2024, Vol. 45
2. 河南大学地理与环境学院, 开封 475004;
3. 河南省土壤重金属污染控制与修复工程研究中心, 开封 475004
, GE Shi-ji1,2 , ZHENG Wen-xiu1,2 , LIU Jin-hui1,2 , CHEN Ming1,2 , KONG Yu-ke1,2 , WANG Yang-yang1,2,3
2. College of Geography and Environmental Science, Henan University, Kaifeng 475004, China;
3. Henan Engineering Research Center for Control & Remediation of Soil Heavy Metal Pollution, Kaifeng 475004, China
随着工业化进程的加快, 重金属引发的土壤污染问题备受关注. 2014年全国土壤污染状况调查公报显示, 我国镉(Cd)污染土壤点位超标率高达7.0%[1]. Cd是一种非必要微量元素, 具有高毒性、强流动性和难降解性等特点, 可通过农作物进入食物链威胁人类健康. 有研究显示, 人体长期摄入含Cd的食物会导致不可逆的肝功能障碍、软骨疾病和肾损伤[2, 3]. 为保障人体健康和环境可持续发展, 研发土壤Cd污染高效修复技术、降低其对人体的潜在健康风险刻不容缓.
近年来, 国内外研究人员针对Cd污染土壤修复技术进行了大量的研究, 开发了包括钝化修复、电动修复、植物修复、微生物修复及联合修复等一系列高效修复技术[4 ~ 6]. 其中, 钝化修复因其修复效率高、实施方便等优点受到了研究人员的广泛关注[7]. 而钝化修复的关键在于钝化剂的选择. 生物炭作为一类由生物质高温炭化形成的高度芳香化材料, 具有高比表面积、丰富的孔隙结构和表面官能团等特点[8, 9], 能够在一定程度上钝化土壤Cd污染. 但初始生物炭对土壤中Cd的钝化能力有限, 且过量的生物炭还会导致土壤盐碱化[10]、降低土壤中氮和锰的生物有效性, 进而影响其生产能力和生态功能[11]. 因此, 为获取对Cd钝化效率更高、与土壤兼容性更好的生物炭, 须对生物炭表面结构及理化特性进行修饰和调整.
目前, 已有多种改性生物炭被用于Cd污染土壤的钝化修复[12, 13]. 研究人员尝试利用氢氧化物、硝酸、磷酸盐及有机溶剂等对生物炭进行改性[14], 改性后生物炭表面官能团数量及比表面积均出现了显著的增加, 进而提高了生物炭对土壤中Cd的钝化能力[15]. 此外, 还有研究发现磷酸改性生物炭和S掺杂生物炭对土壤中Cd具有极强的钝化能力[16, 17], 但改性生物炭施用会对土壤微生物群落结构及多样性产生较大的影响[18, 19]. Wang等[20]也发现含酚类化合物的生物炭可显著改变土壤细菌和真菌的群落结构, 并降低了土壤真菌的α多样性. 但目前多数研究仅报道了生物炭对土壤微生物的影响效果, 而关于生物炭/改性生物炭对土壤微生物群落的影响途径还鲜有报道.
基于此, 本研究以牛粪为原材料制备牛粪生物炭(BC)和巯基改性牛粪生物炭(SBC)并用于Cd污染土壤的钝化修复, 探究BC和SBC对土壤理化性质、Cd生物有效性及土壤微生物群落的影响规律, 同时利用结构方程模型解析BC和SBC对土壤微生物群落影响路径.
1 材料与方法 1.1 供试土壤和钝化材料供试土壤取自河南省济源市某铅锌冶炼厂周边农田(112°31'31.8″E, 35°08'22.1″N). 将采集的表层土壤样品(0~20 cm)置于通风处自然风干, 挑出杂物后, 过18目尼龙筛备用. 供试土壤基本理化性质如表 1所示.
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表 1 土壤样品基础理化性质 Table 1 Basic properties of the soil samples |
本研究所使用的牛粪取自河南省开封市城郊某畜牧场(114°18'23.5″E, 34°53'20.0″N).牛粪自然风干后研磨过18目尼龙筛, 储存于自封袋中备用. 取处理后的牛粪置于管式炉, 在氮气保护条件下, 以10 ℃·min-1升温至400 ℃, 热解2 h, 获得BC. 将BC研磨并过60目尼龙筛, 装入自封袋中备用.
