2023, Vol. 44
2. 河海大学浅水湖泊综合治理与资源开发教育部重点实验室, 南京 210098
2. Ministry of Education Key Laboratory of Integrated Regulation and Resource Development on Shallow Lakes, Hohai University, Nanjing 210098, China
塑料制品因其价廉、质轻和耐用等优点在日常生活中广泛应用.目前全球塑料产量每年超过3亿t[1], 预计到2060年左右, 环境中的塑料堆积量将达到1.55~2.65亿t[2].以上塑料在生产、应用和处置过程中, 会通过物理、化学和生物降解作用分解成细小颗粒和碎片[3], 通常将直径小于5 mm的塑料颗粒定义为微塑料(microplastics, MPs)[4].MPs作为新兴污染物, 在海洋、淡水、沉积物、土壤和大气沉降物中广泛存在[5], 其中, 由聚苯乙烯(polystyrene, PS)形成的MPs是最为常见的类型之一[6].我国江河流域微塑料污染严重, 且与人口密度和人类活动的增加密切相关[7].有研究表明, MPs长期存在水环境中会对生活在其中的水生生物产生毒性作用, 包括抑制生长发育、引起代谢紊乱和诱导氧化应激反应并最终导致死亡[8].因此MPs排放到水环境中造成的潜在生态风险引起了广泛关注.
在水环境中细菌常形成生物膜以减少自身受外界环境变化产生的影响[9].生物膜在一系列物理、化学和生物作用下会产生孔隙、通道和蘑菇状突起类复杂的三维结构变化[10].胞外聚合物(extracellular polymeric substances, EPS)作为生物膜的主要部分[11], 能够促进微生物聚集并粘附到基质表面实现生物膜的积累[12].MPs为微生物提供了理想的生态位[13], 促进微生物在其表面形成生物膜, Zettler将MPs及其表面附着微生物的组合环境命名为“微塑料圈”[14].根据以往对MPs表面生物膜的宏基因组学研究, 假单胞菌属为主要优势菌属[15, 16], 其中铜绿假单胞菌作为一种条件致病菌, 可导致显著的发病率和死亡率, 常在饮用水中发现[17], 其引起的生态风险值得关注.
细菌群体感应(quorum sensing, QS)是一种由信号分子介导的细胞间通信系统, 通过调控相关基因表达来协调细菌的群体行为, 以适应外界环境变化[18].当信号分子累积浓度达到局部细菌种群密度阈值后, 信号分子通过细胞膜扩散, 并与转录调节剂结合, 以调节生物膜的发育和成熟[19].铜绿假单胞菌有4个相互连结的QS系统, 分别是las、rhl、pqs和iqs系统, 负责调节毒力因子和生物膜形成等代谢过程, 改变细菌的生存方式[20].有研究对MPs表面生物膜内提取到信号分子进行测定分析[21], 说明MPs通过调控信号分子分泌来影响微塑料生物膜的形成.
MPs可以通过物理、化学和载体效应等多重作用影响生物的生长发育[22].MPs粒径越小, 水环境中赋存数量越多[23], 对水生生物影响越明显[24].目前已有大量针对MPs毒性和表面生物膜群落结构和多样性变化的研究, 然而很少有研究关注MPs对生物膜形成和三维结构变化的影响机制.因此本实验采用水环境中普遍存在的聚苯乙烯作为研究对象, 通过对生物膜形成、氧化应激水平、生物膜结构变化和群体感应响应情况进行分析, 深入探究PS-MPs对生物膜形成发育的影响.
1 材料与方法 1.1 材料和试剂0.1、0.5、1和5 μm的PS-MPs(单分散悬浮液, 10 mg·mL-1, 分散介质为纯水)购于天津倍思乐色谱技术开发中心(中国).使用前通过超声(20℃, 250 W, 40 kHz)处理30 min将PS-MPs悬浮液分散均匀.
1.2 菌种培养本试验中所使用的铜绿假单胞菌336458购自北纳创联生物技术研究院.将菌种接种于Luria-Bertani(LB)培养基中, 在37℃ 150 r·min-1条件下培养过夜.将处于对数生长期的铜绿假单胞菌在4℃ 4 500 r·min-1条件下离心15 min收集细胞, 并用0.85%的NaCl溶液洗涤细胞两次以除去培养基残余物, 最后重悬于0.85%的NaCl溶液中, 并调节吸光度为D600=0.5(细胞密度约为108 CFU·mL-1).
