2024, Vol. 45
, WANG Yi-min , JIN Wen-hao , WANG Yong-ran , WANG Jia-he , CHAI Yi-bo , PENG Li-yuan
, QIN Hua
随着经济和社会的高速发展, 人民生活水平显著改善, 生活垃圾量急剧增加, 厨余垃圾作为生活垃圾的重要组成部分, 面临着如何实现资源化、减量化和无害化处理的问题.肥料化是厨余垃圾无害资源化利用的重要手段和主要出路[1].厨余垃圾包括水产品、蔬菜瓜果垃圾、腐肉、剩饭剩菜、废弃食物、肉碎骨以及畜禽内脏等易腐性垃圾, 它们富含糖类、脂肪和蛋白质等有机物及丰富的微量元素, 经厌氧发酵、好氧堆肥或生物转化等工艺处理后转化成稳定的腐殖酸和可利用的营养物质, 是具良好品质和高活性的生物有机肥、理想的贫瘠土壤调理剂, 有较高的应用价值[2]. 然而, 不同原料及处置工艺产生的肥料产物腐熟度、含盐量、油脂含量和养分含量差异极大, 导致其使用途径受限.若将高盐高油脂的厨余垃圾肥料制品施用到土壤中, 极易破坏土壤结构和土壤生态环境, 影响农业的绿色可持续生产.目前国内外研究更多关注厨余垃圾减量化工艺和设备的开发, 而较少关注肥料化制品的质量及其安全性, 资源化利用存在较大的环境及生态风险.
健康的土壤能发挥多种作用、提供各种基本功能, 为人们创造社会、经济和生态效益, 例如提供宜居环境、保障粮食安全和维持生态平衡等.土壤微生物有助于调节土壤健康过程, 包括土壤有机质的稳定、土壤团聚体的形成和植物病原体的抑制[3], 其群落结构和生态功能的变化可用于评估土壤肥力水平高低和生态系统的稳定性, 并被认为比土壤物理和化学性质在反映土壤质量变化上更有效和更快速[4].尤其是随着高通量测序技术的飞速发展和快速普及, 国内外研究者已采用该方法深入研究不同施肥措施对土壤微生物群落组成和分布特征的影响, 评估土壤健康程度.乔宇颖等[5]采用该技术分析发现用沼液可以替代化肥平衡土壤养分和维持土壤生态功能, 但仍可能存在真菌致病风险；马垒等[6]结合高通量测序和分子生态网络分析技术探究连续施用化肥及秸秆还田对细菌群落结构和种间互作关系的影响, 发现秸秆还田配施化肥有利于提升黄淮海潮土区土壤肥力, 并可通过调节细菌种间互作关系, 优化细菌群落组成, 提高土壤酶活性.关于厨余垃圾肥料产品, 目前多集中于研究其对土壤肥力和作物产量的影响, 关于其对土壤微生物影响的研究鲜有报道[1, 7].因此, 为进一步探究厨余垃圾来源的有机肥的安全性, 需要明晰其对土壤微生物群落组成、结构稳定和功能的影响.
本研究拟通过室内土壤培养试验, 添加不同量厨余垃圾有机肥（organic fertilizer of kitchen waste, OFK）, 从生态安全角度研究该产品对土壤理化环境、酶活性和微生物组成、群落结构及功能等方面的影响, 以期为该产品资源化利用和大面积安全推广提供理论依据.
1 材料与方法 1.1 供试材料供试土壤：采集于杭州市余杭区窑瓶镇南山村（30°22′N, 119°56′E）, 土壤类型为水稻土.采集0 ~ 20 cm耕层土壤, 拣去杂物, 风干, 备用.具体理化性状如下：pH 5.46, ω（有机质）27.46 g·kg-1, ω（碱解氮）263.5 mg·kg-1, ω（有效磷）102.3 mg·kg-1, ω（速效钾）164.2 mg·kg-1.
供试肥料：厨余垃圾有机肥（OFK）由建德厨农有限公司生产, 具体生产流程如下：首先将厨余垃圾进行三相分离, 收集固体用于黑水虻养殖, 再取经虫体取食与消化后的生物质进行好氧堆肥, 收获的堆肥产物与木屑依照比例（7∶3, 质量比）混合, 最终获得厨余垃圾有机肥, 其理化特性如表 1.
