2024, Vol. 45
2. 保定市清苑区农业技术推广中心, 保定 071100;
3. 中国农业科学院农业环境与可持续发展研究所, 北京 100081
, ZHAO Qing-zhao1 , WANG Fang2 , AN Tian-ci1 , NIU Jing-jing1 , YAN Jia-xin1 , YANG Jian-jun3
, HAN Hui1,3
2. Agricultural Technology Promotion Center in Qingyuan District, Baoding City, Baoding 071100, China;
3. Institute of Environment and Sustainable Development in Agriculture, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China
由于矿区的过度开采和人类工农业的发展使得农田出现了重金属超标的问题[1~3]. 不同于有机污染物, Cd和Pb等重金属元素在土壤中并不会被降解, 随着时间的增加而累积在土壤中, 并通过农作物的根系进入到作物可食用部位, 严重影响食品安全[4, 5]. 近年来, “镉麦”事件的不断曝光, 引起了全社会对小麦重金属超标问题的广泛担忧[6, 7]. 然而, 对于绝大部分中轻度重金属污染农田而言, 农业生产仍然是其承担的主要功能, 因此既要抑制重金属从土壤向食物链转移, 又要不影响小麦种植和农民的经济收入是该类型土壤治理有别于其他重度污染土壤及场地污染治理的最主要特征. 磷在农业中占据着重要地位, 参与植物的生命代谢过程, 能够促进植物生长发育[8, 9]. 土壤中的有效磷在抑制作物吸收重金属过程中发挥重要的作用. Ma等[10]通过13个小麦品种复合不同磷梯度试验发现, 土壤中磷的供应对小麦籽粒Cd的贡献比小麦品种选择更为重要, 高磷土壤抑制了小麦籽粒对Cd的积累. 在农业生产种植过程中, 通过施用磷肥来弥补土壤的缺磷状态, 以保证作物生长. 然而, 大量施用磷肥, 导致农田中土壤磷素富余, 经过灌溉和降雨, 这些磷素会渗到土壤下层而被浪费, 还会造成水体富营养化等环境生态问题[11]. 有研究表明土壤本身含有丰富的磷素, 然而土壤特定的理化性质, 使磷肥的当季利用率一般只有10%~25%[12]. 因此, 寻求活化土壤中稳定态磷的途径和方法, 对农业生产的可持续发展和重金属超标麦田修复有着重要的意义.
解磷细菌作为生物修复的特定微生物, 能够依靠自身的代谢产物或与其他生物的协同作用, 将土壤中难溶性磷转化为可供植物吸收利用的磷, 具有多重植物促生能力[13, 14]. 此外, 解磷细菌还可通过释放磷酸根与重金属形成沉淀, 或通过生物吸附、分泌代谢产物与重金属发生络合螯合、改变重金属形态等作用对重金属进行固定, 进而降低作物对重金属的吸收[15]. Yang等[16]研究表明解磷细菌Klebsiella aerogenes Wn产生的乙酸与释放的磷酸盐呈显著正相关, 能够诱导Pb5（PO4）3Cl、Ca7.7Cd0.8（PO4）8（H2O）2.4和CdS等沉淀. 解磷细菌作为优良的重金属固定钝化剂, 克服了传统的无机和有机钝化剂大量使用会造成土壤板结和水体富营养化等的缺点, 不仅能够固定土壤中的重金属, 还具有促进作物生长, 提高作物品质, 改善土壤质量, 环境友好, 有益于可持续发展等优点[17, 18]. 有研究从Cd和Pb污染根际土壤中筛选到1株解磷细菌Klebsiella sp. M2, 发现其能够分泌植酸和有机酸（草酸、抗坏血酸、柠檬酸和琥珀酸）, 溶解Ca3（PO4）2释放出PO43-, 诱导Cd和Pb生成PbO2、PbS、Cd（PO3）2和CdS等沉淀[19]. 虽然大量的研究已经研究了解磷细菌溶磷和固定重金属的机制[20, 21], 但是解磷细菌对作物, 尤其对小麦吸收重金属的影响的研究还较少. 外源接种解磷细菌对小麦根际功能细菌群落的影响也还不清楚. 因此本文通过溶液试验研究菌株M2吸附Cd和Pb效应, 通过盆栽试验, 研究菌株M2和灭活菌株M2对小麦吸收Cd和Pb的影响, 并利用高通量测序技术, 研究菌株M2对根际细菌群落结构的影响, 在细菌群落层面探究菌株M2阻控小麦吸收重金属的机制, 以期为解磷细菌修复重金属污染农田和保障小麦安全生产提供技术途径.
1 材料与方法 1.1 菌株M2和小麦解磷细菌Klebsiella sp. M2分离自受Cd和Pb污染的萝卜根际土壤中[19], 能够分泌草酸、抗坏血酸、柠檬酸和琥珀酸溶解Ca3（PO4）2, 释放出PO43-, 同时对Cd的致死浓度为500 mg·L-1, 对Pb的致死浓度为1800 mg·L-1. 所用小麦品种为郑麦129, 购自南阳市种子站.
