环境科学  2023, Vol. 44 Issue (11): 6362-6376   PDF    
引用本文
肖德顺, 徐春梅, 王丹英, 陈松, 褚光, 刘元辉. 增氧模式对水稻根际微生物多样性和群落结构的影响[J]. 环境科学, 2023, 44(11): 6362-6376.
XIAO De-shun, XU Chun-mei, WANG Dan-ying, CHEN Song, CHU Guang, LIU Yuan-hui. Effects of Aeration Methods on Microbial Diversity and Community Structure in Rice Rhizosphere[J]. Environmental Science, 2023, 44(11): 6362-6376.
增氧模式对水稻根际微生物多样性和群落结构的影响
肖德顺, 徐春梅, 王丹英, 陈松, 褚光, 刘元辉     
中国水稻研究所水稻生物学国家重点实验室, 杭州 311400
收稿日期: 2022-11-29; 修订日期: 2023-01-22
基金项目: 浙江省自然科学基金项目(LY20C130009);浙江省重点研发计划项目(2022C02008);国家自然科学基金项目(31401343);国家水稻产业技术体系项目(CARS-01);中国农业科学院科技创新工程项目(ASTIP)
作者简介: 肖德顺(1998~), 男, 硕士研究生, 主要研究方向为水稻根际氧环境调控, E-mail: xiaodeshun1998@163.com
通信作者: 徐春梅, E-mail: xuchunmei@caas.cn
摘要: 为探讨不同增氧模式对水稻根际土壤微生物数量和群落结构的影响特征，以密阳46（MY）和珍汕97B（ZS）为材料，设置干湿交替（AWD）、长淹充氧（CFA）和长淹（CF）这3种根际氧处理模式，采用Illumina MiSeq高通量测序技术结合土壤理化性质，分析不同氧环境下水稻根际土壤细菌和真菌群落多样性特征及其与土壤理化因子的关系.结果表明，水稻根际土壤中细菌优势菌群为绿弯菌门（Chloroflexi）、放线菌门（Actinobacteriota）、酸杆菌门（Acidobacteriota）、变形菌门（Proteobacteria）和厚壁菌门（Firmicutes）；真菌优势菌群为子囊菌门（Ascomycota）和担子菌门（Basidiomycota）.不同增氧模式下水稻根际土壤微生物群落组成存在明显差异.各生育期，Chloroflexi和Acidobacteriota在AWD处理时，Actinobacteriota在CFA处理时的相对丰度高于其他处理；Firmicutes在AWD处理下相对丰度低于其他处理.增氧影响根际微生物物种多样性和丰富度.如AWD处理显著增加细菌物种多样性，降低其丰富度；AWD和CFA处理后真菌物种多样性和丰富度均显著增加.土壤理化性质也受增氧模式的影响.不同处理土壤氧化还原电位（Eh）大小表现为：AWD>CFA>CF，处理间差异达显著水平；与CF处理相比，增氧处理（AWD和CFA）显著增加根际土壤NO3--N含量，降低NH4+-N含量.相关性分析表明，根际土壤pH和Eh与细菌物种多样性正相关，与丰富度负相关；与真菌物种多样性和丰富度正相关.冗余分析发现，全生育期的Chloroflexi相对丰度与pH和NH4+-N均呈正相关；分蘖期和齐穗期的Chloroflexi相对丰度与Eh和NO3--N呈正相关，成熟期则负相关.pH和Eh与Acidobacteriota、Proteobacteria和Basidiomycota相对丰度正相关，与Firmicutes和Ascomycota相对丰度负相关.Ascomycota相对丰度与NO3--N负相关，与NH4+-N正相关，Basidiomycota与之相反.综上，增氧模式改善根际土壤氧环境，改变土壤理化性质，影响微生物群落多样性和丰富度，从而优化微生物群落结构.
关键词: 增氧模式      根际土壤      微生物多样性      微生物群落结构      冗余分析     
Effects of Aeration Methods on Microbial Diversity and Community Structure in Rice Rhizosphere
XIAO De-shun , XU Chun-mei , WANG Dan-ying , CHEN Song , CHU Guang , LIU Yuan-hui     
State Key Laboratory of Rice Biology, China National Rice Research Institute, Hangzhou 311400, China
Abstract: To explore the effects of different aeration methods on the abundance of microorganisms and microorganism community structure in rice rhizosphere soil, two rice varieties, Miyang 46(MY) and Zhenshan 97B(ZS), were used with three aeration treatments: alternate wetting and drying(AWD), continuous flooding and aeration(CFA), and continuous flooding(CF). The diversity of bacterial and fungal communities in rice rhizosphere soil was analyzed using Illumina MiSeq high-throughput sequencing. Soil physical and chemical factors were also analyzed. The results showed that the dominant bacterial communities in rice rhizosphere soil were Chloroflexi, Actinobaciota, Acidobacteria, Proteobacteria, and Firmicutes, and the dominant fungal communities were Ascomycota and Basidiomycota in rice rhizosphere soil. At each growth stage, the relative abundance of Chloroflexi and Acidobacteria was higher in the AWD treatment than in the other treatments, and the relative abundance of Actinobaciota was higher in the CFA treatment than in the other treatments. The relative abundance of Firmicutes was lower in the AWD treatment than in the other treatments. Aeration methods affected the diversity and richness of rhizosphere microbial species. For example, the diversity of bacterial species was higher, and the richness of bacterial species was lower in the AWD treatment than that in the other treatments. The diversity and richness of fungal species were higher in the AWD and CFA treatments than those in the CF treatment. The physical and chemical properties of rhizosphere soil were also affected by aeration method. The soil redox potential(Eh) was the highest in AWD, followed by that in CFA and CF, and significant differences were observed among treatments. The NO3--N content was significantly higher, and the NH4+-N content was significantly lower in the AWD and CFA treatments than in the CF treatment in rhizosphere soil at all growth stages. Correlation analysis showed that the pH and Eh of rhizosphere soil were positively correlated with the diversity of bacterial species, negatively correlated with the richness of bacterial species, and positively correlated with the diversity and richness of fungal species. Redundancy analysis indicated that the relative abundance of Chloroflexi was positively correlated with the pH and NH4+-N content at each period, positively correlated with the Eh and NO3--N content at the tillering and heading stages, and negatively correlated with Eh and NO3--N content at the maturity stage. At each growth stage, the pH and Eh were positively correlated with the relative abundance of Acidobacteria, Proteobacteria, and Basidiomycota and negatively correlated with the relative abundance of Firmicutes and Ascomycota. During the entire growth period, the relative abundance of Ascomycota was negatively correlated with the NO3--N content and positively correlated with the NH4+-N content, and the opposite patterns were observed for the relative abundance of Basidiomycota. In summary, rhizosphere oxygenation enhanced the soil oxygen environment, altered soil physical and chemical properties, and affected microbial community diversity and richness to optimize microbial community structure.
Key words: aeration methods      rhizosphere soil      microbial diversity      microbial community structure      redundancy analysis     