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表 1 厨余垃圾有机肥理化特性1） Table 1 Physical and chemical characteristics of organic fertilizer of kitchen waste (OFK) |
1.2 试验设计
在土壤中添加不同量OFK, 配置成含0（对照, CK）、1%、3%和5% OFK等4个处理, 进行室内恒温培养.称取供试土壤（过2 mm筛）于密封罐, 分别加入OFK 3.0 g、9.0 g和15.0 g, 混合均匀, 土壤和OFK总重量为300 g, 对照（CK）不添加OFK, 随后密封, 置于培养箱[（25±1）℃]暗培养30 d, 期间每2 d通气并补充水分, 以保证土壤含水量保持为田间最大持水量的（60±2）%.每个处理重复15次.
1.3 测定指标及方法每个处理分别在培养至第2、5、10、20和30 d时随机取3瓶, 收集密封罐中的土壤样品, 去除肉眼可见的OFK后过2 mm筛再次匀质化.一份于4℃冰柜保存, 用于测定土壤微生物量和酶活性, 一份室温风干, 过筛后测定土壤pH、硝态氮、铵态氮、有效磷、速效钾和有机碳含量；另取第30 d的土壤样品于-80℃冰柜保存, 用于测定微生物群落.
1.3.1 土壤基本理化性质土壤pH值采用微电极法测定（土水比1∶2.5, 质量比）；土壤硝态氮和铵态氮含量采用50 mL 0.5 mol·L-1 KCl提取, Skalar SAN++测定[8]；有效磷采用盐酸-氟化铵溶液浸提, 钼锑抗比色法测定；速效钾用醋酸铵浸提, 火焰光度计法测定；有机质含量采用重铬酸钾-浓硫酸氧化-硫酸亚铁滴定法测定[9].
1.3.2 土壤酶活性和微生物量碳取不同培养时期的新鲜土样测定微生物量碳和酶活.微生物量碳采用氯仿熏蒸-0.5 mol·L-1 K2SO4提取, K2Cr2O7氧化法测碳[10]；α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、β-纤维二糖甘酶、β-木聚糖苷酶、N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶、亮氨酸氨基肽酶和酸性磷酸酶的酶活性测定参照荧光微孔板检测技术[11], 7种酶活性单位均用nmol·（g·h）-1表示.
1.3.3 土壤总DNA提取取培养了30 d的土壤鲜样用于土壤总DNA提取.采用PowerSoilTM Total DNA Isolation Kit（Qiagen, Hilden, Germany）试剂盒提取土壤样品的总DNA.根据试剂盒说明书, 称取0.25 g鲜土提取样品的总DNA, 提取出的DNA样本通过核酸定量仪NanoDrop（ND-1000, Thermo Scientific, USA）在A260/ A280和A260/ A230的吸光度比值检测其浓度及纯度, 纯化的DNA样本保存于-40℃的冰箱中备用.
1.3.4 高通量测序细菌使用通用引物338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）扩增16S rRNA基因的可变V3-V4区[12].真菌使用通用引物ITS3（5'-GCATCGATGAAGAACGCAGC-3'）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）扩增ITS基因[13].利用Illumina MiSeq高通量测序平台分析细菌16S rRNA和真菌ITS基因序列, 测序服务委托深圳微科盟科技集团有限公司.测序完成后, 对下机原始数据首先采用Trimmomatic软件对原始的序列进行质量过滤, 用FLASTQ软件进行拼接, 之后, 使用Qiime 2软件中的DADA 2插件对所有样品的全部原始序列（input）进行质量控制（filtered）, 去噪（denoised）, 拼接（merged）, 并且去嵌合体（non-chimeric）, 最后在97%相似水平上对高质量序列进行聚类, 并将其分配给可操作分类单元（operational taxonomic unit, OTU）, 选取每个OTU中丰度最高的序列作为代表性序列, 分别基于silva 138和unite 8.0数据库对细菌16S和真菌ITS rRNA序列进行物种分类注释, 得到对应物种信息和基于物种的相对丰度分布情况[14].设置置信度阈值为0.7, 且4组处理的α多样性稀释曲线（rarefaction curve）趋于平缓, 表明测序数据量已足够反映当前样品包含的绝大部分的微生物多样性信息.
