2023, Vol. 44
2. 北京建工环境修复股份有限公司污染场地安全修复国家工程实验室, 北京 100015
, WANG Hua-wei1
, MENG Xiang-yu1 , SUN Ying-jie1 , WANG Ya-nan1 , LI Shu-peng2 , YANG Yue-wei2 , LIU Peng2 , LIU Yuan-wen2
2. National Engineering Laboratory for Safety Remediation of Contaminated Sites, Beijing Construction Engineering Environmental Remediation Co., Ltd., Beijing 100015, China
焦化行业与工业发展息息相关, 在工业发展最为迅速的21世纪初, 我国焦化厂数量和焦炭产量快速增长[1].截至2018年中国焦炭产量达4.4×108 t, 约占全球煤炭消费量的67.0%[2].然而, 焦炭的生产过程中会伴随多种有机污染物的产生[3].多环芳烃(polycyclic aromatic hydrocarbons, PAHs)是一类亲脂疏水性有机污染物[4], 是焦化场地污染土壤中的典型污染物, 大多分布于焦炉煤气厂、精炼厂和其他化工场所[5, 6].Zhang等[7]对广东省松山焦化厂进行取样研究, 发现土壤中∑PAHs含量高达1 146.4 mg·kg-1.Liao等[8]研究发现北京市某大型钢厂区域内土壤∑PAHs含量最高为1 428.0 mg·kg-1.此外, Gou等[9]也发现北京市某废弃炼钢厂土壤中∑PAHs含量高达为426.9 mg·kg-1.因PAHs具有致畸、致癌和致突变等特性[10], 焦化厂地污染土壤必须经过修复治理, 方可进行开发利用.
目前, 焦化场地PAHs污染土壤的修复方法主要包括淋洗、化学氧化、热脱附和生物修复技术等[11~14].热脱附技术具有效率高、修复周期短和适用性广等优点, 但处理成本较高, 且修复效果受温度、污染物含量和土壤类型等[15]多种因素影响.有研究表明, 黏土颗粒易发生团聚作用或受热板结, 导致其内部难以被加热, 热脱附修复效率低[16].淋洗技术主要是利用淋洗剂将土壤中的污染物溶解, 从而达到洗脱污染物的效果, 但处理成本较高、易二次污染和对高环PAHs淋洗效果较差[17].生物修复中的微生物修复技术, 可实现PAHs的完全降解, 同时具有成本低、环境扰动小和可就地处理等优点, 被认为是经济、安全和环保的PAHs修复技术, 然而, 单独微生物修复处理的修复周期长, 不适于高含量PAHs污染土壤[18].化学氧化技术是利用氧化剂的氧化作用将土壤中有机污染物转化为毒性更小或无毒的物质.化学氧化技术具有效率高、周期短和适用多种污染物等优点[19].常用的化学氧化剂包括过氧化氢[20]、芬顿试剂[9]、高锰酸盐[21]、过硫酸盐[22]和臭氧[23]等.对比国内外研究可知, 虽然化学氧化技术相对其他技术效果更理想, 但在实际修复中发现不同类型氧化剂对PAHs的修复效果差别较大, 部分氧化剂仅在高剂量时才能满足修复目标, 但这样不仅会造成处理成本递增, 也会引发其他问题[24].有研究表明[25], 高锰酸钾氧化处理时会降低土壤的渗透性, 进而使土壤质量退化.
