作为在城市污水处理领域里广泛使用的生物处理工艺, 对碳、氮和磷等目标污染物进行高效稳定地去除是工艺运行控制与优化的终极目标^{[1, 2]}. 而作为工艺去除功能的直接承担者, 功能种群通过合理的组成与分布, 并且动态响应关键工艺调控参数的变化则是处理工艺能否达到目标的关键. 因此, 正确识别并准确捕捉活性污泥中功能微生物的组成与动态变化成为了城市污水处理研究中的重要内容, 也逐渐成为运行管理的重要数据基础^{[3 ~ 7]}. 从传统的显微镜观察和培养皿纯培养, 到早期低通量的分子生物学方法[变性梯度凝胶电泳（DGGE）、荧光原位杂交（FISH）和末端限制性片段长度多态性（T-RFLP）等], 从形态到功能上对关键微生物种群进行了初步的识别与定量^{[8 ~ 11]}. 以上研究不仅揭示了活性污泥中主要微生物种类的信息, 更重要的是通过微生物生态学方法对其组成和可能内部代谢功能与工艺整体去除功能之间建立了初步的联系, 为进一步的工艺操作优化和配置升级提供了重要的基础依据^{[12, 13]}. 随着生态位（niche）概念的确立, 不同丰度微生物在工艺整体运行过程中的作用不容忽视, 特别是以较少数量却占有较高相对丰度的核心种属（core community）对污染物去除的作用及对工艺稳定性的影响不容小觑^{[14, 15]}. 因此使用高通量分子生物学分析方法, 快速、精准和大批量获得微生物信息, 并在此基础上对活性污泥进行全面地正确解构将是未来城市污水处理工艺常规检测内容的重要组成部分, 而种群信息与相关环境信息系统性分析的结果则会是城市污水处理厂高效稳定运行调控策略构建的重要基础^{[16 ~ 21]}.

作为幅员辽阔的大国, 我国城市污水处理厂的地理特征、进水水质和工艺形式等环境因素不尽相同, 在处理形式多样[缺氧/好氧（A/O）、厌氧/缺氧/好氧（A²/O）、氧化沟（OD）和序批式反应器（SBR）]和调控方式多样的今天^{[22 ~ 25]}, 为了使得工艺的出水稳定符合日益严格的排放标准, 从活性污泥核心种群的组成角度出发, 选择适当的高通量分析方法, 与覆盖全球的成熟城市污水处理厂16S rRNA全长基因序列数据库详细比对, 解析组成我国活性污泥的核心种群和功能种群, 在属水平上深入全面了解核心种群的组成特点和生态功能, 挖掘重要功能种群的分布情况, 明确我国城市污水处理工艺活性污泥的组成分布和功能特点, 探究与工艺形式和进水组分间的相互影响关系, 为城市污水处理建设从数量化走向质量化奠定绿色高效精确调控策略的底层基础科学信息. 本研究以我国不同地理分区中6个大型城市的19个规范稳定运行的城市污水生物处理工艺为对象, 对各工艺中夏季与冬季的活性污泥样品进行采样, 利用Illumina MiSeq高通量测序后, 通过与包含全球740个污水处理厂和超过5百万条高质量16S全长序列的活性污泥数据库（microbial database for activated sludge, MiDAS）^[26]进行详细的比对与分类, 在与国外代表性核心种群和功能种群比较的基础上, 阐明我国城市污水生物处理工艺中活性污泥的核心种群组成及动态, 不同工艺中重要功能种群[硝化种群（Nitrifiers）、聚磷种群（PAOs）、聚糖原种群（GAOs）、反硝化种群（Denitrifiers）和丝状菌种群（Filamentous Bacteria）]的组成与分布特征. 尽管影响污水处理工艺去除性能的因素繁多, 但微生物群落组成及其动态是对处理过程起着决定性作用的关键因素, 也是未来污水处理工艺诊断的科学依据.