微生物是土壤中重要的分解者, 其在土壤-植物系统作为生源要素迁移转化的重要引擎, 与土壤中有机质分解积累, 营养循环转化密切相关[1].微生物多样性和群落结构, 直接或间接参与水稻生长发育、病虫害防治等活动, 是不可忽视的重要因子[2, 3].根际作为微生物活动的活跃区域, 由于“根际效应”的存在, 使得根际微生物数量远高于一般非根际土壤[4, 5].根际土壤与水稻根系接触紧密, 根际微生物的活动对水稻养分吸收利用的影响更为密切.前人研究表明根际微生物和植物之间存在复杂的相互协同系统, 植物在生长过程中会释放有机酸、糖等根系分泌物, 影响微生物群落构建, 微生物则利用根系分泌物进行氮素循环、磷动员等各类活动, 并释放土壤中的营养物质提供给植株, 影响植株生长[6~8].

水稻由于长期处于淹水环境, 易形成低氧胁迫, 造成根系损伤, 影响生长发育[9, 10].越来越来多的学者开始关注水稻根际氧环境.有研究表明通过干湿交替和机械增氧等方式能显著增加土壤氧气扩散速率, 改善土壤氧环境, 有利于水稻生长, 提高产量[11, 12].而微生物群落同样与土壤氧环境密切相关.根据微生物需氧特性可分为好氧、厌氧和兼性微生物, 氧环境的变化会直接影响微生物群落多样性和群落结构.前人研究表明, 土壤理化性质作为影响微生物群落多样性和结构的重要因子同样受氧环境的影响, 增氧会改变pH、氧化还原电位(Eh)、铵态氮和硝态氮等土壤理化性质[12~14].目前学者们多聚焦于增氧模式对水稻根系建成、根系功能以及产量形成的影响, 对微生物的影响则侧重于硝化、反硝化和固氮作用等, 关于增氧模式对水稻根际土壤微生物多样性和群落结构的影响关注较少[15~18].而根际微生物作为土壤中最活跃的组分之一, 探明增氧模式对根际微生物种类和群落构成的影响, 对研究不同增氧模式下养分循环利用具有重要作用[19].因此, 本文采用干湿交替、长淹增氧和长淹灌溉这3种增氧模式, 利用Illumina MiSeq高通量测序技术, 研究不同增氧方式对水稻根际土壤细菌和真菌多样性的变化差异, 探索其对水稻根际土壤主要优势细菌和真菌群落结构和多样性的影响, 以期为阐明不同增氧模式对稻田土壤微生物多样性的形成机制提供科学依据.

1 材料与方法 1.1 试验地点

本试验于2021年6~9月在中国水稻研究所大棚(30°04′N, 119°56′E)进行, 供试水稻品种为密阳46(MY)和珍汕97B(ZS).

