2024, Vol. 45
2. 山西农业大学资源环境学院, 晋中 030801;
3. 农业农村部产地环境污染防控重点实验室, 天津市农业环境与农产品安全重点实验室, 天津 300191
2. College of Resources and Environment, Shanxi Agricultural University, Jinzhong 030801, China;
3. Key Laboratory of Original Agro-Environmental Pollution Prevention and Control, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Tianjin Key Laboratory of Agro-Environment and Safe-Product, Tianjin 300191, China
辣椒（Capsicum annuum L.）是双子叶植物纲、茄科、辣椒属, 为一年或有限多年生草本植物, 在我国南北各地均有广泛种植[1, 2].贵州辣椒种植面积和产量均位居全国首位, 近年来随着辣椒设施栽培面积的不断扩大, 农药和化肥使用量的不断增加, 而有机肥却供应不足, 最终导致辣椒田土壤生产力降低、病虫害加剧、农药残留超标、辣椒质量和生产效益下降等问题, 辣椒连作障碍已成为制约贵州省辣椒产业稳定发展的瓶颈.
连作障碍是指在正常的栽培管理条件下, 同一作物或同科作物在同一块土壤上连续种植两茬或两茬以上后, 作物会出现不同程度发育不良、生长缓慢、病虫害频发以及作物产量和品质出现降低等现象[3].有研究表明土壤养分失调、理化性质恶化、自毒物质累积和土壤微生物菌群失调等是引起连作障碍的主要原因[4].如在党参的长期连作过程中, 根际土壤pH值下降, 盐分积累, 有机碳（SOC）、全磷（TN）、全磷（TP）和微生物生物量碳氮比（MBC/MBN）增加, 微生物熵（qMB）和土壤呼吸熵（qCO2）降低, 进而改变了土壤细菌和真菌群落结构特征, 破坏了土壤中微生物群落的稳定性, 从而引起连作障碍的发生[5].此外, 作物连作会抑制有益微生物生长繁殖, 促进植物病原菌的累积, 加重土传病害, 最终导致作物产量和品质下降[5].如光果甘草连作显著地降低有益菌节杆菌属（Arthrobacter）、假单胞菌属（Pseudomona）和Naganishia的相对丰度, 而增加了病原真菌镰刀菌属（Fusarium）和亡革菌属（Thanatephorus）的相对丰度[3].而甜菜多年连作后其根系退化, 腐烂褐变, 植株发黄枯萎甚至死亡[6].目前, 阻控连作障碍的措施主要包括：土壤养分调控、自毒物质消除、微生物调控和多样性种植[7].其中, 多样性种植是一种综合调控措施, 其本质是通过构建多样性种植模式, 改变土壤微生物群落结构, 发展强化土壤微生物组功能等手段来缓解或消除作物连作障碍因子[7].由此可见, 土壤微生物对连作障碍的防治及减缓有重要的意义.近年来, 随着高通量测序技术的发展, 土壤微生物与连作实践间的相互作用已成为研究热点[8].真菌是土壤生态系统的重要组成部分, 主要包含有益真菌和病原真菌, 有益真菌可促进作物对营养元素的摄取, 相较于细菌而言, 能更好地降解复杂化合物；病原菌可入侵植物的根、茎、叶等组织器官, 引起植物病害, 造成农作物减产或品质下降[9].有研究发现[10, 11], 连作是使土壤由高肥力的“细菌型”向低肥力的“真菌型”演变, 因此, 真菌对于连作障碍的减缓或消除至关重要.目前, 关于设施条件下大豆[12]和黄瓜[13]等作物连作土壤真菌群落组成及结构变化的研究已被陆续报道, 但由于土壤连作障碍形成的原因复杂多样, 且具有较高的物种特异性[7], 导致不同农作物土壤连作产生的微生物机制存在较大差异.辣椒连作造成土壤理化性质劣变, 微生物群落结构失衡, 明确辣椒连作年限-土壤环境因子-真菌群落结构三者之间的关系可以为缓解辣椒连作障碍提供一定的科学依据, 但目前关于辣椒长期连作条件下, 三者之间关系研究的报道较少.