1.2 菌株M2吸附固定Cd和Pb效应配制无机磷细菌培养基[蔗糖10 g, Ca3（PO4）2 10 g, NaCl 0.3 g, KCl 0.3 g, MgSO4·7H2O 0.3 g, FeSO4·7H2O 0.03 g, MnSO4·H2O 0.03 g, （NH4）2SO4 0.5 g, 酵母浸提液0.5 g, 蒸馏水1 L, pH 7.2, 121℃灭菌15 min], 分装到三角瓶中, 每瓶50 mL, 添加Cd和Pb母液, 使培养基中ρ（Cd）为10 mg·L-1, ρ（Pb）为20 mg·L-1. 本试验共有3个处理：不接菌对照组（CK）、接活菌M2处理组（M2-H）和接灭活菌M2处理组（M2-S）, 每个处理3个重复. 取活化后的菌株M2菌悬液按1%比例接种到三角瓶中, 30℃、180 r·min-1振荡培养7 d. 同时菌株M2菌悬液经121℃高压灭菌15 min, 间隔8 h后, 再次121℃高压灭菌15 min, 即为灭活菌株M2菌悬液. 在试验第0、1、3、5和7 d, 取5 mL培养液, 采用分光光度计测定培养液的D600值；5 000 r·min-1离心5 min, 然后取上清2 mL, 采用磷锑钼蓝分光光度法检测上清液中可溶性磷的含量, 利用电感耦合等离子体发射光谱仪（ICP-OES, Japan Shimadau-ICPE 9820）测定培养液中的Cd和Pb的浓度[22]. 收集培养第7 d的少量菌体沉淀, 经2.5%戊二醛固定后, 低温冷冻干燥, 采用场发射扫描电子显微镜（SEM：Japan-HitachiI-SU8010）对样品的形貌进行表征[23].
1.3 菌株M2不同组织吸附重金属能力测定收集1.2节中培养第7 d的菌体沉淀, 加入5 mL 10 mmol·L-1的EDTA-2Na溶液, 重悬并用恒温摇床（30℃, 180 r·min-1）振荡30 min后, 6 000 r·min-1离心10 min, 转移上清液用于测定活菌M2和灭活菌M2胞外吸附Cd和Pb含量. 然后菌体沉淀再加入5 mL 0.1%Triton X-100和5% HNO3的混合溶液, 重悬后于水浴锅95℃加热消解至溶液澄清, 使用ICP-OES测定上清液中Cd和Pb的浓度, 计算胞内积累Cd和Pb积累量.
1.4 小麦盆栽试验采集Cd（2.7 mg·kg-1）和Pb（89.4 mg·kg-1）超标农田土壤, 风干过100目筛, 然后把土装入盆钵中, 每盆10 kg. 取郑麦129种子若干, 用75%乙醇消毒3 min, 再用去离子水清洗3遍. 每盆播撒小麦种子30颗, 再用细土覆盖. 待小麦出苗后, 保留每盆20株. 本试验共设置3个处理：不接菌处理组（CK）、接活菌M2处理组（M2-H）和接灭活菌M2处理组（M2-S）, 每个处理4个重复. 分别配制活菌M2和灭活菌M2菌悬液（10 CFU·mL-1）, 用镊子在小麦根际周围划出小沟, 倒入菌悬液, 每盆20 mL, 同时对照组中接入20 mL无菌去离子水. 分别在小麦苗期和抽穗期各接菌一次. 按照常规管理方式管理小麦. 2021年10月25日种植, 2022年5月3日收获.
1.5 解磷细菌M2对小麦生长和重金属吸收的影响小麦收获时, 先从土壤中分离完整小麦植株, 随后小麦被分根、茎和籽粒, 各部烘干后, 称重, 粉碎, 用来测定小麦组织Cd和Pb的含量. 采集小麦根际土壤, 一份自然风干, 在2.0 g土壤样品中加入5 mL去离子水, 浸提2 h, 测定土壤pH[24]. 采用DTPA提取并测定根际土壤中的有效态Cd和Pb含量. 同时采用国家标准参比物质（土壤：GBW-07402, 植物：GBW-08501）进行质量控制, 回收率在96.5%~98.4%, 标样测定结果均在允许误差范围内.
1.6 解磷细菌M2对根际土壤无机磷形态分布的影响采用分级法逐步提取土壤中不同无机磷形态[25]：用0.25 mol·L-1 NaHCO3提取二钙磷（Ca2-P）；用0.5 mol·L-1 NH4AC提取八钙磷（Ca8-P）；用0.5 mol·L-1 NH4F和0.8 mol·L-1 H3BO3混合溶液提取铝结合态磷（Al-P）；然后通过加入0.1 mol·L-1 NaOH和0.1 mol·L-1 NaCO3复合试剂实现铁结合态磷（Fe-P）的提取；配制0.3 mol·L-1 Na3-Cit-Na2S2O4和0.5 mol·L-1 NaOH试剂, 并在浸提过程中加入1.0 g Na2O5S2以获得氧结合态磷（O-P）；最后是十钙磷（Ca10-P）的提取过程, 加入0.5 mol·L-1 H2SO4浸提后用分光光度法测定Ca10-P浓度.
1.7 解磷细菌M2对小麦根际土壤细菌群落结构的影响取各处理新鲜根际土壤, 按照制造商的说明用FastDNA®试剂盒提取每个土壤样品（0.5 g）的总土壤DNA. 用引物338F（5′-GGAC-3′）和806R（5′-GGAC GGAC-3′）扩增16S rRNA基因V3-V4区域设置PCR参数, 扩增产物通过2%琼脂糖凝胶进行质量验证, 并通过DNA凝胶提取试剂盒（Axygen Biosciences, Union City, USA）. 回收扩增产物, 产物送至上海美吉生物公司进行MiSeq PE300测序, 并在美吉云平台上进行在线分析与制图（https://login.majorbio.com）.
1.8 数据分析采用Excel 2010和SPSS 17.0软件进行数据统计分析.