1.4 数据处理用Microsoft Excel 2019对数据进行基本计算, SPSS 23.0软件进行统计分析, 单因素方差分析（one-way ANOVA）检验处理间土壤理化性质、α多样性差异及群落组成和功能的显著性（显著水平为P < 0.05）, 并用Duncan法进行多重比较；利用GraphPad Prism（v.9.2.2.0）绘制土壤物理、化学和生物指标变化图.基于1.3.4节中OTU列表里各处理物种丰度情况, 通过Qiime中alpha_diversity.py脚本计算群落α多样性指数；为了评估土壤性质对微生物群落的影响, 使用R（v.3.5.0）语言vegan包进行RDA分析和其中的adonis函数进行多元置换方差分析（permutational multivariate analysis of variance, PERMANOVA）；利用SPSS计算变量之间的Spearman相关性, 并利用Gephi（v.0.9.2）进行可视化.
采用PICRUSt软件进行细菌功能预测分析, 利用QIIME获得的colsed OTU Table与KEGG数据库（Kyoto encyclopedia of genes and genomes）进行比对, 获得功能预测信息, 具体分析步骤基于在线分析平台（http://picrust.github.io/picrust）；利用FAPROTAX软件进行细菌群落生态功能预测（https://www.bioincloud.tech）；通过FUNGuild（v.1.0）工具对真菌的营养类型及其功能类群进行分类.
2 结果与分析 2.1 土壤理化性质变化随培养时间增长, 对照组（CK）和添加1% OFK的土壤pH无明显变化, 分别为5.36 ~ 5.56和5.45 ~ 5.59；添加3%和5% OFK后, 土壤pH呈上升趋势, 较初始值分别增加了0.46和0.60个单位[图 1（a）].
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图 1 土壤pH、有机碳和有效养分含量变化 Fig. 1 Changes in soil pH, organic carbon, and available nutrient contents in different treatments |
类似的, CK的有机质、有效磷、速效钾、NH4+-N和NO3--N含量无明显变化[图 1（b） ~ 1（f）]；处理组（含1%、3%和5% OFK）有机质和有效养分含量显著增加, 并且OFK含量越高, 土壤养分含量增幅越大.在培养结束时, 处理组的土壤有机质、有效磷、速效钾、NH4+-N和NO3--N含量分别比CK高23.80% ~ 35.13%、13.29% ~ 29.72%、16.91% ~ 39.37%、164.7% ~ 340.2%和28.56% ~ 32.71%.
2.2 土壤水解酶活性变化在培养期间, CK的7种水解酶变化不大（图 2）；当土壤添加OFK后, 上述酶活性表现为先增后减趋势, 并且其峰值出现时间因厨余垃圾有机肥添加量不同而异, 添加OFK量越高, 峰值越大.7种水解酶平均酶活性表现为：CK < 1% OFK < 3% OFK < 5% OFK或CK < 1% OFK < 3% OFK ≈ 5% OFK.
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图 2 土壤中的水解酶活性变化 Fig. 2 Changes in soil enzymatic activities |
与CK相比, 添加OFK后, 土壤微生物量碳显著增加, 在培养结束时, 表现为：CK < 1% OFK < 3% OFK < 5% OFK（表 2）.添加OFK增加土壤中细菌OTU数, 对Chao、Simpson和Shannon指数无显著影响；真菌OTU数量减少, 但未达到显著水平, Chao、Shannon和Simpson指数随着厨余垃圾有机肥添加量增加而降低, 并且在添加3% OFK后达到显著水平（P < 0.5）.
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表 2 不同处理对土壤微生物生物量碳（MBC）、细菌和真菌α多样性的影响1） Table 2 Soil microbial biomass carbon (MBC), α diversity of bacteria and fungi in different treatments |
2.3.2 土壤微生物群落组成分析 2.3.2.1 纲水平的细菌和真菌组成
图 3展示了前10的优势纲类别, 其他归为others.分析结果表明4个处理的主要优势纲为放线菌纲（Actinobacteria）、γ‐变形菌纲（γ-Proteobacteria）和α-变形菌纲（α-Proteobacteria）, 其相对丰度总和超过了54%.随着OFK的添加量增加, 土壤中放线菌纲、纤线杆菌纲（Ktedonobacteria）、嗜热油菌纲（Thermoleophilia）和嗜酸杆菌纲（Acidobacteriia）相对丰度降低, γ‐变形菌纲、拟杆菌纲（Bacteroidia）和芽孢杆菌纲（Bacilli）的相对丰度则显著增加.
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（a）细菌纲水平的群落组成及相对丰度；（b）真菌纲水平的群落组成及相对丰度 图 3 土壤中细菌和真菌纲水平分布 Fig. 3 Composition and relative abundance of bacterial and fungal class levels in treatments |
4个处理中真菌主要归属于粪壳菌纲（Sordariomycetes）、盘菌纲（Pezizomycetes）、被孢霉纲（Mortierellomycetes）和未知菌, 增加OFK施用量提高了被孢霉纲和盘菌纲相对丰度, 其中1% OFK处理的被孢霉纲相对丰度显著高于其他3个处理, 5% OFK处理的盘菌纲相对丰度与其他处理达到显著水平.