综上, 本文以铜仁市江口县坝盘镇挂扣村蔬菜大棚种植基地辣椒连作土壤为研究对象, 采用MiSeq高通量测序方法, 分析其真菌群落结构的变化, 探究真菌群落结构特征及其内在联系, 探讨真菌群落结构与环境因子的互作关系, 从微生态系统变化的角度阐明辣椒连作障碍发生的原因, 揭示辣椒连作产生的微生物学机制, 以期为建立辣椒连作障碍绿色防控和保持土壤生态平衡提供科学理论依据.
1 材料与方法 1.1 实验地概况本实验地位于贵州省铜仁市江口县坝盘镇挂扣村蔬菜大棚种植基地（109°02′E, 27°46′N）, 该地区属亚热带季风湿润气候区, 气候特点是四季分明, 年均气温16.2℃, 年均日照时数1 257.3 h, 无霜期288 d, 年均降水量1 369.6 mm, 年均相对湿度81%, 受梵净山的影响, 小气候特点突出, 适合辣椒种植.辣椒种植为一年两季, 种植茬口分别为春提早和秋延后, 辣椒种植过程中每茬施用商品有机肥1 200 kg·hm-2（由贵州鸿洋生物有机肥有限公司提供, 其中有机质含量65%, 氮磷钾总养分含量12.7%）, 复合肥（N∶P2O5∶K2O = 15∶15∶15）900 kg·hm-2（由中化化肥有限公司提供）.在辣椒进入坐果期后, 每7 d喷施高磷型水溶肥（N∶P2O5∶K2O = 12∶45∶10）600 kg·hm-2, 其他田间管理措施均与当地生产管理遵循一致.研究区当季种植辣椒品种为“明椒系列”.
1.2 样品采集与处理于2022年8月中旬在辣椒结果盛期, 采集研究区连作1 a、3 a和5 a的辣椒土壤样品, 同时以种植区未定植辣椒的土壤为对照（CK）.
在每块样地中随机设置3个采样点, 相邻样点间距为20 m, 每个采样点设置2 m×2 m的样方, 每个样方内均采用五点取样法采集0~20 cm土层的土壤样品500 g左右（取样点距辣椒根系5~8 cm）, 4个处理共收集12个土壤样品.将土壤样品装入密封袋, 迅速带回实验室, 一部分保存于-80℃冰箱中用于土壤微生物的分析；一部分样品经自然风干后用于土壤理化指标的测定.
1.3 土壤基本理化指标土壤理化指标的测定参照鲍士旦[14]的测定方法.
1.4 土壤DNA提取、扩增、测序和生物信息学分析土壤微生物的高通量测序委托上海派森诺生物科技股份有限公司完成.称取0.5 g土壤, 利用试剂盒E.Z.N.ATM Mag-Bind（OMEGA M5635-02, 美国）提取DNA, 采用Quantifluor-ST fluorometer荧光分光光度计（E6090, 美国）和1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的浓度及质量.使用真菌通用引物（ITS5FGGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG；ITS2RGCTGCGTTCTTCATCGATGC）对真菌ITS1区域进行PCR扩增[15].基于ITS rRNA序列对PCR产物进行纯化、定量和均一化构建文库并在LabChip上进行质检, 质检合格的文库用Illumina MiSeq platform测序.使用DADA2[16]对原始测序序列进行引物去除、质量过滤、去噪、拼接和去嵌合体等步骤, 然后采用100%相似度聚类, 并且基于Unite数据库[17]进行真菌物种注释.
1.5 数据处理采用Excel 2013和SPSS 25.0对数据进行处理和分析, 采用单因素方差分析（ANOVA）和多重比较法（Duncan）进行差异显著性分析.
基于Bray-Curtis距离的非度量多维标度（NMDS）排序和相似性分析（ANOSIM）判别不同连作年限土壤真菌群落的差异性；用LEfSe分析从门到属5个分类水平的真菌显著差异类群（LDA得分 > 3.6, P < 0.05）；采用Spearman秩进行共发生网络分析, 以每个样本的土壤真菌ASVs作为样本源, 强相关性（Spearman's r > |0.8|）和极显著相关（P < 0.01）为依据探讨共发生模式[8], 共生网络分析的可视化使用Gephi 0.9.2进行绘图；采用典范对应分析（CCA）和关联网络分析土壤真菌群落与环境因子间的关系.数据的分析及绘图利用R（4.1.0）的vegan包、microeco包和psych包实现（特别说明除外）.