2 结果与分析 2.1 菌株M2吸附Cd和Pb规律随着培养时间的增加, 对照组CK中溶液的D600值一直保持在0.012~0.015之间, M2-S中溶液的D600值一直保持在0.176~0.183之间, 而M2-H中溶液的D600值逐渐升高, 在第5 d达到1.874[图 1（a）], 表明活菌M2能够在Cd和Pb的胁迫下正常生长, 而死菌M2则不能生长. 随着培养时间的增加, CK组中ρ（Cd）一直保持在8.93~8.94 mg·L-1之间, M2-S中ρ（Cd）在第1 d显著下降到5.29 mg·L-1, 随后保持不变[图 1（b）], 表明灭活菌M2主要靠细胞壁表面吸附Cd. 而M2-H组Cd的浓度逐渐下降, 在第5 d下降了70.17%[图 1（b）], 表明活菌M2具有很强的吸附Cd的能力. 相似的, 随着培养时间的增加, CK组中ρ（Pb）一直保持在17.12~17.43 mg·L-1之间, M2-S中ρ（Pb）在第1 d显著下降到9.54 mg·L-1, 随后保持不变, 而M2-H组Pb的浓度逐渐下降, 在第5 d下降了73.09%[图 1（c）]. 随着培养时间的增加, CK组中ρ（PO43-）由3.65 mg·L-1升高到5.12 mg·L-1, 表明培养基中磷酸钙发生了一点溶解, 而M2-S组中ρ（PO43-）由3.12 mg·L-1升高到7.54 mg·L-1, M2-H组中ρ（PO43-）由3.43 mg·L-1升高到23.14 mg·L-1[图 1（d）], 表明活菌M2具有很强的溶解磷酸钙, 释放有效磷的能力.
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不同小写字母表示处理之间有显著差异（P < 0.05） 图 1 活菌M2和死菌M2对溶液中重金属含量的影响 Fig. 1 Effects of strain M2 on the content of heavy metals in the culture solution |
在ρ（Cd）为10 mg·L-1, ρ（Pb）为20 mg·L-1的溶液中分别培养活菌M2和灭活菌M2, 培养7 d后对活菌M2和灭活菌M2胞内和胞外吸附重金属的总量进行了测定, 结果如图 2所示. 活菌M2胞外吸附Cd的总量为299 μg, Pb的总量为677 μg；胞内富集Cd的总量为90 μg, Pb的总量为94 μg, 而灭活菌M2胞外吸附Cd的总量为226 μg, Pb的总量为518 μg；胞内富集Cd的总量为15 μg, Pb的总量为22 μg[图 2（a）和2（b）]. 结果表明灭活菌M2主要靠细胞壁吸附去除Cd和Pb, 而活菌M2除了细胞壁吸附去除Cd和Pb之外, 胞内也能富集一定的量Cd和Pb. 此外, 胞外吸附的Cd和Pb的总量也显著大于灭活菌M2胞外吸附的Cd和Pb的总量, 表明活菌M2也可能诱导重金属的沉淀, 进而降低溶液中游离态重金属的含量. 扫描电镜显示活菌M2的沉淀颗粒比较多[图 2（c）], 而灭活菌M2菌体的沉淀颗粒较少[图 2（d）], 进一步证明了相比于灭活菌M2, 活菌M2具有诱导重金属沉淀的能力.
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（a）活菌M2和死菌M2胞内和胞外吸附Cd能力, （b）活菌M2和死菌M2胞内和胞外吸附Pb能力, （c）活菌M2吸附重金属扫描电镜图, （d）死菌M2吸附Cd扫描电镜图；不同小写字母表示处理之间有显著差异（P < 0.05） 图 2 菌株M2不同组织吸附重金属能力 Fig. 2 Ability of strain M2 to adsorb heavy metals in different tissues |
与不接菌对照（CK）相比, 接种灭活菌M2（M2-S）对小麦根、秸秆和籽粒的干重无显著影响. 而接种活菌M2（M2-H）则显著提高了（25.11%~50.01%）小麦根、秸秆和籽粒的干重[图 3（a）], 表明菌株M2具有促进小麦生长的能力. 与CK相比, M2-S对小麦根、秸秆和籽粒中Cd和Pb的含量无显著影响, 而M2-H则显著降低了（35.94%~70.02%）小麦根、秸秆和籽粒中Cd和Pb的含量[图 3（b）], 表明菌株M2具有阻控小麦吸收Cd和Pb的能力.
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图 3 不同处理对小麦各组织干重和重金属吸收的影响 Fig. 3 Effects of different treatments on dry weight and heavy metal absorption in various tissues of wheat |
与CK相比, M2-S对小麦根际土壤中DTPA-Cd和DTPA-Pb的含量无显著影响. 而M2-H则显著降低了小麦根际土壤中DTPA-Cd（34.48%）和DTPA-Pb（36.72%）的含量[图 4（a）], 表明菌株M2通过降低根际土壤中有效态重金属的含量, 进而阻控了小麦组织对重金属的吸收. 与CK相比, M2-S和M2-H均对小麦根际土壤pH值无显著影响[图 4（b）].
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（a）不同处理对小麦根际土壤有效态重金属的影响, （b）不同处理对小麦根际土壤pH值的影响；同种重金属下不同小写字母表示处理之间有显著差异（P < 0.05） 图 4 不同处理对小麦根际土壤有效态重金属和pH值的影响 Fig. 4 Effects of different treatments on available heavy metals and pH in wheat rhizosphere soil |
植物主要从土壤中吸收无机磷以供其生长. 土壤中的无机磷包括与钙结合的磷酸钙盐Ca2-P、Ca8-P和Ca10-P, 还有与铁、铝、氧等元素结合的形态, 如Al-P、Fe-P和O-P. Ca2-P具有土壤第一有效磷来源之称, 也能直接表征土壤有效磷含量的高低. 由表 1可知, 与CK组相比, 接种灭活菌M2对小麦根际土壤无机磷的形态分布无显著影响, 而接种活菌株M2后, 能够显著提高（123%~293%）土壤Ca2-P和Ca8-P的含量, 显著降低（16.96%~43.38%）土壤中O-P和Ca10-P的含量, 说明添加菌株能够促进非活性态Ca10-P和O-P向活性态Ca2-P和Ca8-P转化.