在全国6个大型城市中（北京、上海、昆明、重庆、哈尔滨和广州）选取了16家污水处理厂的19个稳定运行的典型大型城市污水生物处理工艺（见图 1）, 在夏季和冬季分别从各工艺曝气池中采集0.5 L活性污泥样本, 经均质化处理后冷冻在-80℃冰箱中备用.

图 1

Fig. 1

基于自然资源部标准地图服务网站下载的审图号为GS（2023）2767号的标准地图制作, 绿色文字为污水处理厂编号, 红色文字为其使用工艺 图 1 19座目标污水处理工艺的地理分布 Fig. 1 Distribution of the 19 targeted wastewater treatment plants in China

用Fast DNA Soil试剂盒（Q-BioGene, Carlsbad, CA, USA）, 按照说明书从250 μL样品中提取DNA, 基因组DNA的纯度和浓度用NanoDrop-ND-1000分光光度计测定. 使用引物（27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'和534R：5'-ATTACCGCGGCTGCTGG-3'）覆盖V1-V3高变区扩增16S rDNA基因. PCR扩增的条件为：95℃预变性2 min, 随后95℃变性20 s, 56℃复性30 s, 72℃延伸60 s, 进行30个循环, 最后72℃延伸5 min. 对PCR产物进行凝胶纯化, 纯化后的产物通过MiSeq平台（Illumina, San Diego, CA, USA）完成16S rRNA基因测序.

使用Quantitative Insights into Microbial Ecology（QIIME2）软件对高通量测序得到的原始序列数据进行过滤、拼接和去除嵌合体, 利用Uparse软件对所有样品的全部有效序列进行聚类, 以97%的相似性将序列聚类成为分类操作单元（OTU）, 对OTU代表序列进行物种注释分析. 采用贝叶斯算法将每个OTU代表序列与silva数据库对比, 进行系统分类学分析, 并分别在各个分类水平：域（domain）、界（kingdom）、门（phylum）、纲（class）、目（order）、科（family）、属（genus）和种（species）统计各样本的群落组成. 使用R语言工具采用Binary_jaccard算法对活性污泥样品的微生物进行主坐标分析（principal co-ordinates analysis, PCoA）并绘制PCoA图, 对不同污水处理厂的群落结构差异进行分析.

19个城市污水生物处理工艺分布在我国不同地域的6个大型城市中（北京、上海、重庆、昆明、哈尔滨和广州）, 且地理距离大于1 000 km；工艺包括A²/O、倒置A²/O（iA²/O）和前置厌氧+OD等生物强化除磷（EBPR）工艺, 也有部分在采样时为A/O和改良A/O（iA/O）等碳和氮去除工艺, 具有工艺类型的多样性；各工艺采样时的月均进出水水质和运行参数显示, 在采样时各处理工艺均基本处于稳定运行状态.

通过MiSeq高通量测序、测序数据质量控制与清洗和MiDAS数据库比对分类等步骤后, 在19个污水处理工艺冬季和夏季共38个活性污泥样品中共获得了大于150万个分类操作单元（OTU）, 隶属于2 521个属（> 94%置信区间）. 从图 2可以看出, 这些属在工艺中出现频率并不相同：有29个属在全部38个样品中均能观测到, 而1 901个属仅在1个或少数（样品数n < 10）样品中出现[图 2（a）]；同时这些属的丰度水平也不尽相同, 低出现频率属的丰度相对较低, 而高频率出现属的丰度则较高, 在38个样品中均出现的属其总丰度可达全部丰度的35%[图 2（b）].