1.2 试验设计

采用土培试验, 土培池为2.00 m长×0.60 m深×1.00 m宽, 其土壤基本理化性质见表 1.设置3种增氧模式：①干湿交替处理(AWD), 自浅水层自然落干至低于土表10 cm, 灌3~5 cm水层, 落干灌水, 如此反复; ②长淹增氧处理(CFA), 始终保持3~5 cm水层, 在土培池中埋入增氧管, 利用增氧泵向土培池中定时供氧, 每2 h供氧10 min; ③长淹处理(CF), 始终保持3~5 cm水层.每个处理设置3次重复.

表 1 土壤基本理化性质 Table 1 Physiochemical properties of soil

1.3 测定项目与方法 1.3.1 样本采集

于分蘖期、齐穗期和成熟期参照陈云等[20]方法采集根际土.新鲜土样过2 mm筛后将样品分为两份, 一份用于土壤理化性质的测定, 另一份放入-20℃冰箱中用于微生物测定.

1.3.2 DNA提取、PCR扩增和Illumina MiSeq测序

根据E.Z.N.A.Ⓡ soil DNA kit(Omega Bio-tek, Norcross, GA, U.S.)说明书进行微生物群落总基因组DNA抽提, 使用1%的琼脂糖凝胶电泳检测抽提的基因组DNA, 使用NanoDrop2000(美国Thermo Scientific公司)测定DNA浓度和纯度.

分别采用细菌引物338F(5′-ACTCCTACGGG AGGCAGCAG-3′)/806R(5′-GGACTACHVGGGTW TCTAAT-3′)和真菌引物ITS1F(5′-CTTGGTCAT TTAGAGGAAGTAA-3′)/ITS2R(5′-GCTGCGTTCT TCATCGATGC-3′)进行PCR扩增.所有引物均委托上海美吉生物医药科技有限公司合成.采用Pro Taq, 20 μL反应体系：2×Pro Taq 10 μL, Forward Primer(5 μmol·L-1) 0.8 μL, Reverse Primer(5 μmol·L-1) 0.8 μL, Template DNA 10 ng·μL-1, 加ddH2O补足20 μL. PCR扩增程序：95℃预变性3 min; 95℃变性30 s, 55℃退火30 s, 72℃延伸30 s, 27个循环; 72℃再延伸10 min.将同一样本的PCR产物混合后使用2%琼脂糖凝胶回收PCR产物, 利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit(Axygen Biosciences, Union City, CA, USA) 进行回收产物纯化, 2%琼脂糖凝胶电泳检测, 并用QuantusTM Fluorometer(Promega, USA) 对回收产物进行检测定量.利用Illumina公司的MiSeq PE300/NovaSeq PE250平台进行测序(上海美吉生物医药科技有限公司).

1.3.3 高通量测序数据分析

使用Fastp(https://github.com/OpenGene/fastp, version 0.19.6)软件对双端原始测序序列进行质控, 使用FLASH(http://www.cbcb.umd.edu/software/flash, version 1.2.11)软件进行拼接, UPARS软件(http://drive5.com/uparse/, version 7.1), 根据97%的相似度对质控拼接后的序列进行操作分类单元OTU(operational taxonomic unit) 聚类并剔除嵌合体.为了尽量减少测序深度对后续α多样性和β多样性数据分析的影响, 按照最小样本序列数进行抽平, 利用RDP classifier(http://rdp.cme.msu.edu/, version 2.11) 比对Silva 138数据库(http://www.arbilva.de)和Unite 8.0数据库(http://unite.ut.ee/index.php)进行细菌和真菌OTU物种分类学注释, 置信阈值为70%.并在门、属分类水平上统计各土壤样品中微生物群落组成.

1.3.4 土壤理化性质的测定

测定氧化还原电位(Eh)、土壤pH、土壤硝态氮(NO3--N)和铵态氮(NH4+-N), 方法见文献[12, 13].

1.3.5 数据分析

采用Excel 2016和SAS 9.4软件对数据进行统计分析.采用单因素(one-way ANOVA)和Duncan法进行方差分析和多重比较(α=0.05), 用Pearson法进行相关分析.采用美吉生物云平台(https://cloud.majorbio.com), 用Adobe Illustrator CS6和Excel 2019制图.

2 结果与分析 2.1 微生物组成分析

分蘖期、齐穗期和成熟期土壤细菌在按照最小样本序列数进行抽平后, 分别归属于62、66和66个门类.由图 1可知, 不同水稻品种不同处理下根际土壤细菌群落相对丰度在门水平上存在差异.各生育期, Chloroflexi和Acidobacteriota在AWD处理时, Actinobacteriota在CFA处理时, 相对丰度高于其他处理; Firmicutes在AWD处理时相对丰度低于其他处理.