取25 g处理后的牛粪分散于500 mL磷酸溶液(6 mol·L-1), 25 ℃、200 r·min-1下振荡24 h后过滤并置于60 ℃烘箱中烘干；将干燥后的牛粪置于管式炉, 以10 ℃·min-1升温至400 ℃, 热解2 h后获得初始改性生物炭. 取10 g初始改性生物炭置于200 mL 3-巯基丙基三甲氧基硅烷溶液(3-MPTS∶CH3CH2OH∶超纯水= 1.2%∶9.6%∶89.2%；体积比), 以25 ℃、175 r·min-1振荡24 h后利用去离子水多次冲洗, 固液分离后于35 ℃真空干燥12 h获得SBC. BC和SBC基本理化性质如表 2所示.
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表 2 BC和SBC基本理化性质 Table 2 General properties of the BC and SBC |
1.2 实验设计
取300 g供试土壤, 分别按质量分数0.5%、1.0%和1.5%的添加量加入BC和SBC(分别命名为：BC-0.5、BC-1.0和BC-1.5及SBC-0.5、SBC-1.0和SBC-1.5), 充分混合后置于聚乙烯容器(500 mL), 加水使其水分含量达到最大田间持水量的60%左右, 将混合物置于室温下进行培养, 每个处理设置3个重复. 在培养过程中采用称量法补充损失的水分, 培养周期为45 d. 培养完成后将土壤样品分成两部分, 一部分储存于-80 ℃冰箱用于土壤微生物群落分析；另一部分自然风干后, 研磨、过筛用于后续实验分析.
1.3 分析检测土壤pH采取电位法进行测定(水∶土= 2.5∶1)[21]；土壤速效磷和速效钾分别使用浓度为0.5 mol·L-1 NaHCO3溶液和1 mol·L-1 NH4Ac溶液进行提取, 利用分光光度法及火焰光度法进行检测[22]；土壤碱解氮含量采用碱水解法进行测定[23]；土壤有机质采用重铬酸钾氧化法进行测定[24]. 土壤有效态Cd(DTPA-Cd)使用二乙烯三胺五乙酸-氯化钙-三乙醇胺(DTPA-CaCl2-TEA)缓冲溶液进行提取(固液比为1∶5), 利用电感耦合等离子体原子发射光谱仪(ICP-AES)进行检测[25]. 土壤中Cd的总量测定采用HNO3-HF-HClO4消解法进行消解, 利用ICP-AES进行测定[26].
土壤细菌高通量测序由江苏安升达生物科技股份有限公司完成. 具体操作流程如下：采用DNA提取试剂盒(HiPure Stool DNA Kit)对土壤细菌总DNA进行提取, 并使用Qubit® dsDNA HS Assay Kit检测DNA浓度；利用“CCTACGGRRBGCASCAGKVRVGAAT”为上游引物和“GGACTACNVGGGTWTCTAATCC ”为下游引物对细菌16S rRNA基因V3和V4区进行扩增；采用Illumina MiSeq/Novaseq(Illumina, San Diego, CA, USA)进行高通量测序；使用Silva 138数据库比对16S rRNA基因, 利用贝叶斯算法对OTU的代表性序列进行物种分类学分析.
1.4 数据处理采用IBM SPSS Statistics 22.0求取平均值并进行差异显著性分析(Duncan's test P < 0.05), 使用Origin 2021绘制图表. 利用R语言构建结构方程模型分析BC和SBC对土壤微生物群落的影响机制：将BC和SBC施用量设定为外生变量, 土壤理化性质(pH、速效钾、速效磷、碱解氮和有机质)为内生变量, DTPA-Cd和细菌群落结构为内生解释变量, 使用卡方自由度(Chisq/df)、拟合指数(GFI)、标准化残差(SRMR)和近似均方根误差(RMSEA)对模型进行验证, 符合RMSEA < 0.08, SRMR < 0.08, GFI > 0.90, Chisq/df < 3, 则模型拟合结果较好[27].