图 2

Fig. 2

图 2 中国19个污水处理厂夏季和冬季采集的全部38份活性污泥样本中属水平OTU的数量及相对丰度 Fig. 2 Number and abundance of genus-level OTU from all 38 activated sludge samples of 19 Chinese MWTPs collected in summer and winter

一般来说, 通过丰度高低排序, 累计丰度占总丰度80%的种属可以认定为活性污泥中的核心种群^[27]. 在此次我国6个大型城市19个污水处理工艺夏季和冬季共38个活性污泥样品中, 存在着明显的核心种群：数量仅占全部种属10%的286个属, 其累计丰度可占总丰度的80%（图 3）；其中5个属的丰度累计占到了总丰度的22%, 24个属丰度占到了总丰度的27%, 72个属丰度占总丰度的35%, 而其余2 406个属只占总丰度的16%（图 4）. 尽管19个污水处理工艺分布在不同地区, 污水组成、温度和相关工艺参数也存在差异, 但结果表明, 我国城市污水处理工艺中显著存在着基本相同的核心种群, 承担着污染物去除的功能.

图 3

Fig. 3

图 3 19个中国污水处理厂的活性污泥中发现的ASV级分类群的相对累计丰度 Fig. 3 Cumulative abundance of ASV-level taxa in 19 activated sludge Chinese MWTPs

图 4

Fig. 4

颜色和圆圈大小表示每组ASV的数量 图 4 中国19个污水处理厂的ASV级分类群分布 Fig. 4 Distribution of ASV-level taxa across 19 Chinese activated sludge plants

图 5显示了活性污泥核心种群中丰度排名前50的OTU. 以上OTU基本上隶属于厚壁菌门（Firmicute）、绿弯菌门（Chloroflexi）、放线菌门（Actinobacteria）和变形菌门（Proteobacteria）；在门水平上与国内外的相关研究结果差别不大. 但通过MiDAS数据库识别与分类后, 以上OTU基本可以准确命名到属. 核心种群的优势属中主要以厌氧发酵和好氧/厌氧异养菌为主的碳去除种群：如在各种环境下均具有较强生存能力的芽孢杆菌（Bacillus和Lysinbacillus）, 具有底物发酵功能的厌氧发酵菌（Intestinibacter、Thermomonas）和兼性厌氧发酵菌（Entercoccus）, 好氧/厌氧的异养菌（Ferruginibacter、IMCC26207和Hyphomicrobium）；具有反硝化功能的Rhodoplanes、Ottowia和Iamia, 疑似具有反硝化功能的Paracoccus等功能种属. 同时还包括一些重要功能种群：丝状菌种属（Candidatus_Microthrix、Trichococcus、Defluviicoccus）；聚磷种属（Tetrasphaera）；聚糖原种属（Defluviicoccus）等. 与丹麦全国污水处理工艺所获得的活性污泥核心种属相比, 在前50个属中有27个属相同（图 5）, 包括严格厌氧发酵的Romboutsia, 活性污泥絮体的重要骨架丝状菌（Candidatus_Promineofilum）, 聚磷种属（Tetrasphaera）等重要的功能种群. 结合前期的研究工作^{[14, 15]}, 证明了在全球范围内, 作为城市污水生物处理工艺, 其活性污泥存在着较为相似的核心种属. 但值得注意的是, 与丹麦相比, 此次获得我国活性污泥核心种属的覆盖范围更大, 而且优势种属的丰度相对较低, 除了目标污水处理工艺的形式多样性要远远高于欧洲, 同时应该还存在着更多的影响因素.

图 5

Fig. 5

绿色表示与丹麦污水处理厂核心种属中相同的种属, 黑、灰色表示中国19个污水处理厂独特核心种属, 其中, 灰色表示在MiDAS数据库中尚无法分类到属级的种群 图 5 中国19个污水处理厂38个活性污泥样本中前50个属水平种群的丰度 Fig. 5 Abundance of top 50 genus-level taxa from 38 activated sludge samples of 19 Chinese MWTPs

在全国典型城市污水处理工艺38个活性污泥样品中存在着核心种群, 但每个样品活性污泥的具体构成及其相对丰度还是受到地理特征、温度、进水水质、工艺形式和调控方式等因素影响而有所不同. 利用主坐标分析（PCoA）和非度量多维尺度（NMDS）方法, 在属水平上进行相关因素影响下的活性污泥种群结构相似性与差异性分析, 可以较为清晰地发现影响活性污泥种群结构的关键因素.