(a)分蘖期细菌, (b)齐穗期细菌, (c)成熟期细菌, (d)分蘖期真菌, (f)齐穗期真菌, (e)成熟期真菌; MY：密阳46, ZS：珍汕97B; AWD：干湿交替, CFA：长淹充氧, CF：长淹; 物种相对丰度＜1%归入others 图 1 不同生育期水稻根际土壤微生物群落相对丰度 Fig. 1 Relative abundance of microbial community in rice rhizosphere soil at different growth stage

真菌在按照最小样本序列数进行抽平后分别归属于17、17和16个门类.水稻主要生育期相对丰度始终位于前3的分别为Ascomycota、未分类真菌(unclassified_k__Fungi)和Basidiomycota.分蘖期, CF处理时, Ascomycota相对丰度高于AWD处理, Basidiomycota与其相反.齐穗期和成熟期两供试品种Ascomycota相对丰度在不同处理下趋势一致, 大小表现为：CF＞CFA＞AWD, 而unclassified_k__Fungi和Basidiomycota与Ascomycota表现相反, 大小表现为：AWD＞CFA＞CF.

根据群落相对丰度前40的细菌属和真菌属绘制不同生育期Heatmap图并进行层次聚类(图 2), 发现不同处理下根际土壤中细菌和真菌群落具有明显差异.根据第一层级可将不同时期6个处理的细菌群落分为2类：干湿交替类(AWD处理)和长淹类(CFA、CF处理); 将真菌群落分为2类: 长淹类(CF处理)和增氧类(AWD和CFA处理).根据第二层级可以将分蘖期、齐穗期和成熟期细菌和真菌群落统一分为3类：干湿交替类(MY-AWD、ZS-AWD)、长淹充氧类(MY-CFA、ZS-CFA)和长淹类(MY-CF、ZS-CF).

(a)分蘖期细菌, (b)齐穗期细菌, (c)成熟期细菌, (d)分蘖期真菌, (e)齐穗期真菌, (f)成熟期真菌; a1.ZS-AWD, a2.MY-AWD, a3.ZS-CF, a4.MY-CF, a5.MY-CFA, a6.ZS-CFA, b1.MY-AWD, b2.ZS-AWD, b3.ZS-CF, b4.MY-CF, b5.MY-CFA, b6.ZS-CFA, c1.ZS-AWD, c2.MY-AWD, c3.MY-CF, c4.ZS-CF, c5.MY-CFA, c6.ZS-CFA, d1.ZS-CF, d2.MY-CF, d3.ZS-AWD, d4.MY-AWD, d5.MY-CFA, d6.ZS-CFA, e1.ZS-CF, e2.MY-CF, e3.MY-CFA, e4.ZS-CFA, e5.MY-AWD, e6.ZS-AWD, f1.MY-CF, f2.ZS-CF, f3.ZS-CFA, f4.MY-CFA, f5.ZS-AWD, f6.MY-AWD 图 2 属水平上各生育期水稻根际土壤细菌和真菌群落热图 Fig. 2 Heat map of bacterial and fungal communities in rhizosphere soil of rice on genus level at each growth stage

2.2 微生物多样性分析

生育期、水稻品种和处理均显著影响微生物多样性和丰富度(表 2和表 3).不同生育期各处理Coverage指数均在95%以上, 表明测序量足以反映样本土壤中微生物群落的真实情况.从Shannon和Simpson指数来看, 增氧模式显著影响根际土壤物种多样性.对于细菌群落(表 2), 分蘖期CFA处理下物种多样性显著低于其他处理, 而齐穗期和成熟期AWD处理Simpson指数显著低于CFA和CF处理; 对于真菌群落(表 3), 物种多样性大小表现为：AWD＞CFA＞CF, 且各处理间差异达显著水平.

表 2 不同生育期根际土壤细菌多样性指数1) Table 2 Bacterial diversity index of rhizosphere soil at different growth stages

表 3 不同生育期根际土壤真菌多样性指数1) Table 3 Fungal diversity index of rhizosphere soil at different growth stages

从ACE、Chao1和Sobs指数综合来看, 根际土壤细菌丰富度同样受增氧模式影响(表 2).分蘖期, CFA处理下, 密阳46根际土细菌群落丰富度显著低于其他处理; 珍汕97B根际土壤中CFA和CF处理间无显著差异, 但均显著高于AWD; 齐穗期, 不同水稻品种根际土壤细菌丰富度指数大小变化趋势为: CF＞CFA＞AWD, 密阳46各处理间达显著水平; 成熟期, 两品种CFA处理下细菌丰富度最高.对真菌群落而言(表 3), 分蘖期和成熟期增氧处理(AWD和CFA)丰富度高于CF处理, 且处理间差异达显著水平.