2 结果与分析 2.1 土壤理化性质分析由表 1可知, 随着连作年限的延长, 土壤pH和OM含量呈逐年下降趋势；TP和AP含量呈逐年上升趋势；AN和AK含量呈先降低后上升的趋势；TN和TK含量变化不明显.较CK处理, 连作土壤降低了土壤pH值, 提高了土壤OM和养分含量.
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表 1 土壤基本理化性质1） Table 1 Physical and chemical properties of experimental soil |
2.2 土壤真菌多样性分析
各样本的覆盖度指数均大于99%, 说明土样中基因序列被检出的概率很高, 取样基本合理, 能够真实有效地反映土壤样本的真菌群落.由表 2可知, 随着连作年限的延长, 土壤真菌群落丰富度（Chao1指数和Observed species指数）呈先降低后增加的趋势, 多样性（Shannon指数和Simpson指数）呈逐年降低的趋势.与CK处理相比, 连作会显著降低土壤真菌群落的多样性, 但对丰富度的影响不明显.
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表 2 土壤真菌群落多样性指数1） Table 2 Alpha diversity indexes of soil fungal community |
韦恩图能够直观反映土壤真菌群落ASVs组成的差异性及重叠关系.由图 1可以看出, CK、连作1 a、连作3 a和连作5 a土壤样品中的真菌ASVs数量在587~1 514个之间, 土壤ASVs数量从高到低依次为：连作5 a > CK > 连作1 a > 连作3 a, 有共同的真菌ASVs数量36个.连作1 a、连作3 a和连作5 a土壤样品中有共同的ASVs数量70个, 分别占ASVs总数的7.61%、13.63%和5.28%.连作1 a、连作3 a和连作5a各自特有的ASVs数量分别为718、408和1 158个, 占ASVs总数的68.32%、69.51%和76.49%.说明不同连作年限的土壤ASVs存在差异, 连作会促进特有真菌物种的生产, 且随着连作年限的延长, 这一比例呈逐年增高趋势.
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图 1 土壤真菌ASVs的韦恩图 Fig. 1 Venne diagram of ASVs number of soil fungi |
NMDS分析揭示了不同连作年限土壤真菌群落的变化（图 2）.模型的应力函数（stress）值为0.075 1（< 0.2）, 表明排序效果良好, 且同一连作年限的样方间表现出明显的聚集, 不同连作年限的样方间表现出明显的分散, 说明土壤真菌群落在不同连作年限下差异明显.此结果在相似性分析（ANOSIM）中得到进一步的验证, 分析结果显示不同连作年限间土壤真菌群落差异显著（R = 0.957, P = 0.001）, 进一步说明连作年限是决定真菌群落差异的重要因素.
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图 2 基于Bray-Curtis距离的连作土壤真菌群落非度量多维尺度分析（NMDS） Fig. 2 Non-metric multidimensional scaling (NMDS) of soil fungal communities in continuous cropping soil based on Bray-Curtis distance |
所采集土壤样本共检测到真菌10门、17纲、35目、55科和80属.根据注释结果, 分别选取门的分类单元和大多数序列可以注释最低分类单元（属）的结果进行统计分析.
2.3.1 门水平真菌群落结构特征由图 3可见, 土壤真菌优势门类为子囊菌门（Ascomycota）、被孢霉门（Mortierellomycota）和担子菌门（Basidiomycota）（平均相对丰度 > 1%）.其中, Mortierellomycota的相对丰度随着连作年限的延长而降低；Ascomycota的相对丰度呈先增加后降低的趋势；而Basidiomycota的相对丰度则呈先降低后增加的趋势（表 3）.较CK处理, 连作会显著增加土壤Mortierellomycota的相对丰度, 降低Basidiomycota的相对丰度, 但对Ascomycota相对丰度的影响不明显.