按照不同因素（工艺形式、城市、季节和进水组分）对所有样品进行了PCoA和NMDS完整分析, 结果发现各样品活性污泥基于单一因素的差异性统计并未显示较强的规律性, 这也意味着活性污泥群落结构形成是多重因素的复合影响结果, 需要对现有因素分层排序后进行再次分析. 通过对污水处理工艺主要边界条件的系统整理, 工艺形式（或者说具备连续厌氧、缺氧和好氧的环境）对微生物的组成应具有更为显著的影响^{[28, 29]}. 因此, 对具有明确EBPR过程的14个工艺按不同进水组成成分进行了PCoA及NMDS分析, 结果显示在28个样品中（图 6）, 以城市生活污水为完全进水工艺（定义为城市进水比例 > 95%）其活性污泥结构差异性较小且相对聚集, 并且同含有工业进水（定义为工业进水比例 > 30%）工艺的微生物群落具有明显差异. 可以看出, 在微生物经历连续厌氧、缺氧及好氧环境的前提下, 进水组分（底物）对于活性污泥结构组成具有显著的影响.

图 6

Fig. 6

图 6 对从14家EBPR污水处理厂收集的总共28份活性污泥样本进行微生物群落非度量多维标度（NMDS）-主坐标分析（PCoA）分析 Fig. 6 Microbial community nonmetric multidimensional scaling (NMDS)-principal coordinate analysis (PCoA) analysis of a total of 28 activated sludge samples collected from 14 EBPR plants

针对活性污泥核心种群中的最优势属（Bacillus、Lysinibacillus、Romboutsia、Candidatus_Promineofilum、IMCC26207、Hyphomicrobium、Clostridium_sensu_stricto1、Trichococcus、Rhodobacter和Defluviimonas）, 同样系统考察工艺形式和进水水质对其丰度的变化影响, 同时还需考虑到温度影响的普遍性, 分析结果如图 7显示. 可以看出, 工艺形式、进水水质变化、季节性温度变化可以在一定程度上改变以上最优势属的丰度, 但各个优势属所受影响的程度并不相同：Bacillus受工艺形式、温度和进水组分变化的影响均很显著；而Trichococcus丰度受厌氧/缺氧/好氧环境和温度影响产生显著变化, 受进水水质的影响不明显；Hyphomicrobium受进水水质影响显著, Candidatus_Promineofilum仅受工艺形式的影响, Lysinibacillus、Romboutsia、IMCC26207、Rhodobacter和Defluviimonas丰度受这3个因素的影响变化不大；由于以上优势种属在过程中承担的功能并不相同, 因此对工艺的处理效果最终产生不同的影响.

图 7

Fig. 7

1.Bccillus, 2.Lysinibacillus, 3.Romboutsia, 4.Candidatus_Promineofilum, 5.IMCC26207, 6.Hyphomicrobium, 7.Clostridium_sensu_stricto1, 8.Trichococcus, 9.Rhodobacter, 10.Defluviimonas 图 7 中国污水处理厂属水平OTU前50位中最常见的10个属在不同工艺形式、进水水质和季节下的相对丰度 Fig. 7 Top 50 genus-level OTU of Chinese MWTPs abundance of ten most common genera under different bioprocesses, influent water quality, and seasons

此次采样中我国活性污泥的优势种属主要是隶属于Firmicutes门的Bacillus、Lysinibacillus和Romboutsia；相比之下, 丹麦污水厂活性污泥中最丰富的是Tetrasphaera、Trichococcus和Candidatus_Microthrix^[30]. 一方面, 有研究指出进行高通量测序时, 种群丰度往往与基因组中16S rRNA拷贝数紧密关联, 而Firmicutes门微生物的基因组通常含有5~10个拷贝, 在某些情况下甚至可达15个拷贝^[31], 这也是造成其丰度较高的原因. 同时, Firmicutes门细菌还具有较强的微污染物去除和重金属吸附能力^{[32 ~ 40]}. 而采样期间污水中化学物质如药物、雌激素和肥料等含量是欧美的5~10倍^{[41 ~ 48]}. 这也可能为此类细菌的优势生长提供了一定的环境条件.