2.3 微生物差异分析

对不同增氧模式下各生育期水稻根际土壤细菌和真菌分别在门和属水平上采用Kruskal-Wallis秩和检验进行组间差异性检验(图 3), 图中显示具有显著差异且相对丰度为前10的物种.结果表明, 各生育期各处理根际土壤细菌在门水平上具有显著差异的为Actinobacteriota、Acidobacteriota、Proteobacteria、疣微菌门(Verrucomicrobiota)和Methylomirabilota; 在属水平相对丰度具有显著差异的为Gaiella、Marmoricola、诺卡氏菌属(Nocardioides)、norank_ f__norank_o__Vicinamibacterales.分蘖期, 链霉菌属(Streptomyces)、norank_ f__Sporichthyaceae 、unclassified_f__Intrasporangiaceae和norank_ f__norank_o__norank_c__MB-A2-108相对丰度在组间存在显著差异; 齐穗期, norank_ f__norank_o__RBG-13-54-9和norank_ f__norank_o__norank_c__KD4-96相对丰度在组间存在显著差异; 成熟期厌氧黏细菌属(Anaeromyxobacter)和norank_ f__norank_o__SBR1031相对丰度在组间存在显著差异.

(a)分蘖期门水平, (b)齐穗期门水平, (c)成熟期门水平, (d)分蘖期属水平, (e)齐穗期属水平, (f)成熟期属水平; MY：密阳46, ZS：珍汕97B, AWD：干湿交替, CFA：长淹充氧, CF：长淹; *表示P < 0.05, **表示P < 0.01 图 3 各生育期水稻根际土壤细菌组间差异性检验 Fig. 3 Difference test of bacterial communities in rhizosphere soil of rice at each growth stage

不同生育期各处理下真菌在门水平和属水平上组间物种差异性检验见图 4.分蘖期, 真菌在门水平上各处理间均具有显著差异的为Aphelidiomycota、芽枝霉菌门(Blastocladiomycota)和球囊菌门(Glomeromycota); 属水平上组间差异物种主要是Collarina、Acremonium、蓝状菌属(Talaromyces)、翅孢壳属(Emericellopsis)和假散囊菌属(Pseudeurotium).齐穗期和成熟期, 各处理间真菌门水平上差异物种增加, 主要为被孢毛霉菌门(Mortierellomycota)、Basidiomycota、Blastocladiomycota、壶菌门(Chytridiomycota)、类原生动物门(Rozellomycota)、unclassified_k__Fungi和Ascomycota; 属水平主要为unclassified_o__Glomerellales、unclassified_c__Agaricomycetes、unclassified_p__Rozellomycota、Cladosporium、unclassified_c__Sordariomycetes、unclassified_k__Fungi和Pseudeurotium.

(a)分蘖期门水平, (b)齐穗期门水平, (c)成熟期门水平, (d)分蘖期属水平, (e)齐穗期属水平, (f)成熟期属水平; MY：密阳46, ZS：珍汕97B; AWD：干湿交替, CFA：长淹充氧, CF：长淹; *表示P < 0.05, **表示P < 0.01 图 4 各生育期水稻根际土壤真菌组间差异性检验 Fig. 4 Difference test of fungal communities in rhizosphere soil of rice at each growth stage

2.4 微生物群落与土壤理化性质的相关性

由表 4可知, 水稻品种、生育期和增氧方式均影响根际土壤理化性质.除密阳46齐穗期外, 处理间pH值大小均为：AWD＞CFA＞CF, 且珍汕97B处理间差异均达显著水平.整个生育期, 两供试品种根际土壤氧化还原电位(Eh)以AWD处理最大, CF处理最低.NO3--N含量, 除珍汕97B CF处理随生育期持续而降低, 其余处理大小表现为：齐穗期＞分蘖期＞成熟期.AWD和CFA处理NO3--N含量高于CF处理, 除珍汕97B成熟期外, 其余时期处理间差异达显著水平.NH4+-N含量, 不同生育期各处理大小为：CFA＜AWD＜CF, 除珍汕97B CFA处理随生育期持续而降低, 其余处理大小表现为：齐穗期＞分蘖期＞成熟期.

表 4 不同生育期土壤理化性质1) Table 4 Soil chemical properties at different rice growth stages

土壤理化性质与细菌和真菌物种多样性和丰富度相关性在不同时期具有差异(图 5).齐穗期和成熟期, 两供试品种根际土壤细菌物种多样性与pH显著正相关(P＜0.05); 珍汕97B齐穗期和成熟期, 细菌物种多样性与Eh显著正相关(P＜0.05).分蘖期, 根际土壤细菌物种多样性与NO3--N负相关, 与NH4+-N正相关; 齐穗期和成熟期, 与NO3--N显著正相关(P＜0.05); 成熟期, 与NH4+-N负相关.珍汕97B分蘖期、两品种齐穗期以及密阳46成熟期, 根际土壤细菌群落丰富度与pH、Eh负相关, 相关性达显著水平(P＜0.05).除珍汕97B成熟期外, 根际土壤细菌群落丰富度与NO3--N负相关, 与NH4+-N正相关.整个生育期, 根际土壤真菌群落物种多样性和丰富度与pH、Eh和NO3--N正相关, 成熟期相关性达显著水平; 与NH4+-N相关性, 除齐穗期珍汕97B真菌群落丰富度负相关外, 其余均正相关.