2 结果与讨论 2.1 BC和SBC对土壤理化性质的影响BC和SBC对土壤理化性质的影响如表 3所示. 从中可知, 与CK相比, BC及SBC显著提高了土壤pH值(SBC-1.5除外, P < 0.05), 分别从7.7提高至7.8~8.3. 前期报道显示, 生物炭含有碱性矿物和碳酸盐, 可提高土壤pH[28, 29], 虽然改性过程使BC表面的碱性矿物被溶解, 导致SBC的pH值降低(pH 2.40), 但SBC在土壤培养过程中表面含氧官能团的分解及内部碱性矿物的缓慢释放也可使土壤pH值升高[30]. BC及SBC均显著降低了土壤中碱解氮的含量(P < 0.05), 这主要是由于生物炭/改性生物炭可促进土壤中铵态氮的转化, 造成土壤铵态氮降低、硝态氮增加, 进而导致土壤碱解氮含量下降[31]. BC和SBC均提高了土壤速效磷含量, 其中SBC对速效磷的增加幅度约为BC的4.6倍. 这主要是由于在制备巯基改性牛粪生物炭时为扩大牛粪生物炭的比表面积对牛粪进行了磷酸(6 mol·L-1)预处理, 造成SBC中速效磷含量增加(BC和SBC速效磷含量分别为168.48 mg·kg-1和1 655.93 mg·kg-1), 因此在加入土壤后均可在一定程度上提高土壤中速效磷的含量. 此外, BC和SBC均在一定程度上提高了土壤中速效钾含量, 其中SBC-0.5、BC-1.5和SBC-1.5处理中土壤速效钾的含量均显著高于CK(P < 0.05), 分别从82.63 mg·kg-1增加至102.60、103.78和97.90 mg·kg-1. 同时, BC和SBC的添加还增加了土壤有机质含量, 且土壤有机质含量随着BC和SBC添加量的增加而增加, 在BC和SBC添加量为1.0%以上时, 土壤有机质含量均显著高于CK(P < 0.05).
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表 3 不同处理对土壤基本理化性质的影响1) Table 3 Effect of soil properties under different treatments |
2.2 BC和SBC对土壤Cd有效态的影响
BC和SBC对土壤Cd有效态的影响如图 1所示. 从中可知, BC对土壤Cd有效态的影响相对较小, 0.5%的BC虽能将土壤Cd有效态含量从0.70 mg·kg-1显著降低至0.59 mg·kg-1(P < 0.05), 但随着BC添加量的增加, 土壤Cd有效态含量并未继续下降, 且BC-1.0及BC-1.5处理中Cd有效态与CK相比均无显著变化(P≥0.05). 而SBC则可显著降低土壤Cd有效态含量(P < 0.05), 与CK相比, 土壤Cd有效态含量可分别从0.70 mg·kg-1降低至0.17 mg·kg-1(SBC-0.5)、0.10 mg·kg-1(SBC-1)和0.16 mg·kg-1(SBC-1.5), 钝化效率分别达到75.71%、85.71%和77.14%, 但随着SBC添加量的增加土壤Cd有效态含量并未出现显著的变化(P≥0.05).
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不同小写字母表示不同处理间的显著性差异(P < 0.05) 图 1 BC及SBC对土壤Cd有效态的影响 Fig. 1 Effect of BC and SBC on Cd availability in contaminated soil |
SBC对土壤中Cd的钝化效果明显优于BC, 说明巯基改性对提高生物炭钝化土壤Cd污染具有显著的作用, 本研究结果与前期报道基本一致[17, 32]. 但SBC对土壤中Cd的钝化效果明显优于前期报道. Wu等[32]研究显示硫改性竹子生物炭(1%, 质量分数)可使土壤Cd有效态降低72.01%；Zhu等[17]研究表明, 添加2%(质量分数)的巯基改性生物炭可使土壤Cd有效态降低68.00%. 而本研究中SBC在添加量为1%时即可将土壤Cd有效态降低85.71%, 说明SBC在土壤Cd污染钝化修复中具有更高的应用潜力.
SBC对土壤中Cd的高效钝化能力可归结于以下几个方面. 首先, 原始生物炭经过改性后比表面积出现了显著地增加, 与BC相比, SBC的比表面积从11.03 m2·g-1升高至84.61 m2·g-1. 同时, 改性过程有效改变了生物炭的元素组成, 其中ω(S)从0.00%增加至1.04%、ω(O)从8.00%增加至12.12%. 生物炭表面含O官能团及含S官能团均可与Cd高效结合, 从而实现土壤Cd的高效钝化[33, 34]. 此外, SBC的添加改变了土壤理化性质, 进而间接提高其对土壤中Cd的钝化效果. 生物炭本身具有强碱性(K2O、Na2O、K2CO3和Na2CO3等)[35], 在提高土壤pH值的同时会加速土壤孔隙水中阴离子的解离, 并与土壤中活性Cd结合形成沉淀[Cd(OH)2和CdCO3], 从而降低Cd的生物有效性[36, 37]. 同时, SBC还显著提高了土壤中速效磷的含量, 土壤孔隙水中的PO4 3-可与Cd发生反应, 生成稳定的含Cd磷酸盐[Cd3(PO4)2, Ksp=2.53×10-33]及Cd磷酸盐矿物[Cd5(PO4)3OH, Ksp=2.53×10-64.62][38, 39], 从而进一步提升SBC对土壤中Cd的钝化效果.