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图 3 不同连作年限土壤真菌门水平上群落结构特征 Fig. 3 Soil fungal community structure at the phylum level in different continuous cropping years |
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表 3 不同连作年限土壤真菌优势菌门的相对丰度1）/% Table 3 Relative abundance of dominant phyla of soil fungi in different continuous cropping years/% |
2.3.2 属水平真菌群落结构特征
由图 4可见, 土壤真菌优势菌属为被孢霉属（Mortierella）、Fusarium、顶孢霉属（Acremonium）、青霉属（Penicillium）、圆孢霉属（Staphylotrichum）、毛葡孢属（Botryotrichum）、曲霉属（Aspergillus）、小不整球壳属（Plectosphaerella）和瓶毛壳属（Lophotrichus）（平均相对丰度 > 1%）.其中, Mortierella和Penicillium的相对丰度随着连作年限的延长而降低；Fusarium的相对丰度随着连作年限的延长而增加；同时, Acremonium、Botryotrichum、Aspergillus和Lophotrichus的相对丰度呈先增加后降低的趋势；Plectosphaerella的相对丰度呈先降低后增加的趋势；而Staphylotrichum的相对丰度变化不明显（表 4）.较CK处理, 连作会增加土壤Mortierella、Fusarium、Penicillium、Botryotrichum和Lophotrichus的相对丰度, 降低Staphylotrichum和Plectosphaerella的相对丰度, 但对Acremonium和Aspergillus相对丰度的影响不明显.
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图 4 不同连作年限土壤真菌属水平上群落结构特征 Fig. 4 Soil fungal community structure at the genus level in different continuous cropping years |
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表 4 不同连作年限土壤真菌优势菌属的相对丰度1）/% Table 4 Relative abundance of dominant genera of soil fungi in different continuous cropping years/% |
2.3.3 土壤真菌群落差异性分析
LEfSe分析共鉴定出28个真菌生物标记物（LDA > 3.6, P < 0.05）, CK、连作1 a、3 a和5 a土壤中分别识别出8、6、10和4个生物标记物（图 5）.CK处理中的生物标记物主要包括1个纲、2个目、2个科和3个属, 即微球黑粉菌纲（Microbotryomycetes）；柔膜菌目（Thelebolales）、蜡壳耳目（Sebacinales）；假散囊菌科（Pseudeurotiaceae）、葡萄穗霉科（Stachybotryaceae）；g_Staphylotrichum_coccosporum、Penicillium和假散囊菌属（Pseudeurotium）.连作1 a土壤中的生物标记物主要包括1个门、1个纲、1个目、1个科和2个属, 即Mucoromycota；毛霉菌纲（Mucoromycetes）；毛霉目（Mucorales）；梨孢假壳科（Apiosporaceae）；放射毛霉属（Actinomucor）和木霉属（Trichoderma）.连作3 a土壤中的生物标记物主要包括1个目、1个科和8个属, 即粪壳菌目（Sordariales）；毛壳科（Chaetomiaceae）；Staphylotrichum、g_Acremonium_tubakii、Lophotrichus、毁丝霉属（Myceliophthora）、毛壳菌属（Chaetomium）、菌寄生菌属（Hypomyces）、交互枝顶孢（g_Acremonium_alternatum）和金孢子菌属（g_Chrysosporium_lobatum）.连作5 a土壤中的生物标记物主要包括1个科和3个属, 即赤壳科（Nectriaceae）；g_Fusarium、g_Cadophora和g_Cadophora_orchidicola.说明不同连作年限的生物标志物不同.