鉴于化学氧化技术成本较高和二次污染问题, 有科研人员采用化学氧化联合微生物修复技术, 即利用化学氧化技术将污染物降至较低水平, 再利用微生物进一步降解PAHs以实现其完全去除[26, 27].该方式不仅避免氧化剂高量添加的同时还可以明显提高PAHs修复效果, 起到“1+1>2”的效果.Liao等[28]将化学氧化与生物菌剂联合使用发现, 芬顿、高锰酸钾和过硫酸盐等氧化剂先降低了土壤中的PAHs含量, 生物刺激后的微生物将进一步降解残留的PAHs, 显著提高了PAHs的修复效果.土著微生物作为土壤生物的重要组成部分, 对污染物生物降解起到至关重要的作用.然而, 基于现在研究报道, 氧化剂对土著微生物生理生态功能的影响尚未形成统一定论.例如, Liu等[29]、Liao等[28]和Gou等[22, 27]等研究表明, 化学氧化仅暂时降低微生物活性, 可通过生物刺激的方式恢复微生物对污染物的降解能力.但Liao等[30]研究发现, 化学氧化处理后可培养的土著微生物数量由104 CFU·g-1降至几乎为0, 且15 d内微生物数量级未能恢复.此类现象主要有两方面原因: 一是污染物种类、氧化剂种类和投加量的差异; 二是多数研究在不同的土壤类型和环境条件下完成, 缺少相同条件下修复效果有效对比分析.因此, 在现有研究的基础上, 需要对不同氧化剂处理过程PAHs修复效果与土著微生物数量和生理生态响应关系进行系统研究.
本文以高锰酸钾、过硫酸钠和臭氧为氧化剂, 以我国某焦化场地污染土壤为对象, 研究不同液固比下各氧化剂对PAHs的修复效率, 并分析修复前后焦化土著微生物数量、群落结构、多样性及代谢功能的变化规律, 探讨PAHs的修复效果与土著微生物生理生态功能的响应关系, 以期为焦化场地污染土壤的化学氧化-微生物修复提供理论指导和数据支撑.
1 材料与方法 1.1 供试土壤供试土壤取自山西省某焦化厂污染场地.所取土样经去除杂质混合均匀后置于4℃冰箱内保存待处理, 用于微生物分析的样品置于-80℃下保存.土壤基本理化性质: 含水率为11.1%, pH为8.3, ω(有机质)为38.9 g·kg-1, 电导率为197.8 μS·cm-1, ω(Mn)为678.7 mg·kg-1, ω(Fe)为10.5 g·kg-1.16种PAHs(∑PAHs)含量(mg·kg-1)分别为: 萘0.2; 苊烯10.3; 二氢苊248.0; 芴177.0; 菲183.0; 蒽22.1; 荧蒽13.9; 芘10.1; 苯并[a]蒽2.9; 
为了探究氧化剂在不同液固比下对焦化土壤中PAHs的去除效率以及对土著微生物生理生态功能的影响, 结合相关研究报道, 选取3种氧化剂——高锰酸钾[31]、过硫酸钠[26]和臭氧[23], 在相同的反应条件下, 每组设3个平行样.具体操作: 取150 g污染土壤于2 L烧杯中, 按液固比(质量比, 下同)6 ∶1、7 ∶1和8 ∶1分别加入去离子水900、1 050和1 200 mL, 调制为泥浆体系, 再按照不同比例投加高锰酸钾或过硫酸钠(见表 1).以污染原土为对照组(CK), 将各实验组样品置于搅拌器中搅拌(600 r·min-1), 使氧化剂与污染物充分反应, 于室温下搅拌24 h.对于臭氧实验组, 采用间歇曝气的方式, 每30 min内曝气10 min, 臭氧流量为72 mg·min-1, 反应2 h.定期取样, 于4 000 r·min-1下离心20 min, 固液分离, 测定水和土壤中PAHs含量.部分土壤样品置于-80℃冰箱保存, 用于微生物数量和群落结构分析.