2.3.2.2 属水平的细菌和真菌组成细菌属水平结果分析发现, CK和处理组中链霉菌（Streptomyces）、类诺卡氏菌（Nocardioides）、鞘氨醇单胞菌（Sphingomonas）、芽单胞菌（Gemmatimonas）以及聚糖菌（Defluviicoccus）等菌丰度均较高.值得注意的是, 添加OFK后, 土壤中出现了食碱菌（Alcanivorax）, 其与芽孢杆菌（Bacillus）和罗河杆菌（Rhodanobacte）的相对丰度随着OFK添加量增加而升高[图 4（a）], 分枝杆菌（Mycobacterium）和热酸菌（Acidothermus）则呈相反趋势.
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（a）细菌属水平的群落组成及相对丰度；（b）真菌属水平的群落组成及相对丰度 图 4 土壤中细菌和真菌属水平分布 Fig. 4 Composition and relative abundance of bacterial and fungal genus levels in treatments |
真菌属水平结果中, CK和处理组中优势属中均有较高丰度被孢霉（Mortierella）、木霉（Trichoderma）、（Conlarium）和镰刀菌（Fusarium）等.其中, 添加量为1%处理中被孢霉属丰度显著高于其他3个处理；青霉（Penicillium）、癣囊腔菌（Plectosphaerella）和镰刀菌的相对丰度在添加OFK后显著降低[图 4（b）].
2.3.2.3 土壤细菌群落功能预测分析基于KEGG数据库预测的结果表明[图 5（a）], 一级功能层共注释到6类生物代谢通路功能分析, 包括细胞过程（cellular processes）、环境信息处理（environmental information processing）、遗传信息处理（genetic information processing）、人类疾病（human diseases）、代谢（metabolism）和有机系统（organismalsystems）, 二级功能层获得43条生物学通路.4个处理注释到最多的KEGG功能分类都是氨基酸代谢, 平均约占所有功能通路的11.44%.其次是碳水化合物代谢、辅助因子和维生素代谢以及脂质代谢, 这3类功能的相对丰度介于6.71% ~ 9.68%.不同处理中超过83.72%微生物功能代谢通路的相对丰度无显著差异, 仅膜运输、细胞运动性、免疫系统、碳水化合物代谢、其他次生代谢产物生物合成、物质依赖性与内分泌和代谢疾病这7类功能在不同处理中存在显著差异.随着OFK添加量增加, 膜运输、细胞运动性、免疫系统、碳水化合物代谢以及其他次生代谢产物生物合成相对丰度增加, 物质依赖性和内分泌和代谢疾病则表现出相反趋势.
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（a）基于PICRUSt的预测结果；（b）基于FAPROTAX的预测结果；同一行中, 不同小写字母表示差异显著（P < 0.05） 图 5 细菌群落功能预测热图 Fig. 5 Function prediction of bacterial community |
再利用FAPROTAX软件基于种分类水平的细菌群落组成进行生态功能预测, 4个处理的可预测比例为55.98% ~ 79.08%.4个处理的细菌群落功能主要有纤维素水解作用、需氧异养、芳香化合物降解和化学异养（丰度 > 1%）, 并且与CK相比, 预测的群落功能中超过50%无显著变化.当添加了OFK后, 土壤中细菌群落的硝化作用、硫酸盐呼吸、含硫化合物的呼吸和光自养及细胞内寄生等功能丰度下降, 而反硝化作用、纤维素水解作用、木聚糖解、芳香烃降解、芳香化合物降解、脂肪族_非甲烷_碳氢化合物降解、碳氢化合物分解及硝酸盐还原等功能丰度升高.
2.3.2.4 真菌群落功能预测分析根据FUNGuild功能预测可获得样品中真菌的功能分类及在各处理中的丰度信息（图 6）, 结果显示, 真菌群落营养类型可分为7类：病理营养型（pathotroph）、病理-腐生营养型（pathotroph-saprotroph）、病理-腐生-共生营养型（pathotroph-saprotroph-symbiotroph）、病理-共生营养型（pathotroph-symbiotroph）、腐生营养型（saprotroph）、腐生-共生营养型（saprotroph-symbiotroph）和共生营养型（symbiotroph）.4个处理均以腐生营养型（12.39% ~ 19.24%）、腐生-共生营养型（5.58% ~ 17.08%）和病理-腐生-共生营养型（5.19% ~ 8.63%）为主；随着OFK添加量增加, 病理营养型、病理-腐生营养型、病理-共生营养型以及腐生营养型占比均降低；腐生-共生营养型和共生营养型占比则增加, 并且CK中未检测到共生营养型.
