1.04和0.95:1:0.93, 总体上符合全球平均水平1:1:1. 红壤ln（BG）: ln（NAG+LAP）及其矢量长度均高于石灰性土壤, 表明红壤受到更强的碳限制. 红壤ln（NAG+LAP）: ln（AP）低于石灰性土壤且矢量角度大于石灰性土壤, 表明其磷限制更强. 土壤pH值和总磷是影响酶活性化学计量特征的最主要因子. 红壤有机质和生物有效性磷均低于石灰性土壤, 促使微生物通过分泌碳磷获取酶以提高获取磷效率. 高pH的石灰性土壤可能由于自身矿化和硝化速率较高导致硝酸盐淋溶, 造成更强的氮限制. 土壤大团聚体（1~2 mm和0.5~1 mm）的微生物受到较强磷限制；而在微团聚体（尤其是0.1~0.25 mm）中受到更强的碳限制. 石灰性土壤大团聚体到微团聚体的微生物养分模式从磷限制转变为氮限制. 研究结果揭示了我国亚热带森林土壤微生物养分限制同时受土壤类型及团聚体结构的影响.
关键词: 红壤      石灰性土壤      团聚体      酶活性      酶化学计量比      亚热带森林     
Activity and Stoichiometry of Soil Enzymes in Aggregates of Different Soil Types in Subtropical Forests
SU Zhi-feng1,2 , HUANG De-zhou2 , ZHU Zhi-yi2 , CHEN Rong-shu1,2 , DAI Ting-hao2 , LIANG Jian-hong3 , ZHU Jing1,2,4     
1. Key Laboratory of Ecology of Rare and Endangered Species and Environmental Protection, Ministry of Education, Guangxi Normal University, Guilin 541006, China;
2. College of Environment and Resources, Guangxi Normal University, Guilin 541006, China;
3. Guangxi Key Laboratory of Karst Dynamics, Ministry of Natural Resources/Guangxi, Institute of Karst Geology, Chinese Academy of Geological Sciences, Guilin 541004, China;
4. Guangxi Key Laboratory of Environmental Processes and Remediation in Ecologically Fragile Regions, Guilin 541006, China
Abstract: To reveal the differences in soil microbial nutrient limitation and nutrient availability at the aggregate scale of soil types in a subtropical forest in China, the O/A horizon (0-3 cm and 0-7 cm, respectively) and AB horizon (below O/A horizon to 20 cm depth) of typical acidic red soil and neutral limestone soil in Northern Guangxi were studied. The activities of carbon-acquiring enzymes (sucrase, amylase, β-1, 4-glucosidase (BG)), nitrogen-acquiring enzymes (urease, β-1, 4-N-acetyl-glucosaminidase (NAG), leucine amino peptidase (LAP)), and phosphorus-acquiring enzymes (phytase and acid phosphatase (AP)) in different aggregate sizes were determined to reveal the variation in soil enzyme stoichiometry characteristics. The results showed that the limestone soil had higher nitrogen-acquiring enzyme activity compared to that in the red soil, with urease, NAG, and LAP activities being 38.84%, 123.89%, and 4.06% higher, respectively. The differences in carbon- and phosphorus-acquiring enzyme activities between the two soils were not significant. The overall soil enzyme activities in the O/A horizon were higher than in the AB horizon for both red soil and limestone soil. Soil total organic carbon and pH were identified as key factors influencing soil enzyme activities. Most enzyme activities (BG, urease, NAG, and phytase) were higher in micro-aggregates (0.1-0.25 mm and < 0.1 mm), emphasizing the role of micro-aggregates in promoting organic matter decomposition and accelerating soil nutrient cycling. Compared to those in red soil, limestone soil exhibited greater differences in NAG and phytase activities among aggregates. The mean values of ln(BG): ln(NAG+LAP): ln(AP) of red soil and limestone soil as well as their aggregates were 1.02:1:1.04 and 0.95:1:0.93, respectively, generally conforming to the global average ratio of 1:1:1. The ln(BG): ln(NAG+LAP) and vector lengths were higher in red soil than in limestone soil, indicating stronger carbon limitation in the red soil. The ln(NAG+LAP): ln(AP) ratio was lower in red soil than in limestone soil, with the former having a larger vector angle, suggesting stronger phosphorus limitation. Soil pH and total phosphorus were identified as the primary influencing factors of enzyme activity stoichiometry characteristics, suggesting that the bioavailability of organic matter and phosphorus in acidic soil was lower than in limestone soil, prompting microbes to secrete carbon and phosphorus enzymes to enhance acquisition efficiency. The high pH of limestone soil may lead to nitrogen limitation due to nitrate leaching caused by higher mineralization and nitrification rates. Microbes in the large aggregates (1-2 mm and 0.5-1 mm) of both soils experienced stronger phosphorus limitation, whereas carbon limitation was stronger in micro-aggregates, especially in the 0.1-0.25 mm aggregates. The microbial nutrient pattern in limestone soil aggregates shifted from phosphorus limitation to nitrogen limitation from large to micro-aggregates. This study reveals the influence of soil type and aggregate on the soil microbial nutrient limitation patterns of soil microbial elements in subtropical forest soils of China.
Key words: red soil      limestone soil      aggregates      enzyme activity      enzyme stoichiometry      subtropical forests     