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表 1 实验设计和处理组 Table 1 Experimental design and three treatments |
1.3 分析方法 1.3.1 土壤样品中PAHs含量的测定
样品预处理采用索氏提取法, 使用V二氯甲烷 ∶V丙酮=1 ∶1的混合溶剂控制回流速度为4~6次·h-1, 提取18 h, 然后通过氮吹浓缩至小于2 mL, 硅胶柱净化后再浓缩至小于1 mL.加入内标储备液(使用二氯甲烷和正己烷, 按1 ∶1稀释)后, 定容至1 mL待测.PAHs含量采用气相色谱-质谱法(GC-MS, 8890/5977B安捷伦, 美国)测定.色谱条件: 进样量1.0 μL; 进样口温度280℃, 不分流; 柱流量1.0 mL·min-1.柱温: 35℃开始, 保持2 min; 以15℃·min-1升至150℃, 保持5 min; 以3℃·min-1升至290℃, 保持2.0 min. PAHs的定量方法为采用内标法, 标线范围为1~20 mg·L-1.16种PAHs的回收率: 萘, 87.3%; 苊烯, 86.4%; 二氢苊, 94.9%; 芴, 92.9%; 菲, 89.1%; 蒽, 92.2%; 荧蒽, 88.0%; 芘, 103.0%; 苯并[a]蒽, 88.9%;
取样后, 1 d内提取土壤DNA, 分析样品微生物多样性、群落结构及代谢功能变化.采用Mobio Power Soil DNA Isolation kit试剂盒对土壤样品进行DNA提取, 提取的DNA样品浓度和纯度采用超微量分光光度计进行检测.细菌16S rRNA基因的扩增区域为V3~V4区, 扩增引物为341F(5′-CCTACG GGNGGCWGCAG-3′)和805R(5′-GACTACHVGGG TATCTAATCC-3′).PCR反应条件: 预变性94℃, 3 min → 5个循环(变性94℃, 30 s →退火45℃, 20 s →延伸65℃, 30 s) → 20个循环(变性94℃, 20 s →退火55℃, 20 s →延伸72℃, 30 s) →再延伸72℃, 5 min.采用Illumina MiSeq 2×250 bp平台进行测序.此外, 细菌数量变化采用荧光定量PCR法.细菌16S rRNA引物为1369F(CGGTGAATACGTTCYCGG)和1492R(GGWTACCTTGTTACGACTT).
1.3.3 统计分析利用SPSS 20.0单因素方差分析(LSD事后多重比较法)进行多样本组间差异性分析.
2 结果与讨论 2.1 不同液固比条件下各氧化剂对PAHs的去除不同液固比条件下各氧化剂对PAHs的去除效果见图 1和图 2.以高锰酸钾为氧化剂时, 液固比为6 ∶1条件下其对∑PAHs的去除率为96.9%, ∑PAHs含量降至20.8 mg·kg-1, 而在液固比为7 ∶1和8 ∶1条件下∑PAHs含量降至70.1 mg·kg-1和78.3 mg·kg-1, 去除率分别为89.6%和88.5%.此外, 在液固比分别为6 ∶1、7 ∶1和8 ∶1时, 高锰酸钾对9种PAHs的去除率分别为77.6% ~100.0%、65.5% ~97.1%和25.0% ~85.5%, 最高去除率出现在液固比6 ∶1时的菲(3环), 而在液固比为8 ∶1时二苯并[a, h]蒽(6环PAHs)的去除率最低(图 2).以过硫酸钠为氧化剂时∑PAHs的去除率较高锰酸钾偏低, 液固比为6 ∶1时其去除率为95.7%, 此时残余∑PAHs含量为29.0 mg·kg-1; 而在液固比为7 ∶1和8 ∶1时残余∑PAHs含量均有所增加, 但未随液固比的增加而增加.然而, 臭氧对PAHs的去除效果呈现不同趋势, ∑PAHs的去除率随液固比的升高而逐渐升高.