1.3 生物膜形成测定生物膜在无菌96孔细胞培养板中培养.用LB培养基配制不同浓度(10、50和100 mg·L-1)PS-MPs溶液培养生物膜, 48 h后除去培养基, 并用200 μL无菌PBS缓冲液轻轻洗涤每个孔3次以除去未粘附的细菌.将孔板在室温下风干, 随后在每孔加入200 μL 0.1%结晶紫溶液染色15 min.然后将孔用200 μL无菌PBS缓冲液洗涤3次.风干后每孔加入200 μL 33%的冰醋酸溶解染料.使用酶标仪(Infinite 200 PRO NanoQuant, TECAN)在540 nm处测量每个孔的吸光度.
1.4 氧化应激程度测定收集暴露于PS-MPs环境下48 h的铜绿假单胞菌生物膜进行氧化应激水平测定.乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)、活性氧(reactive oxygen species, ROS)和丙二醛(malonaldehyde, MDA)水平分别使用LDH、ROS和MDA测定试剂盒(中国南京建成生物工程研究所), 根据制造商说明进行测定, 结果表示为与对照组的百分比形式.
1.5 激光共聚焦扫描显微镜在玻底培养皿中用不同粒径微塑料颗粒处理培养细菌生物膜, 借助激光共聚焦技术(CLSM)观察由PS-MPs产生的生物膜结构三维变化情况.本试验选用蓝色荧光微塑料(405/450 nm), 采用异硫氰酸荧光素(fuorescein-isothiocyanate, FITC)(488/517 nm)和刀豆蛋白(concanavalin A, ConA)(561/571~600 nm)探针分别用于标记菌膜内蛋白和多糖, 在激光共聚焦显微镜(Leica TCS SP8)下观察生物膜3D结构.
1.6 扫描电子显微镜在无菌96孔细胞培养板中培养细菌生物膜48 h后进行扫描电镜(SEM)观察.在生物膜培养完成后去除培养基, 用PBS缓冲液冲洗生物膜以去除未粘附的菌体, 后将生物膜在4℃下用2.5%的戊二醛原位固定过夜.固定后, 再次用PBS洗涤细菌生物膜, 用乙醇分级脱水(30%、50%、70%、80%和90%每次脱水15 min, 100%脱水两次, 每次20 min), 使用冷冻干燥法对样品进行干燥, 喷金, 用扫描电子显微镜(Hitachi-S4800)观察细菌生物膜形貌.
1.7 信号分子水平定量信号分子N-(3-氧代十二烷酰基)-L-高丝氨酸内酯[N-(3-oxododecanoyl)-L-homoserine lactone, 3-oxo-C12-HSL]、N-丁酰基-L-高丝氨酸内酯(N-butanoyl-L-homoserine lactone, C4-HSL)水平交付南京森贝伽生物科技有限公司使用测定试剂盒进行测定.
1.8 毒力因子水平测定 1.8.1 绿脓素测定采用氯仿-盐酸萃取法测定绿脓素含量.离心收集5 mL上清液并用3 mL氯仿萃取, 然后用1 mL 0.2mol·L-1 HCl反萃取有机相中的绿脓素, 在520 nm处测量吸光度.
1.8.2 鼠李糖脂测定采用硫酸-蒽酮比色法测定鼠李糖脂含量.离心收集上清液用1 mmol·L-1 HCl调节pH=2, 取3 mL上清液, 按上清∶氯仿∶甲醇=3∶2∶1萃取, 取下层氯仿层, 氮吹吹干, 后用1 mL去离子水回溶, 再加入4 mL硫酸-蒽酮溶液, 沸水浴10 min直至显色, 冷却后在620 nm处测量吸光度.
1.8.3 蛋白酶活性测定采用2%偶氮酪蛋白酶测定蛋白酶的活性.离心收集150 μL上清液加入250 μL 2%的偶氮酪蛋白-Tris/HCl(pH7.8), 在4℃下孵育4 h, 加入10% 1.2 mL的三氯乙酸15 min终止反应.离心取上清液, 加入1.4 mL 1 mol·L-1的NaOH溶液, 并在440 nm处测量吸光度.