土壤胞外酶主要来源于土壤微生物代谢和土壤动物、植物根系分泌及其残体的分解释放, 能够有效地催化有机质的分解, 其活性受环境营养可利用性的调节[1, 2]. 土壤碳氮磷转化的胞外酶活性反映微生物能量和养分获取效率, 体现了微生物对于土壤碳底物及氮、磷养分的需求. 土壤酶活性不仅受土壤水热条件、pH、海拔、土层深度以及植被类型等环境因素影响[3 ~ 7], 也与土壤类型以及团聚体结构密切相关[8]. 不同土壤类型中微生物数量及酶活性通常存在着显著差异[9, 10]. 土壤酶化学计量比是指碳氮磷循环过程中关键胞外酶活性的比值, 能够反映土壤微生物碳氮磷元素需求及养分限制状况[11]. 基于酶生产资源分配理论, 微生物通过将有限资源分配到相对缺乏的养分的水解酶来最大限度地获取该养分以提高生产力, 从而改变相关酶浓度以及酶化学计量特征[12]. 前人通常利用β-1, 4-葡萄糖苷酶（BG）、乙酰葡糖胺糖苷酶（NAG）、亮氨酸氨基肽酶（LAP）和磷酸酶（AP）的比值[ln（BG）: ln（NAG+LAP）、ln（BG）: ln（AP）和ln（NAG+LAP）: ln（AP）]对参与碳氮磷循环的土壤酶化学计量比进行研究[13, 14]. Meta分析发现, 全球尺度上ln（BG）: ln（NAG+LAP）: ln（AP）趋于1:1:1[15], 碳氮磷代谢酶计量相对稳定. 然而在特定生态系统中, 土壤微生物的生长受到环境胁迫、养分限制、地上植被及土层深度等其他因子的影响, 进而影响酶的活性和表达, 土壤酶化学计量比可能不完全遵循1:1:1的关系, 其偏离程度可以反映土壤的养分限制[16, 17]. 基于该理论, 一系列研究都揭示了土壤酶化学计量特征在不同土壤、植被类型及土层深度之间的差异. Xu等[18]发现热带森林土壤微生物可能受更强的磷限制. 张星星等[19]研究也发现由花岗岩发育的土壤比砂岩土壤受更强的磷限制. 王晶晶等[20]研究发现不同植被类型对酶化学计量特征有显著影响, 混交林微生物碳限制普遍强于常绿阔叶林, 热带和亚热带森林土壤微生物普遍受磷限制. 张冠华等[21]发现土层深度显著影胞外酶活性及酶化学计量特征, 随土层深度增加, 酶活性逐渐降低且磷限制缓解. 综上可见, 土壤养分限制是一个相对性的概念, 不仅受到养分供给量的影响, 也与微生物利用养分的方式有很大关系[22].

在团聚体尺度上, 不同粒径团聚体间养分及其化学计量特征有较大差异[23], 导致微生物数量及群落结构差异较大, 物质能量转化速率相异[24], 土壤酶活性也因此不同[25]. 土壤大团聚体通过物理保护机制, 降低微生物对团聚体内部有机质的利用可及性；微团聚体比表面积较高, 表面吸附较多有机质和养分, 这可能提高了微团聚体中的酶活性[26, 27], 但也有研究表明, 土壤大团聚体促进了土壤通水通气性, 增强了土壤酶活性[8, 28]. 可见团聚体对土壤酶活性的控制受多重机制影响. 土壤团聚体尺度的酶活性计量特征反映了土壤微生物在不同团聚体中养分获取策略的不同, 进而决定了土壤的养分供给能力[29 ~ 32]. 团聚体粒径组成比例影响土壤碳氮磷养分的固持[33, 34]. 掌握土壤团聚体中微生物的代谢状况及限制因素是揭示微尺度土壤养分生物地球化学循环机制的关键.