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图 6 真菌群落的功能预测 Fig. 6 Function prediction of fungal community |
对上述7类营养型进行进一步分类, 通过功能类群鉴定, 检测出35种功能群（图 7）.值得注意的是, 随着OFK添加量的增加, 动物病原真菌（animal pathogen）、动物病原-内生-植物寄生-真菌寄生-植物病原-木质腐生真菌（animal pathogen-endophyte-epiphyte-fungal parasite-plant pathogen-wood saprotroph）、动物病原-植物病原-未定义腐生真菌（animal pathogen-plant pathogen-undefined saprotroph）、粪腐生-植物腐生-木质腐生真菌（dung saprotroph-plant saprotroph-wood saprotroph）、内生-植物病原菌-未定义腐生真菌（endomycorrhizal-plant pathogen-undefined saprotroph）和植物病原真菌（plant pathogen）等15类功能群占比下降；外生菌根真菌-未定义腐生真菌（ectomycorrhizal-undefined saprotroph）、粪腐生-木质腐生真菌（dung saprotroph-wood saprotroph）和植物内生-凋落物腐生-土壤腐生-未定义腐生真菌（endophyte-litter saprotroph-soil saprotroph-undefined saprotroph）等功能群占比提高, 并且, 大部分施用OFK的处理与CK间达到了显著水平.
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图 7 预测真菌功能基因在不同样处理间的差异 Fig. 7 Variation in predicted functional profiles in different treatments |
基于培养结束时土壤中细菌和真菌OTU的共现网络变化, 了解添加OFK对土壤中细菌和真菌群落的影响.随着土壤中OFK添加量增加, 细菌和真菌群落的共现网络的节点数和连接数明显增加（图 8）, 模块化程度增加, 物种间相互作用增强.此外, 提高土壤OFK添加量后, 共现网络中正相关连接的节点大量增加, 增加了2.5倍.
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图 8 基于土壤中细菌和真菌OTU构建的共现网络 Fig. 8 Co-occurrence network based on soil bacteria and fungi OTU |
Permanova分析结果（P细菌=0.007, P真菌=0.002）表明环境因子对物种群落具有极显著影响, 并且随着OFK添加量增加, 处理间的细菌和真菌群落差异增大.从图 9可知, pH、OM、MBC以及有效养分（包括铵态氮、有效磷和速效钾）对细菌群落结构有显著（P < 0.05）或极显著（P < 0.01）影响；pH、MBC以及有效养分（包括铵态氮、硝态氮、有效磷和速效钾）对真菌群落结构产生极显著影响（P < 0.01）.
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OM表示有机质, AP表示有效磷, AK表示速效钾, NH4+-N表示铵态氮, NO3--N表示硝态氮, MBC表示微生物生物量碳；*表示P < 0.05, **表示P < 0.01 图 9 土壤细菌和真菌群落与土壤性质的冗余分析 Fig. 9 RDA relationship between bacterial and fungal communities and soil physical and chemical factors |
厨余垃圾堆肥产品不但养分全、有机质含量高, 而且杂质少、重金属含量低、有毒物质少, 具有很高的农业应用价值[15].有研究发现, 施用厨余垃圾肥料化产品能显著提高土壤有机质、全氮和速效钾等养分含量, 增强土壤酶活性[7].土壤有机质是土壤肥力的物质基础, 其含量的增加可有效改善土壤物理性能, 调节土壤酸碱平衡, 提高作物根系活力, 促进作物生长, 从而提高作物产量.本研究中, 土壤培养试验结果表明, 在土壤中添加OFK后, 土壤有机质和多种有效养分含量均显著增加, 说明其具有提高土壤肥力的功效.