1.8.4 弹性蛋白酶活性测定通过弹性蛋白刚果红试验确定弹性蛋白酶活性.离心收集0.5 mL上清液, 加入10 mg弹性蛋白-刚果红作为底物和1 mL缓冲液(30 mmol·L-1 Tris-HCl buffer, pH7.2), 在37℃下振荡孵育6 h.加入50 μL 0.12mol·L-1的乙二胺四乙酸(EDTA)终止反应, 离心取上清液, 并在495 nm处测量吸光度.
1.9 关键基因相对表达水平测定使用qPCR测定群体感应关键基因lasI、lasR、rhlI和rhlR的相对表达水平.用于扩增这些基因的引物序列见表 1.将菌株接种在含或不含PS-MPs的LB培养基中, 在37℃下静态培养48 h.将上述细菌总RNA利用反转录试剂盒(Takara)反转录为cDNA, 利用SYBR Green qPCR试剂盒测定铜绿假单胞菌QS系统相关基因lasI、lasR、rhlI和rhlR的相对表达水平.以铜绿假单胞菌16S rRNA作为内参基因, 并使用2-ΔΔCt方法分析相对基因表达[25].
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表 1 qPCR使用的引物列表 Table 1 List of primers used in qPCR |
1.10 统计分析
所有试验重复至少3次, 所有数据均表示为平均值±标准误差.使用单因素方差分析(one-way ANOVA)和事后LSD检验比较不同处理之间的显著性差异.当概率P < 0.05时, 差异被认为具有统计学意义.
2 结果与讨论 2.1 PS-MPs对生物膜形成的影响通过结晶紫染色法(D540)来研究PS-MPs对铜绿假单胞菌生物膜形成的影响.如图 1所示, 在静态条件下, 暴露在PS-MPs环境48 h后, 铜绿假单胞菌生物膜内生物量呈剂量和尺寸依赖性下降.与对照组相比, 低浓度PS-MPs对生物膜的抑制效果表现得并不明显, 而高浓度PS-MPs对铜绿假单胞菌生物膜的形成产生显著抑制效果, 当暴露于高浓度100mg·L-1 PS-MPs下, 各粒径组(0.1、0.5、1和5 μm)生物膜内生物量显著减少, 相较于对照组分别下降了(25.26±4.59)%、(21.28±4.18)%、(20.36±3.51)%和(15.63±3.31)%, 结果表明PS-MPs粒径越小, 对生物膜形成的抑制效果越明显, 抑制效果表现为0.1 μm>0.5 μm≈1 μm>5 μm.本文将进一步分析PS-MPs抑制作用的产生机制和生物膜的结构响应情况.
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小写字母表示不同PS-MPs粒径下的显著差异(P < 0.05), *表示试验组与对照组存在显著差异(P < 0.05) 图 1 PS-MPs环境下生物膜内生物量变化情况 Fig. 1 Changes in biofilm biomass in the PS-MPs environment |
LDH是一种可溶性细胞质酶, 当质膜受损时会释放出来[26], 可通过测量LDH含量来反映PS-MPs对细胞膜的损伤程度.如图 2(a)所示, 与对照组相比, 加入100 mg·L-1粒径分别为0.1、0.5、1和5 μm的PS-MPs处理组, 细胞内LDH水平分别显著增加了(92.44±4.29)%、(85.73±4.85)%、(82.37±5.97)%和(62.85±9.07)%, 表明暴露于高浓度PS-MPs环境会明显损害细菌细胞膜的完整性.
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小写字母表示不同PS-MPs粒径下的显著差异(P < 0.05), *表示试验组与对照组存在显著差异(P < 0.05) 图 2 PS-MPs环境下生物膜内细胞氧化应激反应水平 Fig. 2 Oxidative stress response levels of biofilm in the PS-MPs environment |
氧化应激被认为是微塑料诱导细胞毒性的主要机制[27].如图 2(b)所示, 100 mg·L-1 PS-MPs诱导产生的胞内ROS含量显著高于对照组.同时暴露于粒径为0.1 μm的PS-MPs下, 胞内ROS含量明显高于其他粒径组, 说明小粒径高浓度PS-MPs会诱导产生更高的细胞毒性.有研究表明外来颗粒物会使细胞内超氧根或过氧根以还原型辅酶Ⅱ或其他酶促反应产物的形式生成, 高浓度ROS将长期激活MAPK信号通道, 出现脂质过氧化并最终导致炎症反应或细胞凋亡情况[28].ROS累积会导致菌膜变形或细胞裂解, 这将对生物膜形成和发育产生一定的抑制效果.