中国南方亚热带气候带中广泛分布碳酸盐岩发育的石灰性土壤和花岗岩、砂岩和页岩等发育而成的红壤[35, 36]. 前人研究表明, 石灰性土壤有机质含量及赋存形态、pH和钙镁含量等均与同纬度红壤有很大差异, 微生物活性、群落结构及其土壤养分的获取方式也可能存在较大差异[37], 进而导致两者的酶活性和酶活性计量比也有所不同. 当前针对西南喀斯特脆弱生态环境的土壤养分转化特征及其调控机制尚未明晰, 不同研究所揭示的结果有较大差异：孙彩丽等[38]发现中国西南喀斯特地区的石灰性土壤存在磷限制；吴丽芳等[39]发现氮是影响喀斯特高原石漠化区微生物活性的主要限制因子；Chen等[40]发现红壤存在氮限制, 而石灰性土壤存在更强的碳限制, 两种土壤都受到磷限制. 现阶段石灰性土壤团聚体尺度的相关研究还较少展开, 对不同团聚体间微生物的代谢状况及限制因素的差异性所知甚少. 不同土壤类型团聚体之间的对比研究, 能够更好地揭示土壤酶活性及其计量特征之间的差异性和控制机制.

基于此, 本文以石灰性土壤与红壤两种森林土壤作为对比, 研究土壤团聚体碳氮磷转化过程的关键酶活性, 将土壤微生物代谢与团聚体尺度的微生境联系, 通过土壤酶的化学计量特征揭示养分限制特征规律及其驱动因子在不同土壤类型间的差异, 探讨团聚体尺度土壤养分限制特征, 以期为亚热带森林生态系统养分循环的研究和生态环境可持续管理提供科学理论依据.

1 材料与方法 1.1 研究区概况

研究区位于广西壮族自治区桂林市. 该区域平均海拔150 m, 气候属亚热带季风气候, 年均温为19.3 ℃, 7月平均气温为28.0 ℃, 1月平均气温7.9 ℃. 年平均无霜期309 d, 年平均降雨量1 949.5 mm, 平均蒸发量1 490~1 950 mm. 年平均相对湿度为73%~79%. 全年风向以偏北风为主, 平均风速为2.2~2.7 m·s-1. 年平均日照时数为1 670 h. 红壤采集于桂林国家森林公园（25°13'18.2″ N, 110°14'53.3″ E）, 植被类型主要为次生常绿阔叶林为主和混交针叶林, 土壤母质为花岗岩；中性石灰性土壤采集于芦笛岩景区（25°19'06.6″ N, 110°15'19.9″ E）, 植被类型主要为次生常绿阔叶林, 土壤母质为石灰岩.

1.2 研究方法 1.2.1 样品采集与处理

土壤样品采集于2020年7月, 在每个样地选择3个植物生长状况相近的采样点. 在每个采样点分别在1 m2范围内采集土壤剖面O/A层（芦笛岩和国家森林公园分别为0~3 cm和0~7 cm）和AB层（芦笛岩和国家森林公园分别为3~20 cm和7~20 cm）的土壤, 所采集的土样分别放入密封袋中密封, 去除土壤样品中大体积的石块、可见的枯枝落叶和根系后于4℃储存. 采用环刀法采样测定土壤饱和持水量（WHC）. 土壤样品过2 mm筛后分别用于测定：①土壤pH、总磷（TP）、铵态氮（NH4 +）、硝态氮（NO3 -）和土壤矿物质元素含量；②土壤总有机碳（TOC）和总氮（TN）含量（过100目筛）；③用湿筛法分离土壤团聚体. 土壤团聚体的分组参照国际通用的团聚体分级标准[41]和前人相关研究[42, 43], 采用恒温土壤团聚体分析仪（DIK-2012, Daiki, 日本）将原土按团聚体直径分为1~2、0.5~1、0.25~0.5、0.106~0.25及 < 0.106 mm这5组团聚体. 并根据分级标准将其分为大团聚体（直径 > 0.25 mm）和微团聚体（直径 < 0.25 mm）.