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表 1 菌株M2对小麦根际土壤中无机磷形态分布的影响1）/mg·kg-1 Table 1 Effect of strain M2 on the distribution of inorganic phosphorus forms in wheat rhizosphere soil/mg·kg-1 |
2.6 菌株M2对小麦根际土壤细菌群落多样性的影响
外源菌株的接种可能会影响土壤微生物群落的多样性和结构组成, 采用高通量测序技术研究接种灭活菌M2和活菌M2对小麦根际土壤细菌群落结构和多样性的影响. 首先对各个处理样品细菌α多样性指数进行了分析（表 2）. CK处理组样品的Shannon指数和Simpson指数分别为5.95和0.008 1. M2-S处理组样品的Shannon指数和Simpson指数与CK处理组无显著差异, M2-H处理组样品的Shannon指数显著大于CK处理组样品的Shannon指数, 而Simpson指数显著小于CK处理组样品的Simpson指数, 表明外源接种活菌M2显著提高了小麦根际细菌群落的多样性.
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表 2 不同处理小麦根际细菌群落α多样性指数1） Table 2 The α diversity index of bacterial community in wheat rhizosphere under different treatments |
2.7 菌株M2对小麦根际土壤细菌群落结构的影响
UPGMA聚类分析可以评价样本之间的相似度. 如图 5（a）所示CK处理的3个重复样品在一个大枝上, 而M2-S和M2-H处理的6个样品在另外一个大枝上, 说明M2-S和M2-H处理组的小麦根际土壤细菌结构比较相似. PCA分析可以展示样本间的物种丰度组成差异. CK、M2-S和M2-H这3个处理的样品直接并无交际, M2-S和M2-H距离比较近[图 5（b）], 进一步表明M2-S和M2-H处理组的小麦根际土壤细菌结构比较相似. 各处理小麦根际土壤细菌群落门分类水平组成结果如图[图 5（c）]所示. 最丰富的门依次是：Actinobacteria（放线菌门）、Proteobacteria（变形菌门）、Acidobacteriota（酸杆菌门）、Chloroflexi（绿弯菌门）、Firmicutes（厚壁菌门）、Gemmatimonadota（芽单胞菌门）和Patescibacteria（髌骨细菌门）等, 占总细菌群落90%以上. 与对照相比, 接种活菌M2显著提高了小麦根际土壤中Proteobacteria、Gemmatimonadota和Bacteroidota的相对丰度, 显著降低了Actinobacteriota的相对丰度. 在目水平上进行分析, 与对照相比, 接种解磷细菌M2显著降低Gaiellales、Burkholderiales、Frankiales和Micrococcales的相对丰富度, 显著提高了Acidobacteriales、Rhizobiales、Sphingomonadales、Bacillales和Enterobacterales的相对丰富度[图 5（d）].
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（a）UPGMA聚类；（b）PCA分析；（c）细菌群落在门水平上的相对丰度；（d）细菌群落在目水平上的热图, 通过色块颜色梯度来展示不同目的丰度变化情况, 数值越大, 丰度越高 图 5 菌株N3对小麦根际土壤细菌群落结构的影响 Fig. 5 Effects of strain N3 on the bacterial community structure of wheat rhizospheric soil |
与不接菌对照相比, 接种活菌M2显著提高了小麦根际土壤中Sphingomonas、Candidatus_Koribacter、Nocardioides、Bacillus、Gemmatimonas和Enterobacter的相对丰度, 显著降低了Arthrobacter和Acidothermus的相对丰度. Lefse多级物种差异判别分析表明在CK处理组中关键细菌种属主要有p_Desulfobacterota、o_Geobacterales、f_Intrasporangiaceae和g_Noviherbaspirillum等12个, 而在M2-H处理组中关键细菌种属主要有g_Ralstonia、c_Holophagae、o_Polyangiales、f_Birii41和o_Subgroup_7等9个（图 6）. 查阅文献[26~30]可知, Sphingomonas、Nocardioides、Bacillus、Gemmatimonas和Enterobacter具有重金属固定或者抗性的特性, 而Bacillus、Gemmatimonas和Enterobacter还具有解磷、促进植物生长的特性. 这表明菌株M2能够增加小麦根际土壤中具有重金属固定和解磷促生细菌的比例的菌株（主要为Sphingomonas、Nocardioides、Bacillus、Gemmatimonas和Enterobacter）, 而这些菌属在钝化重金属和阻控小麦吸收重金属的过程中发挥了重要作用.