1.pH, 2.Eh, 3.NO3--N, 4.NH4+-N, a.细菌Shannon指数, b.细菌Simpson指数, c.细菌ACE指数, d.细菌Chao 1指数, e.细菌Sobs指数, f.真菌Shannon指数, g.真菌Simpson指数, h.真菌ACE指数, i.真菌Chao 1指数, j.真菌Sobs指数; MY：密阳46, ZS：珍汕97B; 红色表示正相关, 蓝色表示负相关; *表示P < 0.05, **表示P < 0.01 图 5 不同生育期微生物群落指标与土壤理化性质相关性分析 Fig. 5 Correlation between microbial communities and soil properties at different rice growth stages

由不同时期微生物和土壤理化性质冗余分析可知(图 6), RDA1和RDA2两个成分在分蘖期、齐穗期和成熟期细菌群落占比之和分别是66.0%、59.8%和77.3%, 真菌群落占比之和分别是14.4%, 66.5%和82.1%.分蘖期, pH、Eh和NO3--N与细菌群落结构显著相关(P＜0.05), 真菌群落结构仅与pH显著相关(P＜0.05).齐穗期, pH、Eh和NO3--N与细菌群落结构显著相关(P＜0.05); 真菌群落结构除与这3个因素呈显著相关外, 还与NH4+-N呈显著相关(P＜0.05); 成熟期, 真菌和细菌群落结构与pH、Eh、NO3--N以及NH4+-N均显著相关(P＜0.05).细菌和真菌优势物种与土壤理化性质密切相关(图 6), 且不同物种在不同生育期与土壤理化因子的相关性不同.Chloroflexi相对丰度与pH和NH4+-N均呈正相关; 与Eh和NO3--N在分蘖期、齐穗期呈正相关, 成熟期呈负相关.Actinobacteriota相对丰度与pH呈负相关; 与NH4+-N相关; 与Eh和NO3--N含量在分蘖期呈正相关, 在齐穗期和成熟期呈负相关.Acidobacteriota相对丰度与pH和Eh呈正相关; 与NO3--N在分蘖期和齐穗期负相关, 成熟期正相关; 与各生育期NH4+-N负相关.Proteobacteria相对丰度与pH和Eh均呈正相关; 与NO3--N含量在分蘖期负相关, 在齐穗期和成熟期正相关; 与NH4+-N全生育期负相关.各生育期, Firmicutes和Ascomycota相对丰度与pH、Eh和NO3--N负相关, 与NH4+-N正相关; Basidiomycota相对丰度与pH、Eh和NO3--N正相关, 与NH4+-N负相关.

(a)分蘖期细菌, (b)齐穗期细菌, (c)成熟期细菌, (d)分蘖期真菌, (f)齐穗期真菌, (e)成熟期真菌; MY：密阳46, ZS：珍汕97B, AWD：干湿交替, CFA：长淹充氧, CF：长淹; 蓝色箭头表示物种, 红色箭头表示土壤理化性质, 红色箭头的长短表示土壤理化性质对于物种数据影响程度的大小; 红色箭头间的夹角为锐角表示正相关, 为钝角表示负相关, 直角表示无相关性; 从样品点红色箭头做投影, 投影点至原点的距离表示土壤理化性质对样本群落分布相对影响的大小 图 6 门水平上不同时期细菌和真菌及土壤理化性质冗余分析 Fig. 6 Redundancy analysis of bacteria, fungi and soil chemical properties on the phylum level at different rice growth stages

2.5 增氧模式对水稻产量的影响

增氧模式显著影响水稻单株产量、有效分蘖、每穗重和结实率(表 5).AWD和CFA处理下水稻单株产量、有效分蘖数、每穗重和结实率均高于CF处理.与CF处理相比, 密阳46 AWD处理下结实率增加6.03%, CFA处理下每穗重增加5.51%, 处理间差异达显著水平; 珍汕97B AWD处理和CFA处理下单株产量分别增加18.86%和19.35%, 结实率分别增加19.80%和18.07%, 处理间差异达显著水平.

表 5 增氧模式对水稻产量构成因子的影响1) Table 5 Effect of aeration methods on the yield components of rice