1.2.2 土壤酶活性的测定

为活化微生物活性并保持不同处理间的一致性, 土壤及其团聚体在酶活性测定前将含水量调节至60% WHC, 在25℃预培养7 d. 本研究测定了与碳、氮、磷获取相关的8种酶活性, 其中酶活性培养时间均为24 h, 酶活性测定土量、底物和方法步骤如表 1.

表 1 土壤酶活性测定土量、底物和方法 Table 1 Soil amount, substrate, and method for soil enzyme activity determination

根据公式（1）计算酶活性[44].

(1)

式中, A为土壤酶活性, nmol·h-1·g-1；F为样品校正后的荧光值；V为土壤悬浊液的总体积, mL；e为荧光释放系数；v为参考标准物的体积, mL；t为培养时间, h；m为风干土质量, g.

1.2.3 土壤理化性质的测定[48]

将土壤用2 mol·L-1盐酸酸化后, 采用元素分析仪（vario MICRO cube, 德国）测定土壤TOC和TN；TP采用钼锑抗比色法；pH采用电位法以2.5:1的水土比测定. NH4 +和NO3 -经0.5 mol·L-1硫酸钾溶液浸提后使用连续流动分析仪（Auto Analyzer III, 德国）测定. 钾（K）、钙（Ca）、钠（Na）和镁（Mg）经王水⁃高氯酸消解后用火焰原子吸收分光光度法测定.

1.3 数据处理与分析

根据Sinsabaugh等所提出的生态酶计量特征理论[49], 酶C: N: P化学计量比通过ln（BG）: ln（NAG+LAP）: ln（AP）计算. 同时, 采用公式（2）和公式（3）计算酶化学计量的矢量长度和矢量角度[50].

(2)
(3)

式中, SQRT（x2+y2）为（x2+y2）的平方根, ATAN2为从原点到点（x, y）的直线的反正切角, Degrees为该正切角角度. 其中x为相对碳和磷获取酶的活性比, 即ln（BG）: ln（AP）, 而y为相对碳和氮获取酶的活性比, 即ln（BG）: ln（NAG+LAP）. 向量长度相对表征碳的限制, 长度越长, 碳限制越强；向量角度表征土壤酶存在氮或磷限制, 大于45°表明存在磷限制, 小于45°表明存在氮限制[50].

运用IBM SPSS Statistics 26进行不同土壤和不同团聚体粒径之间酶活性及计量比特征的逐步回归分析以及单因素和双因素方差分析, 并采用沃勒-邓肯检验. 运用Canoco 5进行土壤理化性质与酶活性及酶化学计量特征的冗余分析. 运用R-vegan包的decorana函数对土壤理化性质和土壤酶活性及化学计量特征绘制相关性热图. 其他图形采用Origin 2021制图.

2 结果与分析 2.1 红壤和石灰性土壤及其团聚体理化性质

两土壤pH值差异显著, 而其各自土壤层间pH值差别不大（表 2）. 石灰性土壤TN、TP、TOC、Ca和NO3-含量均大于红壤. NH4+、Na、K和Mg含量在红壤与石灰性土壤同一土壤层间无显著差异. 两土壤O/A层的TN、TP、TOC、NH4+、NO3-、C: N、C: P和N: P均大于其AB层.

表 2 红壤和石灰性土壤基本性质1） Table 2 Soil properties of the red soil and limestone soil

石灰性土壤各团聚体中pH、TOC、TN和TP含量均大于红壤（表 3）. 除石灰性土壤AB层0.1~0.25 mm粒径外, pH在不同粒径间无明显差异. 红壤0.1~0.25 mm粒径的TOC、TN和TP含量较其他粒径偏低. 除石灰性土壤AB层0.25~0.5 mm粒径的TP含量大于O/A层外, 两土壤O/A层其余粒径的TOC、TN和TP均大于AB层. 红壤微团聚体C: N偏大, 而两土壤不同粒径间的C: P和N: P并无显著差异. 两土壤O/A层的C: N、C: P和N: P均大于其AB层.

表 3 红壤和石灰性土壤各团聚体组分的理化性质1） Table 3 Physiochemical properties of soil aggregates in red soil and limestone soil

在红壤O/A层及石灰性土壤O/A和AB层中, 大团聚体（1~2 mm和0.5~1 mm）比例较高. 石灰性土壤的大团聚体比例更高；红壤AB层团聚体主要以微团聚体为主, 而大团聚体的含量较低. 土壤有机质促进土壤团聚体的形成[51], 石灰性土壤中TOC含量较高（表 2）, 可能解释了该土壤中大团聚体的较高占比[52]；这说明石灰性土壤相较于红壤结构稳定性更高, 且O/A层结构稳定性高于AB层.