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图 5 土壤真菌的LEfSe分析 Fig. 5 LEfSe analysis of soil fungal communities |
为进一步了解连作土壤真菌群落的相似性, 利用ASVs数据构建不同连作年限土壤真菌网络图（图 6）, 并计算相关的拓扑性质（表 5）.较CK处理, 连作土壤真菌共生网络中的节点和边数均有不同程度的降低；真菌群落之间共存关系比例均有不同程度的降低, 互斥关系比例均有不同程度的升高；模块化指数均有不同程度的升高；同时, 连作土壤真菌共生网络的平均度也均有不同程度的降低, 一般认为, 平均度越低, 表明节点的连通度越低[8].以上结果说明, 辣椒连作影响了土壤真菌群落之间的联系, 降低了土壤真菌群落网络的复杂性.连作年限的变化对土壤真菌群落的网络关系也有一定的影响.整体而言, 连作1 a和连作3 a的土壤真菌共生网络的主要拓扑性质差别不大, 但连作5 a时, 土壤真菌共生网络中的平均度、节点和边数均有大幅度的下降；模块化指数则有大幅度的升高；共存关系比例有小幅度的降低, 互斥关系比例有小幅度的升高.以上结果说明, 连作5 a时, 土壤真菌群落网络变得简单而脆弱.
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图 6 土壤真菌共生网络 Fig. 6 Co-occurrence network of soil fungal communities |
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表 5 不同连作年限土壤真菌群落共生网络主要拓扑性质 Table 5 Major topological properties of soil fungal communities in different continuous cropping years |
2.5 土壤真菌群落结构及多样性与环境因子的关系
Pearson相关性分析结果表明（表 6）, Shannon指数和Simpson指数均与pH呈显著正相关性；Shannon指数与TP、AN和AP含量呈显著负相关性.
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表 6 土壤真菌群落多样性指数与环境因子的相关性1） Table 6 Pearson's rank correlation coefficients between soil fungal diversity index and environmental factors |
利用Canoco 4.5软件对真菌ASVs水平真菌群落丰度进行去趋势对应分析方法（DCA）分析.结果显示, 4个轴中的特征值最大为5.072（> 3.0）, 故选择单峰模型中CCA用于后续分析.由图 7可知, 第一排序轴和第二排序轴分别解释了土壤真菌群落变化的16.77%和12.82%, 其中, 第一排序轴主要与pH、OM、TN、TP、TK、AN、AP和AK的相关性较好；第二排序轴主要与pH和AN的相关性较好.采用envfit函数检验每个环境因子的显著性, 结果显示, pH（r2 = 0.840**）、AN（r2 = 0.890**）和AK（r2 = 0.818**）对土壤真菌群落结构组成的影响达极显著水平（P < 0.01）；OM（r2 = 0.612*）、TN（r2 = 0.534*）和AP（r2 = 0.603*）对其影响达显著水平（P < 0.05）.以上结果说明pH、OM、TN、AN、AP和AK是影响连作土壤真菌群落结构的主要环境因子.
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图 7 土壤真菌群落结构与环境因子间的CCA分析 Fig. 7 CCA analysis of soil fungal community structure and environmental factors |
利用关联网络进一步分析不同环境因子与连作土壤真菌优势菌属之间的关系, 结果发现（图 8）, Penicillium与TK, Acremonium与TN, Botryotrichum与AP, Plectosphaerella与pH, Fusarium与TN和AP, Mortierella和Lophotrichus与OM呈显著正相关（P < 0.05）；Fusarium与TP, Staphylotrichum与pH, Mortierella和Lophotrichus与TK, Penicillium、Botryotrichum和Lophotrichus与AN和AK呈极显著正相关（P < 0.01）；Staphylotrichum与TN和TP, Plectosphaerella与AP和AK, Acremonium、Botryotrichum、Fusarium和Lophotrichus与pH呈显著负相关（P < 0.05）；Staphylotrichum与AN、AP和AK呈极显著负相关（P < 0.01）.对相关性网络分析结果进行关系对去重和数据筛选后发现, pH是Staphylotrichum、Plectosphaerella、Fusarium、Acremonium、Botryotrichum和Lophotrichus群落结构的主要驱动因子；OM是Mortierella和Lophotrichus群落结构的主要驱动因子；TN是Fusarium、Acremonium和Staphylotrichum群落结构的主要驱动因子；TP是Fusarium和Staphylotrichum群落结构的主要驱动因子；TK是Mortierella、Lophotrichus和Penicillium群落结构的主要驱动因子；AN和AK是Penicillium、Botryotrichum、Lophotrichus和Staphylotrichum群落结构的主要驱动因子；AP是Fusarium、Botryotrichum、Staphylotrichum和Plectosphaerella群落结构的主要驱动因子.