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不同小写字母表示处理间差异显著(P＜0.05), 相同小写字母表示处理间差异不显著(P≥0.05), 下同 图 1 不同液固比下各氧化剂处理后∑PAHs含量及其去除率 Fig. 1 Changes in ∑PAHs concentration and removal efficiency with different liquid-solid ratios and oxidants |
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(a)苊烯, (b)二氢苊, (c)菲, (d)荧蒽, (e)芘, (f)苯并[a]蒽, (g)苯并[a]芘, (h)二苯并[a, h]蒽, (i)苯并[ghi]苝 图 2 不同液固比下各氧化剂处理后9种PAHs的去除率 Fig. 2 Removal efficiency of nine PAHs with different liquid-solid ratios and oxidants |
对比分析可知, 高锰酸钾和过硫酸钠均在液固比为6 ∶1时对PAHs的去除率达到最高, 可能是因为随液固比的升高, 氧化剂与土壤样品的接触面积逐渐减小, 氧化剂被稀释, 氧化能力降低, 这与Chen等[32]研究的结果相一致.此外, 上述2种氧化剂对9种PAHs的去除中, 去除率最高的是低环的菲或二氢苊, Gou等[9]研究也发现, 尽管添加的氧化剂种类和剂量不同, 但PAHs中去除率最高的仍是3环的菲或二氢苊.然而, 臭氧对PAHs的去除效果呈现不同趋势, 即液固比越高, 其对PAHs的去除效率越高.当臭氧氧化PAHs时, 存在化学氧化过程以及臭氧与污染物在不同相中的传质过程, 且这两种过程相互影响.臭氧需要经气-液界面由空气传递到水相中, 再经过固液界面进入土壤中对PAHs进行氧化, 而且吸附于土壤颗粒的PAHs也会经过固-液界面由土壤传递到水相中, 在水相中进行氧化降解, 当液固比增加时, 含水率增加, 气-固界面接触面积减少, 土壤孔隙中的臭氧消耗量减少, 臭氧分子平均线流速率增加, 穿透能力更强, 臭氧会获得更好的传质过程[33].此外, Tamadoni等[23]研究也发现, 在臭氧流量为4.2 g·h-1时, 通过增加水的体积可提高其对污染物的去除效果, 其中蒽和菲的去除率分别由57.0%和80.2%分别提高到72.0%和96.0%.
2.2 不同氧化剂在不同液固比条件下对PAHs的去除效果不同氧化剂在不同液固比条件下对土壤PAHs的去除率如图 3和图 4所示.3种氧化剂氧化能力强弱表现为: 高锰酸钾>过硫酸钠>臭氧.在液固比为6 ∶1时, 高锰酸钾和过硫酸钠对∑PAHs的去除率分别为96.9%和95.7%, 而此时臭氧对∑PAHs的去除率仅为76.4%.对于不同类型的PAHs, 3种氧化剂表现出了不同的去除效果, 高锰酸钾对PAHs一直保持最高的去除率, 特别是对二氢苊的去除率达到了97.8%.值得注意的是, 高锰酸钾对苯并[a]芘的去除率为100.0%, 明显高于其他两种氧化剂(图 4).在液固比为7 ∶1时, 高锰酸钾对∑PAHs依然具有较高的去除率, 为89.6%, 过硫酸钠和臭氧次之.此时, 高锰酸钾对二氢苊的去除率为97.1%, 而对于高环的苯并[a]芘的去除率仍可达到85.7%.在液固比为8 ∶1时, 臭氧对PAHs的去除率有所提升, 略高于高锰酸钾和过硫酸钠, 而且对不同类型PAHs均具有较好的去除效果, 特别是对低环PAHs, 臭氧对二氢苊的去除率达到了93.7%.
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图 3 3种氧化剂在不同液固比下对∑PAHs的去除效率 Fig. 3 Removal efficiency of ∑PAHs after treatments with three oxidants |
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(a)苊烯, (b)二氢苊, (c)菲, (d)荧蒽, (e)芘, (f)苯并[a]蒽, (g)苯并[a]芘, (h)二苯并[a, h]蒽, (i)苯并[ghi]苝 图 4 3种氧化剂在不同液固比下对9种PAHs的去除效率 Fig. 4 Removal efficiency of nine PAHs after treatments with three oxidants |
在低液固比时, 高锰酸钾对土壤PAHs去除效率最高.Boulangé等[21]研究发现, 对于焦化土壤中PAHs的去除效率, 高锰酸钾比类Fenton要显著提高, 前者降解率为58.0%, 而后者仅为14.0%.也有研究认为, 高锰酸钾是一种较为稳定的氧化剂, 其可以在土壤中留存数月, 这就允许其更好地扩散运输到土壤颗粒中直接与PAHs接触使其氧化降解[21].Biache等[34]研究发现, 芬顿和类芬顿所产生的羟基自由基(HO·)反应速率很快, 具有非选择性, 容易被其他物质所消耗, 限制了其对PAHs的氧化能力.此外, 对比可知, 过硫酸钠对PAHs的去除效果介于高锰酸钾和臭氧之间, 其对于PAHs的氧化降解主要是依靠Fe2+激活过硫酸钠产生的过硫酸盐自由基(SO4-·).理论上过硫酸钠用量越大以及活化后自由基浓度越高, 对于PAHs的去除效果就越好, 但Gou等[26]研究发现, 当过硫酸钠用量从1.0%增至3.0%时, 其对PAHs的去除率有明显提高, 但是当用量继续增加时(如6.0%或10.0%), PAHs的去除率未出现大幅提高.可见, 随过硫酸钠投加量增加, 并不意味着PAHs的去除效率也随之增加.此外, Liang等[35]研究也发现, 有机污染物降解和过硫酸钠的消耗几乎是同时发生的, 在过量Fe2+存在下SO4-·的竞争降低了有机污染物的降解效率.