2.2 红壤和石灰性土壤原土和不同团聚体的土壤酶活性

不同土壤类型对8种酶均有显著性影响（图 1）. 碳获取酶中的蔗糖酶和淀粉酶在AB层呈现红壤高于石灰性土壤的特征, 分别比石灰性土壤平均高56.93%和11.63%.石灰性土壤则有更高的氮获取酶活性, 石灰性土壤的脲酶、NAG和LAP活性分别比红壤平均高38.84%、123.89%和4.06%；磷获取酶在两土壤间无显著性差异. 同一土壤中, 红壤和石灰性土壤的蔗糖酶、淀粉酶、BG、脲酶和LAP, 红壤的植酸酶和NAG以及石灰性土壤的AP活性均呈现O/A层高于AB层的趋势.

误差棒为标准差, n=9；不同大写字母表示酶活性在同一土壤的不同粒径间的差异显著, 不同小写字母表示土壤或土壤团聚体的酶活性在不同土壤类型和土层间差异显著（P < 0.05）；S表示不同土壤类型, A表示不同团聚体, S×A表示土壤类型和团聚体的交互作用, ns表示无显著性差异；图例中R表示红壤, L表示石灰性土壤 图 1 红壤和石灰性土壤原土和不同团聚体的酶活性 Fig. 1 Enzyme activities of bulk soils and different aggregates in red soil and limestone soil

多数碳氮磷转化水解酶（碳获取酶中的BG、氮获取酶中的脲酶和NAG以及磷获取酶中的植酸酶）活性在0.1~0.25 mm和 < 0.1 mm粒径的微团聚体中活性最高（图 1）. 蔗糖酶活性均呈现先减小后增大的趋势, 最高值出现在大团聚体及微团聚体中. 其他酶活性在不同粒径间差异不大.

2.3 红壤和石灰性土壤原土和不同团聚体的土壤酶化学计量特征

原土中, 红壤O/A层和AB层、石灰性土壤O/A层和AB层的ln（BG）: ln（NAG+LAP）分别为1.01、1.03、0.94和0.95；ln（BG）: ln（AP）分别为1.01、0.96、0.99和1.04；ln（NAG+LAP）: ln（AP）分别为0.98、0.93、1.05和1.09. 结果表明土壤类型对土壤酶化学计量特征均无显著影响（图 2）.

误差棒为标准差, n=3；不同大写字母表示酶化学计量比在同一土壤的不同粒径间的差异显著, 不同小写字母表示土壤或土壤团聚体酶化学计量比在不同土壤类型及土层间差异显著（P < 0.05）；S表示不同土壤类型, A表示不同团聚体, S×A表示土壤类型和团聚体的交互作用, ns表示无显著性差异；R表示红壤, L表示石灰性土壤 图 2 原土和不同团聚体的土壤酶活性的化学计量比 Fig. 2 Stoichiometric ratios of soil enzyme activities of bulk soils and different aggregates

土壤粒径对ln（BG）: ln（AP）和ln（NAG+LAP）: ln（AP）有显著影响, 土壤类型和土壤粒径的交互作用对ln（NAG+LAP）: ln（AP）有显著影响（图 2）. 两土壤O/A层的ln（BG）: ln（AP）、石灰性土壤的ln（NAG+LAP）: ln（AP）均呈现在大团聚体中（尤其是1~2 mm和0.5~1 mm）低于微团聚体（0.1~0.25 mm和 < 0.1 mm）的趋势. 两土壤AB层的不同团聚体间化学计量比的差异相对较小. 两土壤层相比, 微团聚体中O/A层ln（BG）: ln（AP）和ln（NAG+LAP）: ln（AP）的计量比均高于AB层.

在原土中, 矢量长度在土壤类型和土壤层间无显著性差异. 红壤O/A层、红壤AB层、石灰性土壤O/A层和AB层的矢量长度分别为1.43、1.41、1.38和1.41[图 3（a）]. 土壤类型对矢量角度有显著性影响, 红壤的矢量角度大于石灰性土壤, 且前者矢量角度大于45°, 后者小于45°[图 3（b）].