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图 8 土壤真菌优势菌属群落结构与环境因子间的相关性网络分析 Fig. 8 Correlation network analysis of soil fungal advantage genera community structure at genus level and environmental factors |
有研究发现, 长期连作会造成土壤pH下降, 引起土壤酸化[18, 19].本研究结果进一步验证了此结论.然而, 李莹等[8]的研究结果却表明, 辣椒连作会使土壤pH升高, 与本研究结果相反, 这可能与保护地栽培和微气候发生变化有关, 本研究大棚内温度较高, 引起地下水分上移, 随之带来盐分滞留土表, 导致土壤pH上升.本研究结果表明, 随着辣椒连作年限的延长, 土壤OM含量呈逐年下降趋势；TP和AP含量呈逐年上升趋势；AN和AK含量呈先降低后上升的趋势；TN和TK含量变化不明显.谭仲廷等[20]研究了百香果不同连作年限（0、1、2和3 a）土壤理化性质的变化, 发现随着连作年限延长, 土壤TP和AK含量呈逐年递增的趋势, AP、AN和TN含量呈先上升后下降的趋势, OM含量呈先上升后下降趋势.Liu等[12]研究了大豆连作年限（3、5和13 a）对土壤理化指标的影响, 发现连作3a的土壤AP含量最高, 连作13a的土壤TP、TN、AN和AK含量最高.Li等[19]等研究了温室黄瓜不同连作年限（1、3、5和7 a）土壤理化指标的变化, 发现随着连作年限的延长, 土壤OM、AP、AK含量呈先上升后下降再上升的趋势, AN呈先上升再下降的趋势.以上研究结果与本研究结果存在差异, 其原因可能是不同作物对养分的需求不同, 在连作过程中, 作物对养分的选择性吸收, 会造成土壤中某些养分亏缺, 而其他养分则大量累积, 最终导致土壤养分失衡[4]；此外, 不同类型作物、施肥种类和施用量以及所处土壤类型理化性质的差异, 加上连续过量化肥的施用, 会逐渐打破土壤养分平衡, 造成土壤理化性质恶化, 加剧作物根系化感自毒作用, 进而导致作物根系产生的有毒有害物质积累, 改变土壤微生物区系[21], 且这种作用往往有助于病原菌的繁殖, 协同土传病害的发生, 最终导致作物生长不良, 乃至发病死亡, 这可能是造成连作障碍的主要原因.但也有研究认为土壤理化性质的改变不是导致连作障碍的主要因子[22], 连作也可能改善土壤根际微环境, 提高土壤养分状况[23].因此, 不同作物连作对土壤理化性质的影响存在差异.
3.2 辣椒连作对土壤真菌群落结构和多样性的影响 3.2.1 辣椒连作对土壤真菌多样性的影响微生物在农田生态系统中发挥着重要的作用, 其群落多样性决定着农业用地的可持续性[24].本研究结果表明, 土壤真菌多样性指数随着连作年限的延长呈逐年降低的趋势.张敏等[3]研究了甘草根际土壤微生物群落结构对长期连作的响应, 结果发现随着光果甘草种植年限的增加, 其根际土壤真菌多样性降低.Wang等[25]研究了设施栽培西瓜枯萎病与健康土壤微生物群落组成和功能的差异, 结果发现西瓜连作20 a会明显改变土壤微生物群落结构, 降低土壤真菌多样性.Ali等[13]研究了棚室黄瓜长期连作对土壤微生物群落结构和生态功能的影响, 结果发现黄瓜连作7 a, 土壤真菌群落多样性明显降低.以上研究结果与本研究结果相似.但也有部分研究结果与本研究结果存在一定差异, 如Liu等[26]研究了西洋参连作障碍微生态机制, 结果发现西洋参连作会增加土壤真菌群落多样性；Liu等[12]研究了大豆长期连作对黑土真菌群落结构的影响, 结果发现大豆长期连作使土壤真菌群落多样性明显增加；Gao等[27]研究了甘薯连作对根际土壤真菌群落结构的影响, 结果表明甘薯连作使土壤真菌群落多样性增加.综合以上研究内容, 分析其原因可能是：在连作系统中, 相同的田间管理模式、植物化感物质的长期累积以及同类型根系分泌物长期释放的生态效应, 导致土壤中的微生物区系发生改变, 微生物群落结构失衡, 土壤中部分功能丧失, 进而改变土壤微生物多样性[8].