土壤酶能催化土壤中养分循环、有机质合成与降解和能量代谢等各种生物化学反应[16].N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶参与氨基酸类物质降解, 参与土壤中碳、氮转化；α-葡萄糖苷酶和β-葡萄糖苷酶等酶能水解纤维素和木聚糖等多糖, 是土壤碳循环的重要参与酶；磷酸酶与土壤磷素循环有关[17].此外, 酶活变化比土壤其他理化特性变化发生得更早, 是土壤健康的重要指标之一[18].土培试验结果表明, 添加OFK后, 土壤水解酶活有不同程度提高, 说明OFK施入土壤中, 短时间内增加了土壤有机物输入, 改善土壤生态环境, 促进微生物代谢过程, 有利于推动各种酶促反应发生[18, 19].
3.2 施用厨余垃圾有机肥对土壤细菌和真菌群落组成的影响微生物是土壤生态系统的重要组成成分, 与土壤功能、质量、肥力和生产力水平高低具有密切相关性[16].在添加厨余垃圾有机肥后, 土壤微生物生物量碳升高, 说明微生物数量增加[10].Pascual等[20]研究发现, 厨余废弃物中有大量氮和碳水化合物, 可作为土壤微生物的氮源和碳源, 有利于提高土壤微生物活性, 增加土壤生物量, 为作物高产提供良好的土壤微生物环境.另外, OFK来源广, 氮和碳源种类多, 能满足微生物对不同种类碳源和氮源的需求, 更有利于微生物繁殖.本研究中, 土培试验结果显示, 添加OFK刺激细菌OTU数量增加, 但真菌表现出相反趋势, 并显著降低了真菌的多样性. 一般认为, 多样性指数可以用来表征生物群落物种的丰富程度, 数值愈大意味着生物种类越多；优势度指数愈大, 则表明群落中的优势种群越突出.一个稳定健康的生态环境中, 生物物种丰富, 具有较高的多样性指数；反之则物种较少, 优势度指数较大[21].土壤真菌中植物病原真菌的比例显著高于细菌和放线菌[22].施肥改变土壤细菌、真菌和放线菌的比例关系, 施用有机肥或秸秆还田可提升土壤中有益菌的数量, 抑制病原真菌生长, 避免土壤真菌化[23].因此, OFK对土壤真菌的作用类似于普通有机肥和秸秆.
4个处理的主要细菌优势纲为放线菌纲、γ‐变形菌纲和α-变形菌纲.变形菌、放线菌在所有土壤中占比都比较高, 这与以往的很多研究类似, 它们在有机物矿化过程中有着重要贡献[5].添加少量OFK对土壤细菌优势纲影响较小, 当OFK添加量增至3%以后, 多个纲的相对丰度发生变化.例如, 随着OFK的添加量增加, 纤线杆菌纲和嗜酸杆菌纲相对丰度降低, 拟杆菌纲、变形菌以及芽孢杆菌纲等则增加.纤线杆菌纲和嗜酸杆菌纲属于典型的贫营养类群, 对养分要求不高[24]；而拟杆菌、变形菌及杆菌在有机质和养分含量高的土壤中丰度更高, 是富营养类群微生物, 增加OFK有利于这类微生物生长, 同时它们的高丰度也反映了土壤的高肥力[25, 26].另外, 嗜酸杆菌喜酸性环境, 当OFK添加量增至3%后, 土壤pH提高了近1个单位, 这也可能是嗜酸杆菌纲丰度降低的原因[25].不同处理的真菌优势纲主要归属于粪壳菌纲、盘菌纲以及被孢霉纲, 它们参与有机质矿化, 分解植物残体和有机肥中的有机质, 还能供给植物营养.被孢霉纲菌株能产生生物活性物质, 具有改善土壤健康状况和促进植株生长的作用, 有些菌株可能还具有生防功能[27].增施OFK后, 被孢霉纲相对丰度增加, 增加了有益真菌丰度.
分析土壤微生物优势属, 结果表明各处理中链霉菌、类诺卡氏菌、鞘氨醇单胞菌和芽单胞菌属等有益菌细菌丰度均较高.链霉菌和类诺卡氏菌为有益放线菌, 能分解有机质促成腐殖质, 分泌抗生素和植物生长激素[28]；鞘氨醇单胞菌能降解多环芳烃等高分子有机污染物, 清除农药污染[29].可见, 土壤细菌具有丰富的生理、生化和生态功能.值得注意的是, 施用OFK促进土壤芽孢杆菌、食碱菌以及罗河杆菌繁殖, 抑制了分枝杆菌生长.芽孢杆菌是一种常见根际有益促生细菌, 具有生防、促生、提高根系活力和多种抗逆功能[30]；食碱菌具有耐高温、硫和重金属胁迫环境的代谢特征[31]；罗河杆菌具有低温降解纤维素的功能[32]. 分枝杆菌属种多为致病菌[33].施用OFK在本研究中被证明是一种能提高土壤有益菌相对丰度, 同时抑制致病菌的、可促进土壤健康的有效措施.被孢霉菌是有益真菌, 能与植物共生改善宿主植物养分条件和提高抗逆性, 它对甾族化合物和油脂等有生物转化作用[34], 有研究发现它还具有生防作用[27]；癣囊腔菌会诱发植物萎蔫病和根腐病[35]；镰刀菌常引起植物的根腐、茎腐、茎基腐、花腐和穗腐等多种病害[36].本试验中, 添加OFK促进被孢霉生长, 并抑制癣囊腔菌和镰刀菌生长, 这也可能是添加OFK后真菌的多样性指数下降的原因.可见, 添加该有机肥促进了有益菌的生长, 抑制了病原菌繁殖.