2.3 BC和SBC对土壤微生物群落的影响使用Illumina MiSeq平台对土壤样品中细菌的群落组成及丰度进行分析. 结果表明, 细菌群落的覆盖率在97.9%~98.0%之间, 说明测序结果可充分揭示所有样品中的细菌多样性. 土壤中细菌α丰富度指数(Ace指数和Chao指数)和多样性指数(Shannon指数)如表 4所示. 由表 4可知, BC和SBC的添加均在一定程度上降低了土壤中细菌的丰富度和多样性, 但与CK相比均不显著(P≥0.05). 此外, 0.5%的BC可使土壤细菌群落OTU数量从3 003增加至3 037, 但随着BC添加量的继续增加土壤细菌群落OTU数量呈下降的趋势；虽然SBC降低了土壤细菌OTU数量, 但随着SBC添加量的增加土壤细菌OTU数量呈上升的趋势, 而BC和SBC对土壤细菌OTU数量的影响与CK相比均不显著(P≥0.05). 由此可知, BC和SBC的添加虽然对土壤微生物的丰度及多样性有一定的负面影响, 但该影响相对较小.
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表 4 不同处理对土壤微生物群落丰富度和多样性指数的影响1) Table 4 Effect of abundance and diversity of soil microbial community under different treatments |
2.4 BC和SBC对土壤微生物群落组成的影响
不同添加量的BC和SBC对土壤微生物群落组成的影响如图 2所示. 由图 2(a)可知, 相对丰度较高的门分别为：Proteobacteria(31.7%~43.1%)、Acidobacteriota(18.0%~21.2%)、Bacteroidota(11.8%~16.8%)、Gemmatimonadota(6.3%~10.6%)、Actinobacteriota(3.9%~7.5%)、Firmicutes(0.8%~2.0%)、Myxococcota(1.0%~1.6%)和Cyanobacteria(0.2%~0.7%). 不同添加量的BC使Bacteroidota和Cyanobacteria的相对丰度分别增加了29.6%和52.0%, 但降低了Gemmatimonadota和Myxococcota的相对丰度. 而SBC的添加仅提高了土壤中Proteobacteria(15.1%~20.8%)、Bacteroidota(12.5%~22.6%)和Cyanobacteria(63.1%~64.7%)的相对丰度, 其它细菌门的相对丰度均出现了不同程度的下降.
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(a)门水平, (b)属水平 图 2 门和属水平微生物群落的相对丰度 Fig. 2 Relative abundance of the soil microorganisms at phylum and genus levels |
BC和SBC对土壤微生物群落属水平的影响如图 2(b)所示. 从中可知, 土壤中相对丰度较高的属分别为：RB41(8%~10%)、Sphingomonas(7%~10%)、Pseudomonas(0%~12%)、Flavisolibacter(2%~4%)、Massilia(2%~4%)、Ellin6055(1%~3%)、Subgroup_7(1%~3%)、MND1(1%~3%)、Brevundimonas(0%~3%)和Limnobacter(0%~5%). 不同添加量的BC使得Massilia、Brevundimonas的相对丰度分别增加了9.7%~58.0%和62.5%~93.5%, 但降低了Subgroup_7、MND1和Limnobacter的相对丰度. 而SBC的添加提高了Pseudomonas(84.4%~96.5%)、Brevundimonas(66.7%~92.3%)和Limnobacter(22.2%~84.0%)的相对丰度, 其它细菌属的相对丰度均出现了不同程度的下降.