3.2.2 辣椒连作对土壤真菌群落结构的影响共生网络分析结果表明, 连作5 a土壤真菌共生网络变得简单而脆弱.这可能是长期连作导致土壤微生态失衡, 有益真菌减少和病原真菌增加等[9]. 如甘草连作降低了有益真菌Naganishin的相对丰度, 增加了Fusarium和亡革菌属（Thanatephorus）等植物病原菌的相对丰度[3]；大豆连作增加了链格孢属（Alternaria）、Boeremia、Lectera longa和尖镰孢菌（F. oxysporum）等植物病原菌的相对丰度[12]；茶连作增加了茄镰刀菌（F. solanispecies）、Microidium phvllanthi和F. oxysporum等植物病原菌的相对丰度[28]. 综合以上研究结果发现, Fusarium相对丰度的增加是连作土壤的一个重要特征, 其不仅会使植物萎蔫, 而且会引发根腐、茎腐、花腐和粒腐等多种病害, 导致作物严重减产, 从而造成重大的经济损失[29]. 本研究中, 辣椒连作明显改变了土壤真菌群落结构的组成, 且随着辣椒连作年限的延长, Fusarium的相对丰度逐渐增加, 说明了辣椒连作也会促进植物病原菌的生长繁殖. 这与以上研究结果相似. 本研究还发现, 土壤中的有益微生物Mortierella和Penicillium的相对丰度随着连作年限的延长而逐渐降低, 表明辣椒连作会抑制土壤有益真菌的生长繁殖, 这与张英英等[30]的研究结果相似. Mortierella属于腐生真菌, 是土壤碳和养分转化的关键微生物成员, 此外, 它还能够降解纤维素、半纤维素和木质素, 对改变土壤微生物的生境有一定影响[9]. Penicillium则是自然界中生物有机成分的重要分解者, 能产生多种有活性的次生代谢产物, 以抵抗真菌、细菌等[31]. 值得注意的是, Mortierella和拜赖青霉（P. bilaiae）能抑制植物枯萎病F. oxysporum的生长和繁殖[32, 33]；Mortierella能抑制F. solanum的生长和繁殖[34]；微黄青霉（P. minioluteum）能抑制禾谷镰刀菌（F. graminearum）的生长和繁殖[35]. 而在本研究中, 辣椒连作5 a土壤中的Fusarium的相对丰度分别较连作1 a和3 a提高79.07 %和69.60%；Mortierella的相对丰度分别较连作1 a和3 a降低56.13%和14.32%；Penicillium的相对丰度分别较连作1 a和3 a降低97.19% 和96.16%. 因此可推测, Fusarium相对丰度的增加可能与拮抗菌株Mortierella和Penicillium相对丰度的降低有关. 本研究结果还发现, Acremonium、Botryotrichum、Aspergillus、Lophotrichus和Plectosphaerella的相对丰度均在连作3 a时出现转折, 说明辣椒在连作3 a时开始出现土传病害, 而土传病害导致土壤酸化, 有机质减少, 养分失调等, 最终导致土壤真菌群落组成和结构发生改变. 综上, 笔者推测土壤真菌群落相对丰度的变化, 尤其是Fusarium相对丰度的增加, Mortierella和Penicillium相对丰度的降低是辣椒连作障碍发生的主要原因之一.