对38个活性污泥中重要功能种群按照不同工艺形式、不同进水水质和不同温度条件进行了分类与统计, 其丰度变化结果如图 8所示.

图 8

Fig. 8

通过方格颜色比较分组间物种的丰度差异, 颜色约趋近红色表示对应的物种丰度越高；数字表示相对丰度 图 8 中国和丹麦污水厂中已知硝化细菌、反硝化细菌、聚磷菌、聚糖菌和丝状菌的存在情况 Fig. 8 Occurrence of known nitrifiers, denitrifiers, PAOs, GAOs, and filamentous bacteria in Chinese and Danish activated sludge plants

此次调研中城市污水生物处理工艺活性污泥中的硝化种群（Nitrifiers）主要由氨氧化菌（AOB）Nitrosomonas和亚硝酸氧化菌（NOB）Nitrospira构成, 这与世界范围内其他地区的研究相吻合. 从图 8可以看出, 包含完整厌氧/缺氧/好氧过程的EBPR工艺中AOB和NOB的丰度相对较高, 而相同污水处理工艺其夏季时的丰度要高于冬季时的丰度. EBPR工艺一方面与其他工艺相比其具有较长的水力停留时间（HRT）和污泥停留时间（SRT）, 能够给予自养菌较为充分的生长时间；同时也因为EBPR工艺的COD去除较为完全, 在好氧阶段有足够的留给硝化种群. 但值得注意的是, 在部分污水处理工艺中, 尤其是非EBPR工艺中其NOB丰度相对较低, 这也许是造成其TN去除效果不佳的可能原因. 考虑到所有样品中NH₄⁺-N均可以稳定去除, 而现有属水平的硝化种群数量丰度并不是很高, 因此很可能存在潜在硝化功能微生物参与其中. 此外, 与丹麦城市污水活性污泥中硝化功能种群及其平均丰度进行比较, 主要种水平上的优势OTU基本分布相似, 但丹麦冬季EBPR出现的Nitrotoga在此次采样的污水处理工艺中并未体现.

在之前很长一段的研究中, Candidatus_Accumulibacter被视为EBPR工艺中的主要聚磷菌, 然而随着放线菌属Tetrasphaera功能的逐步确认, 它被认为是污水生物处理工艺中的主要聚磷功能微生物. 在早期开展相关研究的丹麦, 其污水处理工艺活性污泥中的Tetrasphaera作为核心种群优势属, 几乎可占总丰度的10%, 且普遍高于Candidatus_Accumulibacter. 在此次采样中, Tetrasphaera同样作为主要优势PAOs广泛地分布在我国各个类型污水处理工艺的活性污泥中, 且冬季的丰度要高于夏季, 但与丹麦相比丰度较低. 值得注意的是, Tetrasphaera可在缺氧条件下生存, 仅在严格厌氧条件下进行除磷作用, 这也解释了为什么在普通A/O工艺中存在较高的Tetrasphaera；同时也可以认为, 只要提供合格厌氧条件, 普通碳、氮去除工艺是有可能很快具有生物除磷功能. 而与聚磷种群处于竞争关系的GAOs, 如γ-变形菌中的Candidatus_Competibacter（GB1）和属于α-变形菌的Defluviicoccus同样在此次所有的工艺中广泛存在, 但相对丰度要低于PAOs. GAOs的存在和丰度变化会对EBPR工艺除磷性能产生影响, 但大多数GAOs是较为重要的除碳种群.