2.3 不同氧化剂处理后液相中PAHs残留量不同液固比条件下氧化处理后上清液PAHs残留量如表 2所示.由表 2可知, 对照组(去离子水)处理时16种PAHs含量都低于检出限, 符合PAHs亲脂疏水的特性.高锰酸钾处理时, 仅有3环的苊烯、二氢苊、芴、菲和蒽有微量的溶出, 而其他低环(如萘)或高环[如芘、苯并(a)芘和苯并(k)荧蒽等]PAHs均未检出.除苊烯和芴在液固比8 ∶1时残留率为1.1%和1.6%外, 其余几种3环PAHs的残留率均低于1%.相比而言, 过硫酸钠和臭氧处理时, 变化规律与高锰酸钾相一致, 仅检测出3环PAHs, 但残留率略高于高锰酸钾实验组.过硫酸钠处理时, 二氢苊在液固比为6 ∶1和8 ∶1时残留率为2.3%和5.7%; 而臭氧处理时, 二氢苊在液固比6 ∶1、7 ∶1和8 ∶1分别为1.8%、1.8%和1.3%.可以看出, 虽然PAHs具有亲脂疏水性, 但在化学氧化修复过程中, 氧化剂的存在可能会削弱PAHs与土壤基质表面形成的吸附键键能, 导致表面张力降低, 促使部分疏水性弱的PAHs从土壤中脱附解吸, 从而转移到液相[36].此外, 土壤性质、有机质组成和污染物含量的差异也在很大程度上会影响PAHs降解效果和反应机制, 导致PAHs的辛醇-水分配系数发生变化, 导致部分PAHs释放进入溶液体系.然而, 以上残留的PAHs仅为部分易降解的PAHs, 而非高毒且难降解的PAHs[如苯并(a)芘和苯并(k)荧蒽等], 且残留率相对较低.
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表 2 不同氧化剂处理后滤液中PAHs残留率1)/% Table 2 Residual percentage of PAHs in filtrate after treatments with different oxidants/% |
2.4 微生物数量变化
3种氧化剂氧化过程中土壤中微生物数量变化见图 5.