3 讨论 3.1 增氧模式对土壤理化性质和水稻产量的影响

水稻特殊的生长习性使得其生育期大部分处于淹水环境, 而稻田长期淹水会造成根际氧含量降低, 易形成低氧胁迫, 对水稻生长发育构成严重威胁[9, 10].有研究发现[11], 不同增氧方式根际土壤氧气扩散率存在明显差异, AWD和CFA处理根际土壤氧气扩散率明显高于CF处理, 说明本试验不同增氧模式的试验设计合理.Eh与土壤通气状况密切相关, 土壤通气性越好, Eh越高.本试验增氧处理(AWD和CFA)后根际土壤通气状况明显改善, 使得根际土壤Eh显著增加, 同时提高了根际土壤pH(表 4).pH是重要土壤性质, 影响土壤营养元素有效性、有机质分解和微生物活动[21].Eh和pH的增加, 有利于水稻土碳氮矿化, 影响土壤无机氮含量和微生物群落结构及组成[11, 22~24].NO3--N和NH4+-N作为重要营养物质, 不仅反映土壤肥力, 还影响微生物生长并受到微生物活动的影响[25, 26].改善根际氧环境, 增加土壤氨氧化细菌(AOB)的丰度, 增强硝化作用, 抑制反硝化作用, 促进NH4+-N向NO3--N的转化[27, 28].本试验中增氧处理(AWD和CFA)后NO3--N含量增加, NH4+-N含量降低, 正是由于增氧后硝化作用增强所致.增氧模式影响土壤理化性质, 同时也影响水稻产量(表 5).两供试品种增氧处理(AWD和CFA处理)单株产量均高于CF处理, 其主要原因是有效分蘖的增加和结实率的提高.

3.2 增氧模式对根际微生物群落多样性的影响

土壤微生物对栽培方式敏感, 栽培方式的改变对土壤形成不同程度的扰动, 在影响土壤微域环境的同时, 会引起土壤微生物群落和功能多样性变化[29].微生物物种多样性和丰富度指数是反映微生物群落特征的常用指标, 多样性指数反映土壤中生物多样性的多寡, 丰富度表示土壤中物种的总数[19].根据层级聚类分析将细菌群落分为干湿交替类(AWD)和长淹类(CFA和CF处理), 将真菌群落分为长淹类(CF处理)和增氧类(AWD和CFA处理)(图 2).细菌和真菌物种多样性和丰富度指数变化与层级聚类结果相吻合.整个生育期, 干湿交替类(AWD)处理与长淹类处理(CFA和CF)相比, 增加了细菌群落物种多样性, 降低其丰富度(表 2); 增氧处理(AWD和CFA)增加真菌物种多样性和丰富度(表 3).长淹类处理细菌群落结构更为相似, 增氧类处理真菌群落更为相似, 其原因是细菌和真菌群落结构对外界环境的响应具有差异所致.AWD处理是土壤浅水层自然落干后再复水的交替过程, 土壤含水率发生变化, 土壤孔隙度改变, 提高了土壤通气性; CFA处理则保持土壤浅水层, 利用预埋增氧管, 定时通气改善氧环境, 不改变土壤含水率.AWD处理和CFA处理相比, 在改善根际土壤氧环境的同时会造成水分胁迫.对于细菌群落而言, 增氧处理(AWD和CFA)增加其物种多样性, 但AWD处理伴随土壤水分变化, 细菌群落同时受到水分胁迫的影响, 使得干湿交替类(AWD)处理与长淹类(CFA和CF处理)具有明显差异.其原因是细菌对于土壤水分变化敏感, 水分减少增加细菌物种多样性[30]; 而真菌对于水分变化适应性强[31], 氧环境变化对其影响大于水分变化, 因此两种增氧模式(AWD和CFA处理)在真菌群落层级聚类中被划分到一类.

土壤理化性质是影响微生物群落的重要因子[32].细菌和真菌物种多样性和丰富度受土壤理化性质的影响, pH与根际土壤细菌群落丰富度负相关, 与真菌群落物种多样性和丰富度正相关; NH4+-N含量与细菌和真菌丰富度正相关[33].本研究发现pH、Eh、NO3--N和NH4+-N含量与细菌和真菌群落丰富度在多个时期相关性均达显著水平, 且土壤理化性质与细菌和真菌物种多样性和丰富度相关性在2个供试品种间以及不同生育期间存在差异(图 5).分蘖期, pH与密阳46细菌群落丰富度正相关, 与珍汕97B细菌群落丰富度负相关.分蘖期和齐穗期, 珍汕97B细菌群落丰富度与Eh和NO3--N负相关, 与NH4+-N正相关; 成熟期与分蘖期和齐穗期相反.表 2和表 3方差分析表明水稻品种和生育期与微生物多样性和丰富度指数显著相关, 说明水稻品种和生育期是影响根际微生物的重要因子[30].与细菌相比, 真菌物种多样性和丰富度与土壤理化性质相关性在两供试品种和生育期间表现较一致, 这是由于根际土壤真菌群落相对稳定, 而细菌群落结构更多样和活跃, 易受土壤类型和植株的影响所致[4, 5].