细胞膜通透性增加和氧化应激通常与脂质过氧化有关[29].MDA是脂质过氧化的典型产物[30], 通过测定含量变化来解释不同粒径PS-MPs引起的氧化和脂质损伤.与LDH和ROS测定结果一致, 与对照组相比, 用高浓度PS-MPs处理48 h后, 各粒径组胞内MDA水平分别显著上升, 表明由于PS-MPs处理产生了严重的脂质过氧化, 而脂质过氧化增强可能会导致抗氧化防御机制的失效.
2.3 PS-MPs引起的生物膜结构特性变化铜绿假单胞菌生物膜在生长过程中, 分泌的EPS会不断将漂浮的塑料颗粒结合到基质中[31], 引起生物膜结构的变化, 并作为生物膜三维立体结构的组成部分.粒径大小影响MPs的聚集、沉降和迁移[32, 33], 不同粒径PS-MPs在膜内的积累情况不同, 如图 3所示, 小粒径PS-MPs在生物膜内的颗粒浓度明显高于大粒径PS-MPs, 一方面微塑料表面粘附细菌形成生物膜, 会改变微塑料本身的沉降性能, 使得小塑料在生物污染后下沉速度比大塑料快得多[34], 另一方面, 小粒径PS-MPs更易通过EPS孔道接触到内部细胞, 而大粒径PS-MPs却被EPS拦截在生物膜外.此外, PS-MPs粒径的大小不同, 使得在相同浓度情况下颗粒数也存在差异, 因此表现为粒径越小, 生物膜内MPs越多, 造成物理损伤的可能性越大.
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蓝色表示微塑料, 绿色表示胞外蛋白, 红色表示胞外多糖; 比例尺：1∶100 μm 图 3 PS-MPs环境下铜绿假单胞菌生物膜的CLSM图像 Fig. 3 CLSM images of Pseudomonas aeruginosa biofilm in the PS-MPs environment |
生物膜形成和EPS产生是细菌面对外界胁迫产生抗性的重要机制.EPS在生物膜形成过程中构成了生物膜3D结构的支架[35], 通过对EPS中蛋白多糖成分染色, 进一步确定PS-MPs对生物膜形成结构产生的影响.使用COMSTAT分析堆叠图像获得生物膜结构定量信息, 如图 4所示, 结果表明暴露在PS-MPs环境下生物膜厚度较对照组显著下降, 对照组生物膜厚度为(23.28±1.03)μm, 而用0.1、0.5、1和5 μm PS-MPs处理后, 生物膜厚度分别降至(12.33±1.53)、(10.67±1.53)、(9.33±0.58)和(10.00±1.00)μm(P < 0.05), 说明PS-MPs的加入在一定程度上抑制了菌膜的形成和分化.在没有PS-MPs作用环境下, 生物膜表面均匀, 生物膜几乎完全覆盖了整个基质表面, 而投加PS-MPs后形成的生物膜在基质表面覆盖不完全, 整体性遭到破坏.当暴露在0.1 μm PS-MPs环境下, 生物膜内蛋白多糖组成更加致密, 说明小粒径PS-MPs对铜绿假单胞菌分泌EPS更具刺激性和诱导性.细菌过量分泌EPS是一种在MPs环境压力下进行自我保护的行为[36], 通过增强EPS的分泌来阻塞生物膜内部的孔隙和通道, 从而产生更致密的生物膜表面.另一方面, 与对照组相比, PS-MPs环境下, 生物膜形成不均匀表面, 说明生物膜结构稳定性遭到破坏, 导致细菌斑块状定植.在激光共聚焦显微镜下观察到, 在面对外界胁迫作用时, 生物膜内蛋白含量占优势地位, 这可能是由于PS-MPs引起细胞氧化损伤, ROS的过量产生诱导生物膜中细胞裂解释放可溶性有机物质, 进而导致大量胞内蛋白质泄漏[37], 同时细菌也通过释放更多胞外蛋白进行自我修复, 以维持生物膜结构的稳定性[38].这说明细菌会激活许多应激反应途径来响应外界胁迫, 包括生物膜厚度、密度、代谢和组分的变化.