3.3 施用厨余垃圾有机肥对土壤细菌和真菌群落结构的影响本研究通过共现网络分析了施用OFK后土壤微生物网络结构上的差异, 将不同处理间细菌和真菌物种之间的关联性进行量化和可视化[37].首先, 施用OFK显著提高了微生物共现网络的模块化和复杂程度, 微生物物种之间的相互作用增强, 共现网络的复杂化增强微生物组功能[38].推测是丰富碳源和氮源等物质的投入, 促进了微生物大量繁殖, 属水平分析也表明OFK刺激了有益菌丰度增加, 促成了更加紧密和频繁的相互作用, 从而增强细菌群落的稳定性[39].其次, 土壤细菌间存在正相关性和负相关性, 可能分别代表协同作用和拮抗作用, 当施用了3%以上OFK, 土壤微生物网络节点间的正相关连接数大量增加, 占比显著增大, 表明提高OFK施用量后, 促成了物种之间互惠互作关系；网络显现出更高的连通度和模块化程度同样表明物种之间存在稳定的共生关系和频繁的相互作用.有研究表明高连接度和模块化的共现网络的微生物组可以更迅速地激活植物免疫系统, 提高对病原菌的抵抗能力[40].这也可能是本研究中癣囊腔菌、镰刀菌和分枝杆菌丰度下降的原因.
RDA结果进一步佐证了4个处理微生物群落结构存在差异, 并且OFK添加量越大对土壤微生物群落结构的影响力越强.土壤性质（如土壤pH、含水量、有机质、透气性和养分有效性等）、气候因素以及土地利用方式等对土壤微生物群落结构都具有重要的影响[41 ~ 43]. Bahram等[44]利用宏基因组学技术分析全球近190个不同地点约7 600份表层土壤样本, 发现细菌和真菌受土壤pH和降水影响表现出全球性的生态位分化.Mendes等[45]采集不同土地利用方式的土壤, 经鸟枪法宏基因组测序分析发现土地利用变化改变了微生物群落的结构和组成, 并且发现土壤微生物群落结构与土壤性质有着紧密联系.其中, 在种植了大豆的农业土壤和牧场土壤中, 影响微生物群落结构的主要因素是土壤pH以及Cu和NO3--N含量；在热带森林土壤中, 则是土壤潜在酸度和有机质.基于宏基因组测序分析, 王智慧等[46]发现土壤有机质、氮素和水分也都对微生物群落结构有一定影响.在本研究中, 添加OFK后, 土壤pH、微生物生物量碳以及有效养分（包括铵态氮、有效磷和速效钾）等发生不同变化, 对细菌和真菌群落组成有显著影响.