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图 6 不同处理样品中关键种属的LEfSe分析 Fig. 6 LEfSe analysis based on OTUs between four treatments |
采用PICRUSt软件对接种活菌M2和灭活菌M2处理下小麦根际细菌功能进行预测分析, 选择第三级功能层生物代谢通路进行分析, 找到差异代谢通路（图 7）. 结果共筛选到17个与土壤环境相关相关的差异代谢通路：转运蛋白（transporters）、分泌系统（secretion system）、氧化磷酸化（oxidative phosphorylation）、D-谷氨酰胺与D-谷氨酸代谢（D-glutamine and D-glutamate metabolism）、TCA循环（TCA cycle）、复制、重组和修复蛋白（replication, recombination and repair proteins）、细菌分泌系统（bacterial secretion system）、DNA修复（DNA replication）、细胞色素P450代谢（metabolism of xenobiotics by cytochrome P450）、双组分系统（two-component system）、苯丙素生物合成（phenylpropanoid biosynthesis）、类黄酮生物合成（flavonoid biosynthesis）、ABC转运蛋白（ABC transporters）、DNA修复和重组蛋白（DNA repair and recombination proteins）、DNA复制蛋白（DNA replication proteins）、氮代谢（nitrogen metabolism）和硫代谢（sulfur metabolism）. 与不接菌对照和接灭活菌M2对照相比, 接种活菌M2显著提高了小麦根际土壤中与重金属抗性和抗氧化能力相关的苯丙素生物合成、类黄酮生物合成和D-谷氨酰胺与D-谷氨酸代谢的基因拷贝数, 以及与DNA复制和修复相关的DNA修复和重组蛋白、DNA修复和复制、重组和修复蛋白等代谢的基因拷贝数, 表明这些代谢途径在土壤Cd固定和提高小麦Cd抗性方面发挥着重要作用.
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图 7 不同样品细菌PICRUSt功能预测 Fig. 7 PICRUSt metabolic predictions of the bacterial communities from different samples |
农田土壤重金属污染综合防治技术是恢复和保护受污染农田生态功能的重要措施, 筛选“生态环保、价格低廉”且能削减或降低土壤重金属总量和活性, 同时保证农作物重金属含量不超标的修复措施是实现受污染农田“边生产边修复”的安全生产模式的重要保障[31, 32]. 有研究表明解磷细菌对重金属的钝化作用机制主要是其可将土壤难溶矿物磷或有机磷中的磷酸根释放, 与重金属结合形成磷酸盐沉淀, 同时通过生物吸附和积累等作用, 降低重金属在土壤中的移动性和生物可利用性, 对重金属起到固定或钝化的作用[33, 34]. 本研究发现解磷细菌M2具有很强的溶解磷酸钙、释放有效磷、降低溶液中Cd和Pb含量的能力（图 1）, 进一步研究表明菌株M2能够通过细胞壁的吸附和诱导沉淀等作用钝化吸附Cd和Pb（图 2）. 有研究表明解磷细菌能够通过自身细胞壁的吸附或者诱导磷酸盐沉淀等降低根际土壤中有效态重金属的含量, 进而阻控作物对重金属的吸收[12, 35]. Cheng等[36]报道接种解磷细菌Pseudomonas taiwanensis WRS8到小麦根际土后, 显著降低了根际土当中的水溶态Cd浓度, 从而显著降低了小麦籽粒中Cd的含量. 近年来研究成果表明解磷细菌通过菌体表面活性基团吸附、诱导植物系统抗性、分泌多胺、铁载体和脱落酸等物质, 竞争性抑制重金属元素的根系吸收, 从而抑制重金属元素向植物地上部分转运[37~40]. 本研究发现菌株M2显著降低了（35.94%~70.02%）小麦根、秸秆和籽粒中Cd和Pb的含量, 表明菌株M2具有阻控小麦吸收Cd和Pb的能力. P在土壤中含有多种形态结构, 包括有机P（磷酸单酯、磷酸二酯、磷酸三酯、膦酸酯）和无机P（Ca2-P、Ca8-P、Ca10-P、Fe-P、O-P、Al-P）. 其中植物主要吸收无机磷, 而Ca2-P和Ca8-P比较容易被植物吸收, O-P和Al-P不易被植物直接吸收, 需要转化成Ca2-P才能被植物利用[41]. 本研究表明接种菌株M2能够促进非活性态Ca10-P和O-P向活性态Ca2-P和Ca8-P转化, 进而促进了植物生长. 此外, 解磷细菌释放的PO43-, 还可与重金属结合形成磷酸盐矿化沉淀物, 降低土壤中重金属有效态组分, 同时也阻控了小麦对重金属的吸收.
3.2 解磷细菌Klebsiella sp.M2调控根际细菌群落结构阻控小麦吸收重金属效应功能菌株阻控作物吸收重金属的有效性不仅取决于菌株本身的能力, 还取决于菌株在土著微生物群落中的定殖能力及其对群落结构的影响[42]. CK处理组中Klebsiella的相对丰度为0.52%, M2-H处理组中Klebsiella的相对丰度为0.93%, 表明菌株M2能够在根际土壤中定殖. 在微生物修复过程中, 外源微生物的接种可能改变土壤微生物群落的多样性和结构, 导致适应特定环境的微生物往往具有类似的资源利用策略. 重金属固定细菌Bacillus sp. N3的接种显著提高了小麦根际土壤中β-Proteobacteria和Firmicutes的相对丰度[43]. 本文结果也表明外源接种活菌M2显著提高了小麦根际细菌群落的多样性, 显著提高了小麦根际土壤中Proteobacteria、Gemmatimonadetes和Bacteroidota的相对丰度, 显著降低了Actinobacteria的相对丰度. Proteobacteria是土壤中分布最广的一类细菌, 带有丰富的DNA修复和重金属抗性相关基因, 在重金属胁迫和植物促生过程有着重要作用. 沙棘在生物和非生物胁迫下, 根际土壤优势菌门也是Proteobacteria和Actinobacteria[44, 45]. Gemmatimonadota具有促进植物生长的特性, 且具高浓度重金属抗性[46]. 此外, 菌株M2能够增加小麦根际土壤中具有重金属固定和解磷促生细菌的比例的菌株（主要为Sphingomonas、Nocardioides、Bacillus、Gemmatimonas和Enterobacter）, 而这些微生物定殖在小麦根系附近, 能够影响作物生长和代谢, 进而阻止植物吸收和富集Cd和Pb.