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(a) 高锰酸钾, (b) 过硫酸钠, (c) 臭氧 图 5 不同氧化剂处理时土壤微生物数量变化 Fig. 5 Changes in bacterial quantity with different oxidants |
由图 5(a)可知, 氧化前土壤中微生物数量为2.02×108 copies·g-1, 经高锰酸钾氧化后, 在3种不同液固比条件下都骤降为105 copies·g-1, 表明高锰酸钾在氧化降解PAHs的同时也对土壤中的微生物产生了不利影响.一方面, 高锰酸钾投加会迅速改变微生物的正常生长环境, 特别是pH值和氧化还原电位, 对微生物的正常生长和代谢功能产生抑制作用.另外, 高锰酸钾还可能破坏微生物的细胞膜, 导致微生物死亡的现象[37].Sutton等[38]研究表明, 高锰酸盐处理后的土壤活菌数明显降低.经过硫酸钠氧化后的土壤中微生物数量略有上升但变化幅度不大[图 5(b)], 大部分都处在108 copies·g-1以上, 仅在液固比为7 ∶1时, 氧化时间为24 h时微生物数量降低到了7.5×108 copies·g-1.此外, 经过臭氧氧化后的土壤中微生物数量会出现先上升后下降的趋势, 除在液固比为6 ∶1, 第50 min和120 min的微生物数量为1.9×107 copies·g-1和2.9×107 copies·g-1, 其余均在108 copies·g-1以上, 变化幅度甚微.相比而言, 过硫酸钠和臭氧处理后的土壤中微生物数量变化不明显, 说明过硫酸钠和臭氧并未对土壤中微生物的生长环境造成剧烈的影响, 未造成微生物数量骤降.在泥浆体系中, 土壤颗粒可作为土著微生物的“掩体”, 免于氧化剂的毒害作用, 还有利于微生物的生长繁殖, 导致微生物数量略有上升.Medina等[39]研究表明, 尽管化学氧化可以降低微生物活性, 但影响程度有限.Liao等[30]研究也表明, 随着化学氧化剂的添加, 土壤中原生微生物的数量先减少后增加.活性过硫酸盐和芬顿试剂处理7 d后, 微生物开始呈指数增长; 而类芬顿和高锰酸钾处理的本土微生物在10 d后开始缓慢生长.
2.5 微生物多样性和群落结构变化Alpha多样性可以反映微生物群落的丰富度和多样性, 在不同液固比条件下不同氧化剂处理后微生物群落Alpha多样性指数如表 3所示.所有样品的覆盖率均达到了0.99, 说明此次测序结果覆盖了绝大多数细菌序列, 可以反映出样品中微生物群落的真实情况.以97.0%相似度为划分依据, 3种氧化剂处理后样品的OTUs在液固比6 ∶1条件下均增加.经3种氧化剂处理后, Ace和Chao1指数全部高于CK, 说明微生物群落丰富度增加.特别是在液固比为6 ∶1时, 除过硫酸钠外, 其余两种氧化剂的Ace和Chao1指数均达到最高.此外, 经高锰酸钾和过硫酸钠处理后呈现出Shannon-Wiener指数升高, Simpson指数降低, 表明微生物群落多样性升高.而臭氧处理后的样品中, Shannon-Wiener和Simpson指数与CK相比变化不大.结果表明, 高锰酸钾和过硫酸钠处理后微生物群落结构发生了演替.
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表 3 不同氧化剂处理前后微生物群落Alpha多样性指数的变化1) Table 3 Changes in bacteria α-diversity index before and after oxidation treatments |
不同氧化剂处理前后污染土壤中微生物群落结构变化如图 6所示.
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图 6 土壤微生物群落结构组成变化 Fig. 6 Changes in bacterial species at phylum, class, and genus levels |
门水平上的微生物群落结构变化见图 6(a). CK中Proteobacteria(变形菌门)占绝对优势, 相对丰度为99.5%. Chi等[40]也发现, Proteobacteria是PAHs污染土壤中的优势菌群.这些微生物相对丰度较高的原因可能是在长时间的土壤污染过程中, 污染土壤中的微生物由于基因突变而转化为PAHs降解物[41, 42], 继而在污染环境中富集[43]. 3种氧化剂处理后, Proteobacteria的相对丰度仅在高锰酸钾和过硫酸钠的个别处理组有所降低.在液固比为6 ∶1时, 高锰酸钾处理后Proteobacteria的相对丰度降至69.3%, 而Firmicutes(厚壁菌门)和Bacteroidetes(拟杆菌门)的相对丰度分别增至7.2%和9.5%.过硫酸钠处理后, 在液固比为6 ∶1和8 ∶1时, Proteobacteria的相对丰度分别降至78.4%和68.6%, 而Firmicutes和Bacteroidetes的相对丰度有所增加.Song等[44]在研究零价铁活化过硫酸钠处理PAHs污染土壤时也发现土壤中Firmicutes相对丰度显著增加.Filippidou等[45]研究也发现, Firmicutes能够在各种极端恶劣的条件下生长.Proteobacteria相对丰度的降低可能是由于相对丰度较高的微生物在氧化剂作用下被钝化导致的.