S表示不同土壤类型, A表示不同团聚体, S×A表示土壤类型和团聚体的交互作用, ns表示无显著性差异；R表示红壤, L表示石灰性土壤 图 3 土壤及其团聚体的酶矢量特征 Fig. 3 Vector characteristics of soil and aggregates

矢量长度在土壤粒径间无显著性差异[图 3（a）]. 红壤两土壤层矢量长度呈现先减小后增大再减小的趋势, 且O/A层大于AB层. 石灰性土壤两土壤层呈现一致趋势, 除了1~2 mm团聚体外, O/A层矢量长度大于AB层. 土壤粒径对矢量角度有显著影响[图 3（b）]. 随着团聚体粒径的减小, 红壤两土壤层矢量角度呈现先减小后增大再减小的趋势, 且均大于45°；石灰性土壤呈现先减小后增大趋势, 在1~2 mm和0.5~1 mm两组团聚体中接近47°, 在微团聚体中则小于或接近45°. 在微团聚体中, 两类土壤O/A层的矢量角度均低于AB层.

2.4 土壤酶活性及其化学计量特征的影响因素

单一土壤理化性质与土壤酶活性相关性较好, 但不能全面地反映土壤酶化学计量特征的变异（图 4）；这表明土壤酶化学计量特征的调控较为复杂, 受到多个因子的共同影响. 逐步回归分析结果表明（表 4）, TOC是蔗糖酶、淀粉酶、BG、脲酶和植酸酶活性的最主要解释因子, 分别解释了40.50%、40.00%、54.90%、77.20%和49.40%的变异. 土壤pH值和C: N分别解释了蔗糖酶和淀粉酶活性21.40%和36.20%的变异. TP、C: N和NO3 -分别解释了LAP活性9.20%、17.20%和63.00%的变异. 土壤N: P作为NAG活性的主要控制因子, 解释了其32.70%的变异. 酶活性计量特征中, 仅有土壤TP对ln（NAG+LAP）: ln（AP）的变异有18.50%的解释率.

矩形大小表示土壤酶活性及化学计量特征与土壤理化性质的相关性大小；*表示P < 0.05, **表示P < 0.01, ***表示P < 0.001 图 4 土壤酶活性及其计量比与土壤理化性质的相关性热图 Fig. 4 Heat map of the correlation between soil enzyme activity and its stoichiometric ratio with soil physiochemical properties

表 4 土壤酶活性及其计量比与土壤理化因子的逐步回归分析1） Table 4 Stepwise regression analysis of soil enzyme activities and stoichiometric ratios with soil physiochemical factors

RDA分析显示, 土壤理化因子解释了土壤酶活性变异的71.54%, 其中第1轴和第2轴分别解释变量的56.48%和15.06%[图 5（a）]；TOC因子为主要影响因子（表 5）. 土壤TOC、TN、TP和pH等因子与BG、NAG、脲酶和植酸酶均分布在同一象限方向, 表明土壤有机质和养分是控制这些酶活性的主要因素；而土壤C: N、C: P、N: P和NO3 -含量与蔗糖酶、淀粉酶和LAP分布象限较一致, 表明这几种酶活性受土壤元素计量的影响较大.

R表示红壤, L表示石灰性土壤；红色箭头表示自变量, 即土壤理化因子, 蓝色箭头表示因变量, 在（a）中为土壤酶活性, 在（b）中为酶化学计量特征 图 5 土壤理化因子对土壤酶活性及其化学计量特征的冗余分析 Fig. 5 The RDA analysis of soil physiochemical factors with soil enzyme activities and stoichiometric characteristics

表 5 冗余分析中解释变量对响应变量变异的贡献率排序 Table 5 Ranking of contribution rate of explanatory variables to the variation of response variables in redundancy analysis

土壤理化因子解释了土壤酶化学计量比变异的83.16%, 第1轴和第2轴分别解释变异的61.17%和21.99%[图 5（b）], 其中pH和TP为主要影响因子（表 5）. 土壤TOC、TN、TP和pH等因子与ln（NAG+LAP）: ln（AP）分布在同一象限而与矢量角度的方向相反, 表明土壤养分越充分, 土壤氮限制就越强. 土壤NH4 +和NO3 -含量与ln（BG）: ln（NAG+LAP）的方向相反, 表明土壤无机氮含量越高, 土壤碳限制反而越低；同时, 土壤C: N、C: P和N: P对土壤酶化学计量特征并无显著贡献；这表明土壤元素的比值并不能真正反映土壤微生物通过胞外酶获取土壤养分的机制.