总体来说, 解磷细菌M2阻控小麦富集Cd和Pb的机制可以总结为以下3点：①细菌细胞壁吸附和诱导磷酸盐矿化. 菌株M2细菌细胞壁上的O—H、C—H、C—O—P、C—O基团参与了Cd和Pb的吸附, 从而降低了溶液和土壤中有效Cd和Pb的含量；此外, 菌株M2诱导成矿反应, 形成Pb2（PO4）2、Cd（PO3）2、Fe2Pb3（PO4）2和Cd3（PO4）2等矿物质. ②溶磷细菌通过调节无机磷形态分布以降低镉和铅的含量. 菌株M2和M8促进了稳定的无机磷从Ca10-P和O-P转化为活性Ca2-P和Fe-P, 并释放了更多PO43-, 降低根系土壤有效态重金属的含量和促进小麦生长. ③微生物群落的协同作用. 菌株M2和M8提高小麦根际土壤中具有重金属固定和解磷促生特性的细菌的相对丰度.
4 结论（1）解磷细菌Klebsiella sp. M2通过细胞壁吸附和诱导磷酸盐沉淀等作用降低溶液中Cd和Pb的浓度, 同时提高溶液中PO43-的浓度.
（2）解磷细菌Klebsiella sp. M2促进了土壤中难溶性无机磷Ca10-P和O-P向Ca2-P和Ca8-P转变, 提高了有效磷的含量, 进而降低了土壤中有效态Cd和Pb的含量, 阻控了小麦对Cd和Pb的吸收.
（3）解磷细菌Klebsiella sp. M2显著提高了小麦根际土壤中Proteobacteria、Gemmatimonadota和Bacteroidota的相对丰度, 同时增加了小麦根际土壤中具有重金属固定和解磷促生细菌的比例的菌株, 进而协同阻止小麦吸收和富集Cd和Pb.
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余志, 陈凤, 张军方, 等. 锌冶炼区菜地土壤和蔬菜重金属污染状况及风险评价[J]. 中国环境科学, 2019, 39(5): 2086-2094. Yu Z, Chen F, Zhang J F, et al. Contamination and risk of heavy metals in soils and vegetables from zinc smelting area[J]. China Environmental Science, 2019, 39(5): 2086-2094. |
| [2] | León-Cañedo J A, Alarcón-Silvas S G, Fierro-Sañudo J F, et al. Mercury and other trace metals in lettuce (Lactuca sativa) grown with two low-salinity shrimp effluents: accumulation and human health risk assessment[J]. Science of the Total Environment, 2019, 650: 2535-2544. DOI:10.1016/j.scitotenv.2018.10.003 |
| [3] |
石航源, 王鹏, 郑家桐, 等. 中国省域土壤重金属空间分布特征及分区管控对策[J]. 环境科学, 2023, 44(8): 4706-4716. Shi H Y, Wang P, Zheng J T, et al. Spatial distribution of soil heavy metals and regional control strategies in China at province level[J]. Environmental Science, 2023, 44(8): 4706-4716. |
| [4] |
曾希柏, 徐建明, 黄巧云, 等. 中国农田重金属问题的若干思考[J]. 土壤学报, 2013, 50(1): 186-194. Zeng X B, Xu J M, Huang Q Y, et al. Some deliberations on the issues of heavy metals in farmlands of China[J]. Acta Pedologica Sinica, 2013, 50(1): 186-194. |
| [5] |
韩辉, 王晓宇, 蔡红, 等. 重金属固定植物促生细菌的筛选及其阻控小麦富集重金属效应[J]. 环境科学, 2019, 40(7): 3339-3346. Han H, Wang X Y, Cai H, et al. Isolation of heavy metal immobilizing and plant growth-promoting bacteria and its effects on reducing heavy metal accumulation in wheat[J]. Environmental Science, 2019, 40(7): 3339-3346. |
| [6] | Li X F. Technical solutions for the safe utilization of heavy metal-contaminated farmland in China: a critical review[J]. Land Degradation & Development, 2019, 30(15): 1773-1784. |
| [7] |
管伟豆, 郭堤, 王萍, 等. 北方农田镉污染土壤玉米生产阈值及产区划分初探[J]. 环境科学, 2021, 42(12): 5958-5966. Guan W D, Guo D, Wang P, et al. Investigations on the derivation of safe maize-producing threshold of soil Cd content and on classification of Cd contaminated maize-producing areas in northern China[J]. Environmental Science, 2021, 42(12): 5958-5966. |
| [8] | Wang Y L, Lambers H. Root-released organic anions in response to low phosphorus availability: recent progress, challenges and future perspectives[J]. Plant and Soil, 2020, 447(1-2): 135-156. |
| [9] |
方兵, 陈林, 王阳, 等. 设施农业土壤磷素累积迁移转化及影响因素[J]. 环境科学, 2023, 44(1): 452-462. Fang B, Chen L, Wang Y, et al. Accumulation, migration, and transformation of soil phosphorus in facility agriculture and its influencing factors[J]. Environmental Science, 2023, 44(1): 452-462. |
| [10] | Ma S J, Nan Z R, Hu Y H, et al. Phosphorus supply level is more important than wheat variety in safe utilization of cadmium-contaminated calcareous soil[J]. Journal of Hazardous Materials, 2022, 424. DOI:10.1016/j.jhazmat.2021.127224 |
| [11] |
刘有华, 王思婷, 杨乔乔, 等. 国内外水体富营养化现状及聚磷菌研究进展[J]. 江苏农业科学, 2021, 49(9): 26-35. Liu Y H, Wang S T, Yang Q Q, et al. Current situation of eutrophication of water body at home and abroad and research progress of phosphate accumulating bacteria[J]. Jiangsu Agricultural Sciences, 2021, 49(9): 26-35. |
| [12] | Rawat P, Sharma A, Shankhdhar D, et al. Improvement of phosphorus uptake, phosphorus use efficiency, and grain yield of upland rice (Oryza sativa L.) in response to phosphate-solubilizing bacteria blended with phosphorus fertilizer[J]. Pedosphere, 2022, 32(5): 752-763. |
| [13] | Jeong S, Moon H S, Shin D, et al. Survival of introduced phosphate-solubilizing bacteria (PSB) and their impact on microbial community structure during the phytoextraction of Cd-contaminated soil[J]. Journal of Hazardous Materials, 2013, 263: 441-449. |