纲水平上的微生物群落结构变化见图 6(b).CK以Gammaproteobacteria(γ-变形菌纲)、Betaproteobacteria(β-变形菌纲)和Alphaproteobacteria(α-变形菌纲)为主, 总相对丰度达到了99.5%.Czarny等[46]研究发现, 重金属和PAHs复合污染是Gammaproteobacteria富集的主要诱因.经高锰酸钾处理后, 仅当液固比为6 ∶1时微生物的相对丰度变化较明显, Gamaproteobacteria的相对丰度由69.5%降至3.4%, 而Betaproteobacteria和Alphaproteobacteria的相对丰度则分别增至39.5%和25.1%; 并且Clostridia和Bacteroidia的相对丰度也分别升至5.2%和4.5%.经过硫酸钠处理后, 在液固比为8 ∶1时, Bacilli和Actinobacteria的相对丰度分别升至11.4%和7.4%.然而, 以臭氧为氧化剂时, 各实验组微生物群落相对丰度变化不明显.
属水平上微生物的群落结构变化见图 6(c).CK中Pseudomonas(假单胞菌属)、Achromobacter(无色杆菌属)和Pseudoxanthomonas(假黄色单胞菌属)为优势菌属.当高锰酸钾处理后, 液固比为6 ∶1时优势菌属Ralstonia(罗尔斯通菌属)、Phenylobacterium(假苯基杆菌属)和Sphingomonas(鞘氨醇单胞菌属)的相对丰度增加, 分别为31.2%、10.8%和6.5%, 而在液固比为7 ∶1和8 ∶1时, Achromobacter、Acinetobacter(不动杆菌属)、Rhizobium(根瘤菌属)和Massilia(马赛菌属)的相对丰度大幅升高, 特别是Acinetobacter的相对丰度分别增至27.5%和31.0%.经过硫酸钠处理后, 在液固比为6 ∶1时, Ralstonia和Phenylobacterium的相对丰度分别增至25.3%和9.1%; 在液固比为7 ∶1时, Ralstonia和Acinetobacter的相对丰度分别增至3.4%和4.3%, 其余菌属相较于原土的变化幅度不大.
然而, 以臭氧为氧化剂进行处理时, 除在液固比为8 ∶1时Acidovorax(食酸菌属)的相对丰度增至9.6%外, 其余菌属的相对丰度变化甚微.有研究表明, 土壤中微生物生理生态功能变化对于其土壤功能的恢复以及后续生物处理至关重要.土壤微生物种类的增加有助于后续生物处理, 特别是土著微生物.有研究表明, 单一氧化处理无法满足修复要求, 后续辅以生物修复是经济有效的处理方式[47].相比而言, 土著微生物是生物降解PAHs的最佳选择.因此, 土著微生物种类的增加有助于后续的生物处理.有学者从污染土壤中分离出多株PAHs降解菌株, 如Ralstonian sp. strain M1和Ralstonia sp. U2[47, 48].Jiang等[49]利用筛选的Acinetobacter降解芘和其他PAHs, Acinetobacter在PAHs和重金属共污染体系中起着至关重要的作用[45].此外, Deng等[50]分离出的Achromobacter sp. HZ01对蒽、菲和芘的去除率分别为29.8%、50.6%和38.4%. Zhang等[51]分离获得的Achromobacter denitrificans strain PheN1菌属能够完全降解菲.总体而言, 高锰酸钾和过硫酸钠氧化处理不仅能够有效降解PAHs, 也能够改变微生物群落结构.
2.6 微生物代谢功能的变化基于KEGG数据库对土著微生物的代谢功能进行了预测, Ⅰ级注释水平中功能的相对丰度最高的是代谢(metabolism, 47.7% ~49.5%), 其次是环境信息(environmental information processing, 14.5% ~18.2%)、遗传信息(genetic information processing, 14.0% ~16.5%)和未分类(unclassified, 13.7% ~14.5%).当液固比为6 ∶1时, 高锰酸钾处理样品代谢的相对丰度由CK的47.7%提高到49.5%, 过硫酸钠和臭氧处理样品代谢的相对丰度分别为49.2%和47.9%.如图 7所示, 在Ⅱ级注释水平的各类代谢途径中, 氨基酸代谢(amino acid metabolism)和碳水化合物代谢(carbohydrate metabolism)的相对丰度分别为10.4% ~10.6%和8.8% ~9.6%, 其次是能量代谢(energy metabolism, 4.9% ~5.4%)和异源有机物降解代谢(xenobiotics biodegradation and metabolism, 3.6% ~4.7%).碳水化合物代谢和其他次生代谢产物的生物合成相对丰度高于CK.