3 讨论 3.1 不同森林土壤类型间土壤酶活性和酶化学计量比特征的差异

为了较全面地揭示土壤碳氮磷转化酶活性的特征, 本研究选取了亚热带森林酸性红壤和中性石灰性土壤的8种与碳氮磷获取相关的微生物胞外酶进行研究[39, 53]. 结果表明, 碳氮磷对应的酶活性在不同土壤类型和团聚体间的变化趋势有较大的不同, 这说明碳氮磷活性有机基团的分布和赋存形态在不同土壤类型和团聚体间有较大差异[31]. 不少研究亦发现酶活性在不同土壤类型间的差异. 如Chen等[40]在研究喀斯特典型生态系统酶活性影响因素时发现石灰性土壤酶活性普遍高于红壤. 徐秋芳等[54]在研究西天目山森林土壤酶活性时发现石灰性土壤与同海拔的红壤相比, 除了磷酸酶外各类酶活性都有不同程度地增强. 这都说明石灰性土壤较高的酶活性支持了土壤养分的快速循环. 冗余分析表明, 土壤TOC和总磷含量是酶活性的主要解释因子, 石灰性土壤较高的TOC和总磷对土壤中能量流动和物质循环以及微生物群落的繁衍起着关键性作用[40, 41]；另一方面, 酸性红壤中活性金属离子（如铝离子和铁离子）与有机质和磷形成稳定的有机-无机络合体, 降低了有机质和磷的生物可利用性[55, 56], 因此其微生物通过更高的碳和磷获取酶以提高获取效率；使得红壤和石灰性土壤有相当数量的碳获取酶和磷获取酶. 土壤有机氮是植物可利用氮素的重要来源[57], 石灰性土壤较高的pH值能促进土壤氮矿化[58], 使得石灰性土壤有更高的氮获取酶活性. 红壤与石灰性土壤O/A层土壤酶活性整体上均大于AB层, 说明土壤养分在O/A层较多, 酶活性分布具有明显的“表聚性”, 这与大多数土壤层对酶活性影响的研究结果一致[59, 60]. 这主要是由于土壤表层养分充足, 加之表层土壤孔隙度大, 水热条件和通气状况好, 微生物生长旺盛, 代谢活跃, 从而使表层土壤酶活性较高[61].

本研究中红壤和石灰性土壤及其团聚体的ln（BG）: ln（NAG+LAP）: ln（AP）均值分别为1.02:1:1.04和0.95:1:0.93, 总体上符合全球平均水平1:1:1. 红壤呈现碳磷共限制, 而石灰性土壤则主要呈现氮限制特征. 两种土壤相比, 红壤ln（BG）: ln（NAG+LAP）大于石灰性土壤, 且红壤矢量长度大于石灰性土壤, 说明红壤受到更强的碳限制. 尽管红壤C: N值更高, 但C: N与ln（BG）: ln（NAG+LAP）无相关性, 表明土壤元素计量比不能表征其养分相对供应能力[62]. 红壤ln（NAG+LAP）: ln（AP）低于石灰性土壤, 同时红壤矢量角度大于45°, 石灰性土壤总体上矢量角度小于45°, 表明两者相比, 酸性土壤磷限制更高, 石灰性土壤氮限制更高. 酸性土壤所呈现的磷限制符合Sinsabaugh所揭示的风化程度较高的土壤（如热带亚热带土壤）磷限制更强的特征[49]. 在酸性条件下, 无定形态及游离态铁铝氧化物吸附磷酸盐后会形成一层胶膜包被在磷酸盐表面, 使土壤中的磷素被Fe3+和Al3+固定为Fe-P和Al-P, 进而降低有效磷含量[56]. 另一方面, 石灰性土壤磷库主要以钙镁结合态磷形态存在, 与活性磷库形成沉淀-溶解平衡[56]（表 2）, 因而磷限制较小. 本研究表明, 土壤pH值（与铁铝活性相关）和TP是解释酶活性化学计量特征的主要影响因子, 印证了上述机制. 石灰性土壤的氮限制可能与其pH较高能够促进土壤硝化过程[63], 强烈的硝酸盐淋溶导致生物可利用氮缺乏的机制有关.