3.4 施用厨余垃圾有机肥对土壤细菌和真菌群落功能的影响由于微生物系统中存在高度生态功能冗余, 因此微生物群落结构并不一定决定了它的功能[47], 还需进行微生物功能分析, 进一步理解土壤微生物这个“黑匣子”.乔宇颖等[5]利用PICRUSt基因预测发现麦稻茬口期施用沼液和尿素处理的主要土壤细菌类群代谢功能表现相似, 施沼液在一定程度上可以替代化肥平衡土壤养分和维持土壤生态功能.为进一步了解改土措施对微生物群落功能的影响, 仲阳等[48]使用FAPROTAX软件对细菌群落进行功能预测, 发现细菌功能主要集中于氮素和芳香族化合物代谢过程, 并且改土措施激活和富集与硝酸盐或氮素呼吸和还原有关的细菌微生物, 为土壤肥力的持久供给奠定了微生物活性基础.本研究通过与KEGG数据库进行比对, 将功能基因进行分类注释, 以此来评估细菌群落组成差异对其群落水平功能造成的影响.分析结果表明不同处理土壤中细菌群落结构差异显著, 但不同处理中超过83.72%细菌功能代谢通路的相对丰度无显著差异, 说明添加OFK没有破坏土壤细菌生态功能.本研究发现碳水化合物代谢以及其他次生代谢产物生物合成功能丰度增加.利用FAPROTAX进行功能预测, 也显示添加OFK刺激了土壤细菌群落纤维素水解作用、木聚糖解、芳香烃降解、芳香化合物降解、脂肪族_非甲烷_碳氢化合物降解和碳氢化合物分解等功能丰度升高, 这与土壤中有机质、碳循环相关酶活性提高以及芽孢杆菌、罗河杆菌、食碱菌等有益微生物增加相吻合, 说明施用OFK在加速碳循环和促进有益微细菌生长方面具有良好效果.值得注意的是, 当OFK添加量达到5%后, 其反硝化作用和硝酸盐还原功能显著高于CK, 因此, 在田间施用时需要控制施用量和增加土壤透气性.
自然界中真菌多种多样, 广泛分布于各种生境中.近年来, 高通量测序的普及使得基于ITS序列的真菌数据大量产生, 极大地丰富了对环境中真菌多样性的认识.基于FUNGuild对真菌进行功能注释, 能从生态功能视角剖析不同处理下真菌生态功能变化, 给研究者们分析试验结果带来了极大地便捷[49]. 利用FUNGuild功能预测分析, 乔宇颖等[5]发现施用沼液与尿素21 d后, 真菌功能差异主要发生在腐生营养型和病理营养型上；施加生物炭后, 土壤病理营养型真菌丰度下降, 腐生营养型真菌丰度显著提高, 说明生物炭对土壤的物质循环和病害防治具有一定的促进作用[50].王香生等[51]基于真菌功能预测结果发现, 间作显著降低了红花根际植物病原菌类真菌的总相对丰度.本研究中, FUNGuild功能预测结果反映随着OFK添加量增加, 腐生-共生营养型和共生营养型占比则呈现了增加趋势, 并且CK处理中未预测到共生营养型.可见, 添加OFK之后, 促进了共生关系的建立, 增加了菌群间的合作, 这也与共现网络分析结果相符合, 进一步证明, 提高OFK施用量后, 促成了物种之间互惠互作关系.并且, 预测结果还显示施用OFK后, 土壤中动植物病原真菌占比减少, 却增加了外生菌根真菌-未定义腐生真菌占比.有研究表明, 外生菌根真菌对宿主植物具有多项生态效益, 包括促生、改善养分、提高对生物和非生物胁迫的抗（耐）性等[52, 53], 这印证了真菌群落结构分析结果中施用OFK刺激有益真菌丰度增加和抑制植物病原菌生长这一结论.然而, FUNGuild是基于现有研究对真菌功能进行判别分析, 划分类别不够全面和完善, 还存在较多未知的功能注释, 因此, 仍需进一步研究.
4 结论（1）施用OFK能提高土壤有机质、NH4+-N和NO3--N、有效磷及速效钾含量, 增强与碳、氮和磷转化的相关水解酶活性.
（2）不管是从纲还是属分类水平, 添加OFK对土壤微生物群落结构都会产生显著影响, 通过冗余分析发现, 土壤pH、有机质、有效养分和微生物量碳等为主要影响因素.
（3）添加OFK后, 在属水平上表现为土壤中有益菌相对丰度增加, 植物病原菌显著降低.
（4）PICRUSt和FAPROTAX预测结果表明, 不同处理中超过83.72%细菌功能代谢通路的相对丰度无显著差异, 表明土壤细菌群落在功能层上表现相似.但是, 随OFK添加量增加, 膜运输、细胞运动性、免疫系统、碳水化合物代谢以及其他次生代谢产物生物合成相对丰度增加, 并且纤维素水解作用、木聚糖解、芳香烃降解、芳香化合物降解和碳氢化合物分解等功能丰度升高, 说明添加OFK不仅没有破坏土壤细菌群落生态功能, 还提高了其对碳的利用能力和代谢能力.
（5）FUNGuild真菌功能预测结果表示, 添加OFK刺激腐生-共生营养型和共生营养型占比增长, 增加外生菌根真菌-未定义腐生真菌等占比；同时, 土壤中动植物病原真菌占比减少, 可见OFK能促进共生关系建立并抑制病原真菌生长.
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