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图 7 KEGG类别中代谢途径在Ⅰ级和Ⅱ级注释水平上的相对丰度 Fig. 7 Relative abundances of the metabolic pathways in the KEGG categories at levels Ⅰ and Ⅱ |
由于生物修复一直作为化学氧化后的二次处理技术, 碳水化合物代谢和异源有机物降解代谢是PAHs生物降解过程中最重要的过程.因此, 进一步分析了Ⅲ级注释水平上碳水化合物代谢和异源有机物降解代谢的相对丰度, 结果如图 8所示.在异源有机物降解代谢中包含了PAHs降解(PAHs degradation)、萘降解(naphthalene degradation)、甲苯降解(toluene degradation)、乙苯降解(ethylbenzene degradation)和苯甲酸酯降解(benzoate degradation)这5个代谢路径, 这些代谢路径均与PAHs的生物降解直接相关[52].氧化处理后这5个路径的相对丰度均高于CK, 表明参与PAHs降解的微生物功能的相对丰度增加.PAHs的生物降解从苯环在双加氧酶的作用下裂解形成顺式二氢二醇开始, 进一步氧化为儿茶酸、原儿茶酸和龙胆酸等中间产物, 然后苯环断裂产生琥珀酸、乙酸和丙酮酸等小分子有机物质[52].碳水化合物代谢路径中, 丁酸盐、丙酮酸盐、丙酸盐、乙醛酸盐以及二羧酸盐代谢均具有较高的相对丰度, 表明氧化处理后PAHs的降解能力提高.总体而言, 高锰酸钾和过硫酸钠能够加速PAHs降解, 增加PAHs降解菌的相对丰度, 同时可以提高有机物的代谢能力.
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(a) 第一层级, (b) 第二层级 图 8 Ⅲ级注释水平上异源有机物降解代谢和碳水化合物代谢功能的相对丰度 Fig. 8 Relative abundances of xenobiotics biodegradation and metabolism and carbohydrate metabolism in the KEGG categories at level Ⅲ |
(1) 高锰酸钾和过硫酸钠在液固比为6 ∶1时对∑PAHs的去除率最高, 分别为96.9%和95.7%, 而臭氧则在液固比为8 ∶1时对∑PAHs的去除率(82.3%)最高.当使用高锰酸钾和过硫酸钠作为氧化剂时, 投加量1%(以土壤计), 液固比为6 ∶1时对∑PAHs的去除率最高, 分别为96.9%和95.7%; 当使用臭氧为氧化剂, 采用间歇曝气的方式, 每30 min内曝气10 min, 流量为72 mg·min-1, 反应2 h, 液固比为8 ∶1时对∑PAHs的去除率最高, 为82.3%.
(2) 3种氧化剂对3~4环的PAHs去除率高于5~6环PAHs, 其中菲和二氢苊的去除率较高; 对于苯并[a]芘, 仅高锰酸钾对其去除效果较好, 去除率为97.4%.
(3) 微生物数量分析表明, 焦化场地中土壤微生物数量经高锰酸钾处理后骤降, 由108 copies·g-1降至105 copies·g-1, 而过硫酸钠和臭氧处理变化不显著.
(4) 微生物群落结构和代谢功能分析表明, 原土中Proteobacteria占绝对优势, 相对丰度为99.5%, 属水平上, 仅高锰酸钾和过硫酸钠在液固比6 ∶1时发生显著变化, 微生物多样性有所增加, 多种能够降解PAHs的微生物(如Ralstonia和Acinetobacter等)相对丰度大幅提高.
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