反硝化功能种属是活性污泥中最为复杂的种群之一, 牵涉种属较多. 结果显示Rhodobacter和Paracoccus是此次调研我国污水处理工艺中的主要优势反硝化功能种属, 在工艺中分布广泛且均匀, 在相同工艺中冬季的丰度要高于夏季的丰度；Sulfuritalea和Thauera为次要的反硝化种属, 而Rhodoferax和Zoogloea的丰度要相对更低. 与丹麦污水处理工艺中的反硝化种属相比较, 我国的反硝化优势种属相对集中, 其异养生长碳源种类较多, 代谢方式多样, 这可能也是其成为优势种属且丰度较高的原因.

丝状菌种属是污水生物处理过程中的重要功能种群, 一方面它是重要的活性污泥骨架菌, 同时过度生长又可能诱发膨胀和发泡现象, 造成固液分离困难. 丝状菌的整体种群动态此前依靠形态学鉴定为主且只能进行半定量；而单一种群尽管可以通过荧光原位杂交（FISH）准确鉴定, 但实验过程较长且成本较高. 此次高通量测序与MiDAS数据库进行比对鉴定, 展示了较为完整和准确的丝状菌种群构成和分布特征. 我国活性污泥中丝状菌种群在门水平主要以Actinobacteriota和Choloflexi为主. 在属水平上, 最优势种属则是Candidatus_Microthrix（微丝菌）, 且在所有污水处理工艺中广泛存在, 冬季丰度要高于夏季丰度；作为诱发污泥膨胀的主要丝状菌, 它的丰度变化和分布状态也与我国污水处理工艺冬季普遍出现污泥膨胀现象相吻合. 值得注意的是, Choloflexi门中的Candidatus_Promineofilum属（在Eikelboom形态分类法中命名为Type0092型）作为活性污泥骨架的丝状菌广泛分布在所有工艺中且具有相对较高的丰度, 特别是它具备厌氧发酵功能, 因此在EBPR工艺中具有更高的平均丰度. Trichococcus（在Eikelboom形态分类法中命名为Nostocoida limicola I）作为发酵菌可在缺氧和好氧环境中生长, 因此在所有污水处理工艺中均以较高丰度存在, 并且温度对其具有与Candidatus Microthrix相同的影响趋势——冬季丰度高于夏季丰度. 隶属于放线菌门、具有表面疏水性和引起发泡现象的丝状菌[Skermainia和Gordonia（在Eikelboom形态分类法中命名为Mycolata, 也称为诺卡氏菌）], 同样广泛存在但丰度相对较低. 与丹麦的丝状菌种群数据比较, 尽管地理距离甚远, 但优势种属（Candidatus_Microthrix, Candidatus_Promineofilum和Trichococcus）的类型和丰度的基本一致, 这也意味着城市污水生物处理过程中功能种群分布的普遍性和统一性.

在对我国6个大型城市的19个典型城市污水生物处理工艺进行冬季和夏季系统采样后, 利用高通量测序与MiDAS数据库对比分类, 获得了活性污泥中核心种群、优势种属及功能种群的组成和动态, 并与丹麦城市污水处理工艺活性污泥的相关种群进行了比较. 以厌氧发酵、好氧/厌氧等异养碳去除功能为主的胶团菌和丝状菌所构成的活性污泥核心种群是城市污水生物处理工艺的基础, 在我国典型的城市污水处理工艺中广泛分布并显著存在, 其优势种属动态会受到工艺形式、进水水质和温度的影响. 而对硝化、反硝化、聚磷、聚糖原、丝状菌等功能种群的统计分析, 可以更加清晰地认识活性污泥及其工艺污染物去除性能变化与种群组成分布间的关系. 即使我国城市与丹麦城市的地理距离极远, 工艺运行参数不尽相同, 但再次验证了城市污水生物处理工艺的活性污泥中广泛存在核心种群, 并且具有相似的组成和生态功能. 高通量的测序方法和准确的数据库, 对微生物群落分析非常有效, 也是正确认识活性污泥的基础. 而未来针对特殊门类水平的微生物还应认真考虑其基因组所含16S rRNA基因拷贝数目对测序结果的影响, 以期对微生物种群获得更为准确的认识.