| [14] | Beheshti M, Alikhani H A, Pourbabaee A A, et al. Enriching periphyton with phosphate-solubilizing microorganisms improves the growth and concentration of phosphorus and micronutrients of rice plant in calcareous paddy soil[J]. Rhizosphere, 2022, 24. DOI:10.1016/j.rhisph.2022.100590 |
| [15] | Chen H M, Zhang J W, Tang L Y, et al. Enhanced Pb immobilization via the combination of biochar and phosphate solubilizing bacteria[J]. Environment International, 2019, 127: 395-401. |
| [16] | Yang Z H, Liu Z X, Zhao F P, et al. Organic acid, phosphate, sulfate and ammonium co-metabolism releasing insoluble phosphate by Klebsiella aerogenes to simultaneously stabilize lead and cadmium[J]. Journal of Hazardous Materials, 2023, 443. DOI:10.1016/j.jhazmat.2022.130378 |
| [17] | Wang X, Hu K, Xu Q, et al. Immobilization of Cd using mixed Enterobacter and Comamonas bacterial reagents in pot experiments with Brassica rapa L.[J]. Environmental Science & Technology, 2020, 54(24): 15731-15741. |
| [18] | Wang X, Xu Q, Hu K, et al. A coculture of Enterobacter and Comamonas species reduces cadmium accumulation in rice[J]. Molecular Plant-Microbe Interactions, 2023, 36(2): 95-108. |
| [19] | Qin S M, Zhang H Y, He Y H, et al. Improving radish phosphorus utilization efficiency and inhibiting Cd and Pb uptake by using heavy metal-immobilizing and phosphate-solubilizing bacteria[J]. Science of the Total Environment, 2023, 868. DOI:10.1016/j.scitotenv.2023.161685 |
| [20] |
李敏, 滕泽栋, 朱静, 等. 解磷微生物修复土壤重金属污染研究进展[J]. 生态学报, 2018, 38(10): 3393-3402. Li M, Teng Z D, Zhu J, et al. Research advances in heavy metal contaminated soil remediation by phosphate solubilizing microorganisms[J]. Acta Ecologica Sinica, 2018, 38(10): 3393-3402. |
| [21] | Zeng G M, Wan J, Huang D L, et al. Precipitation, adsorption and rhizosphere effect: the mechanisms for phosphate-induced pb immobilization in soils-A review[J]. Journal of Hazardous Materials, 2017, 339: 354-367. |
| [22] | Feng Y, Yang J J, Liu W, et al. Hydroxyapatite as a passivator for safe wheat production and its impacts on soil microbial communities in a Cd-contaminated alkaline soil[J]. Journal of Hazardous Materials, 2021, 404. DOI:10.1016/j.jhazmat.2020.124005 |
| [23] | Govarthanan M, Park S H, Park Y J, et al. Lead biotransformation potential of allochthonous Bacillus sp. SKK11 with sesame oil cake extract in mine soil[J]. RSC Advances, 2015, 5(67): 54564-54570. |
| [24] | 鲍士旦. 土壤农化分析[M]. (第三版). 北京: 中国农业出版社, 2000. |
| [25] |
王箫璇, 张敏, 张鑫尧, 等. 不同磷肥对砂姜黑土和红壤磷库转化及冬小麦磷素吸收利用的影响[J]. 中国农业科学, 2023, 56(6): 1113-1126. Wang X X, Zhang M, Zhang X Y, et al. Effects of different varieties of phosphate fertilizer application on soil phosphorus transformation and phosphorus uptake and utilization of winter wheat[J]. Scientia Agricultura Sinica, 2023, 56(6): 1113-1126. |
| [26] | Carlos M H J, Stefani P V Y, Janette A M, et al. Assessing the effects of heavy metals in ACC deaminase and IAA production on plant growth-promoting bacteria[J]. Microbiological Research, 2016, 188-189: 53-61. |
| [27] | Khourchi S, Elhaissoufi W, Loum M, et al. Phosphate solubilizing bacteria can significantly contribute to enhance P availability from polyphosphates and their use efficiency in wheat[J]. Microbiological Research, 2022, 262. DOI:10.1016/j.micres.2022.127094 |
| [28] | Rasul M, Yasmin S, Zubair M, et al. Phosphate solubilizers as antagonists for bacterial leaf blight with improved rice growth in phosphorus deficit soil[J]. Biological Control, 2019, 136. DOI:10.1016/j.biocontrol.2019.05.016 |
| [29] |
于海洋, 周方园, 李凤, 等. 解磷微生物及其在土壤污染防治中的应用研究进展[J]. 环境科学与技术, 2020, 43(S1): 44-51. Yu H Y, Zhou F Y, Li F, et al. Research advances in phosphorus-solubilizing microorganisms and their applications in soil pollution control[J]. Environmental Science & Technology, 2020, 43(S1): 44-51. |
| [30] | Bai J, Yang X H, Du R Y, et al. Biosorption mechanisms involved in immobilization of soil Pb by Bacillus subtilis DBM in a multi-metal-contaminated soil[J]. Journal of Environmental Sciences, 2014, 26(10): 2056-2064. |