3.2 土壤团聚体对土壤酶活性及化学计量特征的影响

大团聚体主要由小团聚体通过根系、菌丝和多糖等胶结形成, 因此有机质含量和活性较高[64], 但团粒结构的物理保护降低了微生物对其有机质的生物可及性[65]；而小团聚体中有机质通常更稳定, 生物可利用性较低[66]. 在本研究中, 这两种机制的差异可能导致了不同酶活性在团聚体间的变化未呈现统一的规律性：多数碳氮磷转化水解酶（碳获取酶中的BG、氮获取酶中的脲酶和NAG以及磷获取酶中的植酸酶）活性在0.1~0.25 mm和 < 0.1 mm粒径的微团聚体中的活性最高. 这与卢怡等[67]和朱家琪等[68]所报道的团聚体酶活性随粒径减小而增强的规律相一致. 这表明大团聚体质量分数增加有利于土壤碳、氮和磷养分的保持和积累[23]；而微团聚体在促进有机质的分解, 加快土壤养分循环中的作用更大. 土壤酶活性在不同团聚体之间有不同的活性分布特征, 说明土壤不同粒径团聚体中微生物群落结构可能存在差异[24, 69], 导致了土壤养分循环机制的复杂性.

相比大团聚体, 两类土壤O/A层在微团聚体中均呈现了更高的ln（BG）: ln（AP）、更大的矢量长度, 表明两类土壤从大团聚体到微团聚体, 磷限制缓解而碳限制增强. 这种差异性可能是因为微团聚体有机碳稳定性高[64], 且因其比表面积大, 对磷有较强的吸附能力[70]. Wang等[31]报道喀斯特森林土壤团聚体的微生物主要受碳磷共同限制, 而在非喀斯特土壤中仅受磷限制, 且磷限制在较小团聚体中有所缓解；微团聚体中生物有效态的C: P值（即DOC: AP）更低, 这可能是由于微团聚体中磷限制缓解的机制. 红壤不同团聚体间有相似的ln（NAG+LAP）: ln（AP）且矢量角度大于45°, 这表明, 其团聚体中微生物活性的磷限制特征与原土一致. 石灰性土壤微团聚体更高的ln（NAG+LAP）: ln（AP）和更小的矢量角度则表明, 从大团聚体到微团聚体, 微生物活性的磷限制缓解而氮限制增强, 这表明石灰性土壤中丰富的Ca含量促进了磷的固持；随着微团聚体中有机质分解和磷的释放, 土壤磷有效性增强[71, 72]. 与同一类土壤O/A层相比, AB层微团聚体中有更高的磷限制特征, 表明O/A层微团聚体的磷养分有效性更高, 进一步印证了有机质分解对于磷有效性的贡献. 不同研究所报道的团聚体间微生物养分限制特征的差异性较大[29 ~ 32], 这表明其控制机制较为复杂, 需要更多的相关研究以更深入地揭示养分在不同团聚体中的分布和对微生物活性的限制规律. 关于土壤微生物资源限制特征的研究是当前的研究热点, 对于养分限制的判断标准依然有较大的不确定性[53], 在团聚体尺度上的相关研究目前开展也较少. 为更好地揭示陆地生态系统中化学计量学的微生物驱动机制, 以判断微生物营养限制及其影响因素, 需要增加在全球尺度上针对不同环境条件的代表性研究, 可为判断养分限制的经验模型提供更多理论依据.

4 结论

本研究评估了亚热带森林两种典型土壤类型（酸性红壤和中性石灰性土壤）及其团聚体中与碳氮磷获取相关的胞外酶活性及微生物资源限制情况. 两种土壤相比, 石灰性土壤氮获取酶活性更高, 碳磷获取酶活性差异不大；红壤主要为碳磷共限制, 石灰性土壤则主要为氮限制. 团聚体结构对土壤酶活性和酶化学计量特征有重要影响, 大团聚体对土壤有机质有更好的物理保护, 从而微团聚体中酶活性相对更高. 大团聚体主要呈现磷限制而微团聚体的碳限制增加. 本研究结果表明, 土壤微团聚体的增加促进了养分循环, 加速了有机质的分解. 因此, 为提高亚热带森林土壤的碳固存能力, 应通过增加物种多样性、减少对森林土壤人为干扰等方式, 提高土壤大团聚体的比例和土壤的稳定性, 以实现中国西南喀斯特生态系统中森林植被的保护和可持续利用.

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