3.3 增氧模式对根际微生物群落结构的影响

增氧模式影响根际土壤细菌和真菌优势菌群.本试验中细菌Chloroflexi、Actinobacteriota、Acidobacteriota、Proteobacteria和Firmicutes在根际土壤中优势明显, 在不同生育期相对丰度始终位于前5, 真菌以Ascomycota、Basidiomycota为优势物种(图 1).依据细菌和真菌差异性检验(图 3和图 4), 发现不同氧处理显著影响根际土壤中优势物种的丰度, 而优势物种在细菌和真菌群落中占比大, 是群落组成的重要群体, 因此笔者认为细菌和真菌优势物种在不同处理下丰度的变化可能是造成物种群落出现差异的主要原因之一.结合不同时期微生物和土壤理化性质的冗余分析(图 6), 发现细菌和真菌优势物种与环境因子pH、Eh、NH4+-N和NO3--N显著相关.说明增氧方式改变土壤理化性质, 影响根际细菌和真菌群落丰富度, 改变细菌和真菌优势物种相对丰度.层级聚类能清楚区分各处理间细菌和真菌群落, 这表明增氧处理改变细菌和真菌群落结构.

土壤微生物群落组成和变化直接或间接影响土壤养分循环[34].如微生物对秸秆的分解和养分的释放[7]; 氮素固定、硝化、反硝化过程中微生物的作用; 微生物对土壤中磷素的活化等[8].而根际土壤与水稻根系接触紧密, 根际微生物的活动对水稻养分吸收利用的影响更为密切.Chloroflexi是一类参与碳氮硫元素循环、功能丰富的微生物, 能将纤维素分解为葡萄糖, 也能将糖和多糖转化成有机酸和氢气, 是稻田多糖降解的主要细菌, 且在Chloroflexi中发现具有以亚硝酸盐为能源的好氧亚硝酸氧化菌[35].本试验中AWD处理下Chloroflexi相对丰度高于其他处理, 且在分蘖期和齐穗期与NO3--N含量正相关, 这表明增氧促进稻田多糖降解, 有利于硝化细菌生长[7, 34].Acidobacteriota在氮循环中发挥着重要作用, 是土壤脲酶的主要来源, 能促进土壤可溶解性有机氮的转化, 并降低土壤中硝酸盐和亚硝酸盐含量[36, 37]. Ahn等[38]指出Actinobacteriota所属菌Marmoricola和Nocardioides等是嗜氧或微嗜氧菌, 与氧区有机质的降解密切相关.细菌属水平组间差异性检验(图 3)结果表明, 各生育期根际土壤中Marmoricola和Nocardioides相对丰度在CFA处理下高于AWD处理.笔者认为这是由于这两种增氧模式具有差异所致.AWD处理在改善氧环境的同时降低土壤水分, 对微生物造成水分胁迫, 这表明合适的增氧措施有利于有机质降解微生物的增加. Proteobacteria包含大量与硝化作用相关的功能菌, 常将氧、亚硝酸盐、硝酸盐、硫酸盐或铁(Ⅲ)作为电子受体[38].晁红军等[39]指出甲基和甲烷营养菌多从属于Proteobacteria, 能够利用甲基和甲烷作为营养源.本研究中齐穗期和成熟期AWD处理后Proteobacteria相对丰度高于其他处理.这说明增氧有利于甲烷的氧化, 减少温室气体的排放[40~42].并且Jiang等[43]研究表明Proteobacteria与稻田N2O排放密切相关, 随着其丰度增加稻田N2O的排放量降低.Anaeromyxobacter是稻田硝酸盐异化还原成铵细菌群落组成中的关键菌属, 与铁还原有关[18, 44, 45].长淹环境下土壤氧化还原电位有利于三价铁的还原[46].本文中成熟期长淹类(CFA和CF)处理下Anaeromyxobacter相对丰度高于其他处理, 进一步说明长淹环境会影响硝酸盐异化以及土壤铁还原.Firmicutes是稻田前期植物聚合物厌氧降解的主要参与者, 低氧环境中其相对丰度高[47].如本试验中分蘖期和齐穗期Firmicutes在CF处理下相对丰度高于AWD(图 3).真菌Ascomycota和Basidiomycota均具有分解纤维素和半纤维素的能力[48], 但两者对根际氧环境的反应不同.与CF处理相比, 增氧处理降低Ascomycota, 增加Basidiomycota相对丰度.根据冗余分析, 两者与土壤理化性质相关性同样表现相反, 这可能是由于增氧处理(AWD和CFA)下土壤理化性质改变所致.与CF相比, 增氧模式(AWD和CFA)改善土壤氧环境, 改变土壤理化性质, 影响细菌和真菌优势物种丰度, 改变微生物群落结构及其功能.

4 结论

水稻根际增氧(AWD和CFA)改变土壤理化性质, 增加根际土壤Eh、pH和NO3--N含量, 降低NH4+-N含量; 降低细菌丰富度, 显著增加根际真菌的多样性和丰富度, 改变微生物的群落结构, 与长淹处理(CF)具有显著差异且易于区分.相关分析和冗余分析表明, pH、Eh、NO3--N和NH4+-N与细菌和真菌物种多样性、丰富度和优势物种丰度显著相关, 是影响群落结构的重要因子.本研究结果可为探索增氧栽培新措施改变稻田微生物多样性提供理论依据.

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