| [31] | Sachdeva S, Kumar R, Sahoo P K, et al. Recent advances in biochar amendments for immobilization of heavy metals in an agricultural ecosystem: a systematic review[J]. Environmental Pollution, 2023, 319. DOI:10.1016/j.envpol.2022.120937 |
| [32] |
王成尘, 田稳, 向萍, 等. 土壤-水稻/小麦重金属吸收机制与安全调控[J]. 中国环境科学, 2022, 42(2): 794-807. Wang C C, Tian W, Xiang P, et al. Mechanism of heavy metal uptake and transport in soil-rice/wheat system and regulation measures for safe production[J]. China Environmental Science, 2022, 42(2): 794-807. |
| [33] | Priya A K, Gnanasekaran L, Dutta K, et al. Biosorption of heavy metals by microorganisms: evaluation of different underlying mechanisms[J]. Chemosphere, 2022, 307. DOI:10.1016/j.chemosphere.2022.135957 |
| [34] |
陈颢明, 胡亦舒, 李真. 溶磷微生物改性生物炭吸附重金属的机理研究[J]. 中国环境科学, 2021, 41(2): 684-692. Chen H M, Hu Y S, Li Z. Adsorption mechanism of heavy metals by phosphate-solubilizing microorganism modified biochar[J]. China Environmental Science, 2021, 41(2): 684-692. |
| [35] | Marzban A, Ebrahimipour G, Karkhane M, et al. Metal resistant and phosphate solubilizing bacterium improves maize (Zea mays) growth and mitigates metal accumulation in plant[J]. Biocatalysis and Agricultural Biotechnology, 2016, 8: 13-17. |
| [36] | Cheng C, Wang Q, Wang Q X, et al. Wheat-associated Pseudomonas taiwanensis WRS8 reduces cadmium uptake by increasing root surface cadmium adsorption and decreasing cadmium uptake and transport related gene expression in wheat[J]. Environmental Pollution, 2021, 268. DOI:10.1016/j.envpol.2020.115850 |
| [37] |
王晓宇, 韩辉. 重金属固定细菌调控土壤铁氧化物阻控小麦Cd吸收效应[J]. 环境科学, 2020, 41(11): 5160-5167. Wang X Y, Han H. Effects of heavy metal-immobilizing bacteria on reducing wheat uptake Cd by regulation soil iron oxides[J]. Environmental Science, 2020, 41(11): 5160-5167. |
| [38] | Etesami H. Bacterial mediated alleviation of heavy metal stress and decreased accumulation of metals in plant tissues: mechanisms and future prospects[J]. Ecotoxicology and Environmental Safety, 2018, 147: 175-191. |
| [39] | Hou S Y, Zhang M, Hou Y Q, et al. Mechanistic insight into the removal of aqueous Cd using an immobilized ZIF-8 and microflora cooperative composite[J]. Chemosphere, 2022, 293. DOI:10.1016/j.chemosphere.2022.133582 |
| [40] | Wang Y L, Xing W Q, Liang X F, et al. Effects of exogenous additives on wheat Cd accumulation, soil Cd availability and physicochemical properties in Cd-contaminated agricultural soils: a meta-analysis[J]. Science of the Total Environment, 2022, 808. DOI:10.1016/j.scitotenv.2021.152090 |
| [41] | Teng Z D, Shao W, Zhang K Y, et al. Characterization of phosphate solubilizing bacteria isolated from heavy metal contaminated soils and their potential for lead immobilization[J]. Journal of Environmental Management, 2019, 231: 189-197. |
| [42] | Liu H W, Brettell L E, Qiu Z G, et al. Microbiome-mediated stress resistance in plants[J]. Trends in Plant Science, 2020, 25(8): 733-743. |
| [43] |
李晓哲, 覃善梅, 陈兆进, 等. 产多胺细菌调控根际细菌群落阻控小麦Cd吸收效应[J]. 环境科学, 2022, 43(2): 1031-1039. Li X Z, Qin S M, Chen Z J, et al. Polyamine-producing bacteria regulated the community structure of rhizosphere bacteria and reduced the absorption of Cd in wheat[J]. Environmental Science, 2022, 43(2): 1031-1039. |
| [44] |
翟柯尧, 刘娟, 董玥, 等. 沙棘通过自主选择塑造根瘤内生微生物组[J]. 微生物学通报, 2023, 50(9): 3881-3898. Zhai K Y, Liu J, Dong Y, et al. Hippophae rhamnoides shapes endophytic microbiome in root nodule by self-selection[J]. Microbiology China, 2023, 50(9): 3881-3898. |
| [45] | Ma X M, Zhou Z, Chen J, et al. Long-term nitrogen and phosphorus fertilization reveals that phosphorus limitation shapes the microbial community composition and functions in tropical montane forest soil[J]. Science of the Total Environment, 2023, 854. DOI:10.1016/j.scitotenv.2022.158709 |
| [46] | Tao Q, Zhao J W, Li J X, et al. Unique root exudate tartaric acid enhanced cadmium mobilization and uptake in Cd-hyperaccumulator Sedum alfredii [J]. Journal of Hazardous Materials, 2020, 383. DOI:10.1016/j.jhazmat.2019.121177 |