利用LEfSe(LDA得分≥3.0)进一步分析在门、科和属分类水平上受BC及SBC影响具有显著差异的类群(图 3). LEfSe分析显示, CK土壤样品中具有显著差异的类群主要为Gemmatimonadota、Sphingomonadaceae、Nitrosomonadaceae和Ellin6055等19个；BC-0.5土壤样品无显著差异的类群；BC-1.0土壤样品中具有显著差异的类群为Oxalobacteraceae、Hymenobacteraceae、Adhaeribacter和Caenimonas；BC-1.5土壤样品中具有显著差异的类群主要为Bacteroidota、Actinobacteriota、Microscillaceae和Flavisolibacter等13个；SBC-0.5土壤样品中具有显著差异的类群为Methylophilaceae、Methylotenera、Moraxellaceae和Rhodanobacteraceae；SBC-1.0土壤样品中具有显著差异的类群主要为Patescibacteria、LWQ8、Chitinophagaceae和Blastocatellales等10个；SBC-1.5土壤样品中具有显著差异的类群主要为Pseudomonas、Burkholderiales、Methyloversatilis和Saccharimonadales等7个. 其中, SBC-0.5处理中Methylophilaceae具有最高的LDA得分, 其次分别是SBC-1.5处理中的Pseudomonas、BC-1.5处理中的Bacteroidota和SBC-0.5处理中Methylotenera等. 与CK相比, 各处理组之间均出现不同显著差异的细菌类群, 可能是因为生物炭/改性生物炭的添加改变了土壤微生物群落结构, 增加了敏感类群的丰度[40]. 同时, SBC处理中出现的具有显著差异的细菌可能与土壤Cd钝化具有直接关系[41, 42].
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图 3 不同处理中土壤微生物的LEfSe分析 Fig. 3 LEfSe analysis of soil microorganisms under different treatments |
基于结构方程构建生物炭-土壤理化性质-有效态Cd-土壤细菌群落结构之间的驱动与耦合模型. 选取相关变量(生物炭施用量、pH、速效磷、速效钾、碱解氮及有机质)整合到结构方程模型, 构建初始模型、检查模型以及对预测变量进行参数化, 最终获得通过检验的结构方程模型(图 4). 由图 4可知, BC和SBC构建的结构方程模型对土壤Cd有效态的总解释度分别为35.0%和97.0%, 而对土壤细菌群落结构的解释度则均为54.0%. 模型显示, BC与土壤微生物群落表现为负相关关系, 可对土壤微生物群落产生间接影响, 这主要与生物炭本身的潜在毒性相关[18]. 此外, BC还可通过提高土壤pH值、速效磷、速效钾、碱解氮和有机质含量对土壤微生物群落产生间接影响.
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箭头上的值表示标准路径系数；箭头粗细表示相关程度；绿色、红色、虚线和实线箭头分别表示正相关关系、负相关关系、无显著相关和显著相关；*、**和***分别表示P < 0.05、P < 0.01和P < 0.001；R 2表示路径解释度 图 4 BC和SBC对土壤细菌群落结构的SEM分析 Fig. 4 Analysis of structural equation model of BC and SBC on soil bacterial community structure |
SBC可对土壤微生物群落产生间接影响, 且与土壤微生物群落表现为正相关关系. SBC还可通过提高土壤pH值、速效磷、速效钾和有机质含量以降低土壤Cd有效态含量(P < 0.05), 进而降低Cd对土壤微生物的毒性, 为土壤优势菌群的生长繁殖提供适宜的环境. 土壤碱解氮与细菌群落结构表现为正相关关系, 而土壤有机质与细菌群落结构表现为显著负相关关系(P < 0.05). SBC对土壤微生物群落表现为正相关关系可能是因为原始生物炭改性过程改善了其表面结构及元素组成, 为土壤微生物提供了适宜的能源物质和栖息场所[43, 44]. 但生物炭/改性生物炭对土壤微生物群落的影响受多种环境因子协同作用[45], 使得SBC与土壤微生物群落表现为显著正相关关系, 而BC与土壤微生物群落表现为负相关关系.
3 结论BC和SBC均提高了土壤速效钾、速效磷和有机质含量, 但仅SBC显著降低了土壤中Cd有效态的含量. 此外, BC和SBC均提高了土壤中优势菌群的相对丰度, 但降低了土壤微生物群落的多样性. 结构方程模型显示, BC与土壤微生物群落表现为负相关关系, 而SBC则可通过提高土壤pH值、速效磷、速效钾和有机质显著降低土壤Cd有效态含量, 进而对土壤微生物群落造成影响.
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