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小写字母表示不同组间的显著差异(P < 0.05) 图 4 PS-MPs环境下生物膜厚度 Fig. 4 Thickness of biofilm in the PS-MPs environment |
MPs进入生物膜内与细菌直接接触会对细胞造成物理损伤[39], 而MPs粒径对细菌的粘附起决定性影响.试验通过SEM观察细胞形态和PS-MPs与细菌细胞的粘附情况, 从微观角度分析PS-MPs引起的生物膜结构变化.如图 5(a)所示, 培养48 h后, 对照组生物膜内细胞光滑平整, 细菌排列紧密.而暴露在不同粒径PS-MPs环境下, 细菌细胞变形且破损严重, 生物膜结构变得粗糙, 并且可以看到铜绿假单胞菌分泌的EPS与PS-MPs紧密结合.如图 5(b)所示, 0.1 μm PS-MPs易产生团聚, 大量MPs不均匀分散或聚集在细胞表面, 破坏细胞膜完整性, 诱导严重的细胞失活, 进而导致细胞内物质泄漏并造成严重物理损伤.当暴露于0.5 μm和1 μm PS-MPs环境下, 由于细菌尺寸与微塑料尺寸接近, 细胞分泌EPS与微塑料粘连, 细胞表面粗糙变形, 如图 5(c)和5(d)所示. 5 μm PS-MPs成为促进细菌生长的载体, 如图 5(e)所示, 细菌细胞完整且通过分泌EPS使其定植在MPs表面形成生物膜.SEM结果证明, PS-MPs以粒径依赖性方式刺激EPS的分泌, 同时诱导生物膜内细胞死亡和细胞内容物释放.
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(a)对照组; (b)0.1 μm; (c)0.5 μm; (d)1 μm; (e)5 μm 图 5 PS-MPs环境下铜绿假单胞菌生物膜的SEM图像 Fig. 5 SEM images of Pseudomonas aeruginosa biofilm in the PS-MPs environment |
生物膜形成是细菌之间的一种社会行为, 细菌通过QS系统调节生物膜的形成来保护自身抵抗各种外界应力[40].PS-MPs环境下生物膜的形成受到抑制, 推测QS系统可能受到影响.因此试验通过测定铜绿假单胞菌QS系统对PS-MPs胁迫的响应, 探究其对生物膜形成发育和结构稳定影响.
2.5 PS-MPs减少铜绿假单胞菌QS信号分子的合成铜绿假单胞菌有2个酰基-高丝氨酸内酯(homoserine lactone, AHL)介导的QS通路：las和rhl[41], 分别合成信号分子3-oxo-C12-HSL和C4-HSL, 当信号分子达到阈值水平时, 会诱导附着的细菌生长和生物膜形成[42].本试验通过从生物膜内提取并测量了这两种信号分子水平来探究PS-MPs对其合成和分泌的影响.如图 6所示, 在PS-MPs存在的情况下, 生物膜内信号分子3-oxo-C12-HSL和C4-HSL水平显著降低.与对照组相比, 暴露在0.1、0.5、1和5μm PS-MPs环境下, 3-oxo-C12-HSL含量分别下降了(39.47±1.34)%、(31.34±1.63)%、(22.24±2.81)%和(12.19±2.71)%; C4-HSL水平分别下降了(36.10±2.15)%、(25.94±3.22)%、(17.38±4.24)%和(9.09±3.19)%. 铜绿假单胞菌通过合成信号分子3-oxo-C12-HSL和C4-HSL来激活QS系统, 建立前反馈循环以促进相关基因表达[43].因此PS-MPs通过抑制信号分子的释放, 破坏了QS系统的前反馈循环, 从而影响细菌定植和生物膜形成.