3.3 土壤真菌群落的环境驱动因素本研究结果发现, 土壤pH、OM、TN、AN、AP和AK是辣椒连作土壤真菌群落结构组成的驱动因子, 这与黄瓜[18]、甘蔗[36]和西瓜[37]连作土壤真菌群落结构的主要驱动因子相似.土壤pH是影响土壤微生物生存与繁育的重要因素, 它能够通过影响土壤基质的组成、化学性质和养分利用效率而使土壤微生物群落组成受到干扰[38].土壤OM作为农田肥力的基础和核心, 连作会导致土壤OM含量下降, 土壤质量变得发黏, 透气性严重破坏, 进而影响土壤微生物群落组成.本研究中, 土壤pH与Staphylotrichum呈极显著正相关, 与Acremonium、Botryotrichum、Fusarium和Lophotrichus呈显著负相关, 说明土壤pH的降低会促进Staphylotrichum的生长繁殖, 抑制Acremonium、Botryotrichum、Fusarium和Lophotrichus的生长繁殖.土壤OM与Mortierella和Lophotrichus呈显著正相关, 说明土壤OM的降低会抑制Mortierella和Lophotrichus的生长繁殖.N、P和K作为土壤微生物生长繁殖所需的重要营养物质, 其含量的变化将直接导致土壤微生物群落结构的变化[39], 同时, 由于P是微生物细胞结构的重要组成元素, 土壤微生物也会因为对P养分的依赖而使其群落结构产生变化[40].本研究中, Acremonium与TN, Botryotrichum与AP, Fusarium与TN、TP和AP, Mortierella、Lophotrichus和Penicillium与TK, Penicillium、Botryotrichum和Lophotrichus与AN和AK呈显著正相关；Plectosphaerella与AP和AK, Staphylotrichum与TN、TP、AN、AP和AK呈显著负相关.说明土壤TN含量的增高能促进Acremonium和Fusarium的生长繁殖；TP含量的增高能促进Fusarium的生长繁殖；AN和AK含量的增高能促进Penicillium、Botryotrichum和Lophotrichus的生长繁殖；AP和AK含量的增高会抑制Plectosphaerella的生长繁殖, 且以上指标均对Staphylotrichum的生长繁殖有抑制作用.此外, TK含量的增高能促进Mortierella、Lophotrichus和Penicillium的生长繁殖.综上可知, 影响土壤真菌群落分布的主控因素与土壤环境特性紧密相关, 任何环境因子的变化都可能在一定程度上改变土壤真菌群落结构[8].此外, 本研究在实验设计过程中考虑到辣椒不同生育时期土壤微生物活性的差异, 选择了在辣椒结果盛期进行采样, 一定程度上可以代表土壤微生物的高活性及功能发挥最大化.但由于调控真菌群落组成结构的因素复杂多样, 而本研究的环境因子较少, 所以研究结果仅能解释辣椒连作障碍产生的部分原因, 为了更加准确地揭示辣椒连作障碍产生机制, 在以后的研究中应尽可能对研究内容进行进一步的细化.如可以在本研究的基础上继续探讨土壤其它理化指标（酶活性、微生物活性等）、农药残留、施肥种类及施用量等因素与辣椒不同生育时期土壤（或根际土壤）微生物（细菌和真菌）的互作关系, 进而为缓解或消除辣椒连作障碍提供更为详实的参考依据.
4 结论（1）随着连作年限的延长, 土壤pH和OM含量呈逐年下降趋势；TP和AP含量呈逐年上升趋势；AN和AK含量呈先降低后上升的趋势；TN和TK含量变化不明显.
（2）连作年限的变化对土壤真菌优势菌群的相对丰度有显著影响（P < 0.05）.在门水平上, 随着连作年限的延长, Mortierellomycota的相对丰度逐年降低；Ascomycota呈先增加后降低的趋势；Basidiomycota则呈先降低后增加的趋势.在属水平上, 随着连作年限的延长, Fusarium的相对丰度呈逐年递增趋势；Mortierella和Penicillium则呈逐年递减趋势；Acremonium、Botryotrichum、Aspergillus、Lophotrichus和Plectosphaerella均在连作3 a时出现转折.
（3）pH、OM、TN、AN、AP和AK是连作土壤真菌群落结构组成的主要环境因子, 影响土壤Fusarium、Lophotrichus、Penicillium、Mortierella、Botryotrichum、Staphylotrichum、Plectosphaerella和Acremonium的分布.
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