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小写字母表示不同PS-MPs粒径下的显著差异(P < 0.05), *表示试验组与对照组存在显著差异(P < 0.05), 下同 图 6 PS-MPs环境下生物膜内信号分子分泌水平变化 Fig. 6 Secretion levels of signaling molecules in biofilm in the PS-MPs environment |
铜绿假单胞菌毒力因子分泌会影响生物膜的形成和稳定性[44], 本试验进一步研究了PS-MPs对QS毒力因子产生的影响.如图 7所示, PS-MPs显著抑制绿脓素、鼠李糖脂、蛋白酶和弹性蛋白酶的产生, 且抑制作用表现出粒径依赖性.信号分子调控毒力因子的产生, 试验结果说明PS-MPs通过影响细菌信号传导, 降低了毒力因子的分泌水平.绿脓素能够控制细菌细胞初期聚集并形成微菌落, 鼠李糖脂通过维持微菌落周围的开放通道结构来促进营养物质和氧气摄取[45], 蛋白酶和弹性蛋白酶有助于细菌行为表达和生态适应性[46, 47].因此, 毒力因子水平的降低会影响细菌初期聚集和对环境变化的适应能力, 最终导致无法形成具有稳定结构的生物膜.另外铜绿假单胞菌通过释放毒力因子参与细菌发病机制[48], PS-MPs对毒力因子分泌的抑制作用可以部分降低致病菌的生态风险, 具有环境意义.
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图 7 PS-MPs环境下生物膜内毒力因子水平变化 Fig. 7 Changes in virulence factor content in biofilm in the PS-MPs environment |
AHL介导的基因表达是细菌细胞间信号传导的主要机制, 当信号分子水平达到阈值时, 会与转录调节剂结合, 诱导靶基因的表达[49]. las和rhl系统分别控制信号分子合成酶基因lasI、rhlI和信号分子受体蛋白基因lasR、rhlR的表达[50].为了进一步了解PS-MPs对生物膜QS系统调控作用, 测定了关键基因lasI、lasR、rhlI和rhlR的相对表达水平变化.如图 8所示, 在PS-MPs作用下, lasI、lasR、rhlI和rhlR的相对表达水平显著降低(P < 0.05).暴露在粒径为0.1 μm PS-MPs环境下, lasI和lasR的相对表达分别显著降低了(21.53±0.67)%和(20.07±0.48)%, 而rhlI和rhlR的相对表达分别显著降低了(19.58±2.07)%和(22.98±0.97)%. 结果表明PS-MPs抑制了信号分子合成酶和受体蛋白的活性, 这会影响成熟和完整生物膜的形成.
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图 8 PS-MPs对铜绿假单胞菌群体感应关键基因表达水平的影响 Fig. 8 Effect of PS-MPs on the expression levels of key quorum sensing genes in Pseudomonas aeruginosa |
生物膜内QS系统整体变化趋势与生物膜发育过程一致, PS-MPs粒径越小, 生物膜内生物量越少, QS抑制情况也越强烈, 这表明PS-MPs产生的细胞毒性影响了QS系统防御功能, 进而抑制了生物膜的形成.QS系统能够抵抗ROS引起的氧化损伤作用, 其表达水平的降低一方面可能是因为PS-MPs诱导的氧化应激水平上升, 高水平ROS累积干扰了QS通路的正常生理功能, 表现为QS相关基因表达下调, 信号分子3-oxo-C12-HSL和C4-HSL的合成受到抑制, 毒力因子分泌水平降低.另一方面可能是因为PS-MPs的毒性作用造成细菌死亡, 膜内能够释放信号分子的活细胞数量下降, 细菌间的信号传导受到干扰, 从而减缓生物膜的生长发育.QS系统无法清除胞内累积的ROS, 因此细胞受到强烈氧化损伤失活, 影响生物膜的形成和分化, 从而生物膜结构稳定性遭到破坏.
3 结论(1) 粒径和浓度是PS-MPs抑制铜绿假单胞菌生物膜形成和发育的重要因素.高浓度和小粒径PS-MPs会刺激细菌细胞产生高水平的氧化应激反应, 诱导产生细胞毒性.
(2) 100 mg·L-1浓度的PS-MPs破坏了生物膜结构的完整性和稳定性.在生物膜形成过程中, 0.1 μm PS-MPs表现出更高水平的刺激性和诱导性, 触发铜绿假单胞菌分泌高蛋白组成的EPS, 作为细胞对外界胁迫的响应机制.
(3) PS-MPs能够干扰铜绿假单胞菌QS系统.PS-MPs下调QS系统关键基因lasI、lasR、rhlI和rhlR的表达水平, 抑制QS系统信号分子和相关毒力因子产生, 导致细胞对ROS抵抗能力下降, 最终影响细菌生物膜的形成和结构稳定性.
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