2023, Vol. 44
2. 河北科技大学环境科学与工程学院, 河北省污染防治生物技术实验室, 石家庄 050018
2. Biotechnology Laboratory for Pollution Control in Hebei Province, School of Environmental Science and Engineering, Hebei University of Science and Technology, Shijiazhuang 050018, China
异养硝化-好氧反硝化(heterotrophic nitrification-aerobic denitrification, HN-AD)微生物的发现, 为生物脱氮过程赋予了新的内涵.自首株HN-AD菌株Thiosphaera pantotropha(Paracoccus denitrificans)[1]被分离以来, 国内外学者陆续从不同生境中筛选出了大量具有HN-AD能力的菌株, 如不动杆菌(Acinetobacter)[2]、芽孢杆菌(Bacillus)[3]、假单胞菌(Pseudomonas)[4]和产碱杆菌(Alcaligenes)[5]等.该类微生物繁殖速度快, 不仅可以同步去除水体中的无机氮和有机碳, 还可以在有氧条件下进行同步硝化和反硝化(simultaneous nitrification and denitrification, SND), 实现了硝化和反硝化过程在时间与空间上的统一.
目前报道的HN-AD菌株多为中温菌, 其最佳作用温度一般为25~37℃[6], 它们在中温条件下表现出高效的脱氮性能, 当暴露于低温环境时, 其酶活性和生长均会受到显著抑制, 脱氮效能显著降低甚至终止.如Pseudomonas chloritidismutans K14在19℃时的反硝化作用受到明显抑制[7]; Acinetobacter sp.C-13在20℃时具有较低的细胞生物量(D600=0.51)和氨氮(NH4+-N)去除率(30.3%)[2].在我国北方地区, 冬季污水处理厂(wastewater treatment plants, WWTPs)的运行温度多在15℃左右, 低温会降低生物脱氮效率从而导致WWTPs出水氮素不达标, 加剧WWTPs受纳水体的污染风险[8].耐冷微生物是一类能够耐受较低温度, 在寒冷环境下可以长期生存并进行正常代谢的微生物, 该类微生物为提高冬季低温期生物脱氮效率提供了可能.目前具有耐冷特性的HN-AD细菌已被报道, 如Acinetobacter sp. TAC-1[9]和Bacillus simplex H-b[10]等.然而, 当前从WWTPs中分离出的耐冷HN-AD细菌相对较少, 其低温脱氮特性和作用机制尚不清楚, 阻碍了该类菌株在低温污水处理中的应用.因此, 筛选高效耐低温HN-AD菌株对提高WWTPs冬季生物脱氮效率具有重要现实意义.
本研究从WWTPs中分离出1株高效耐低温HN-AD菌株, 对菌株进行了分子生物学鉴定并扩增了氮代谢相关功能基因, 解析了该菌株在不同氮源条件下的脱氮性能, 探究了不同环境因子对其好氧反硝化(aerobic denitrification, AD)性能的影响, 并基于氮平衡分析和功能基因扩增结果推导菌株对不同氮源可能的代谢途径, 以期丰富耐冷脱氮微生物的菌种库, 为该菌株在低温污水处理中的应用提供理论基础.
1 材料与方法 1.1 培养基异养硝化培养基(HNM)(g·L-1)：(NH4)2SO4 0.235 8, Na2HPO4·12H2O 10.55, KH2PO4 1.5, MgSO4·7H2O 0.1, 柠檬酸钠3.26. 微量元素溶液2 mL.
好氧反硝化培养基(DM-1)(g·L-1)：KNO3 0.36, Na2HPO4·12H2O 10.55, KH2PO4 1.5, MgSO4·7H2O 0.1, 柠檬酸钠3.26. 微量元素溶液2 mL.
好氧反硝化培养基(DM-2)(g·L-1)：NaNO2 0.123 2, KNO3 0.18, Na2HPO4·12H2O 10.55, KH2PO4 1.5, MgSO4·7H2O 0.1, 柠檬酸钠3.26. 微量元素溶液2 mL.
异养硝化-好氧反硝化培养基(HNDM)(g·L-1)：(NH4)2SO4 0.117 9, KNO3 0.18, Na2HPO4·12H2O 10.55, KH2PO4 1.5, MgSO4·7H2O 0.1, 柠檬酸钠3.26. 微量元素溶液2 mL.
微量元素溶液(g·L-1)：EDTA-2Na 50, ZnSO4 2.2, CaCl2 5.5, MnCl2·4H2O 5.06, FeSO4·7H2O 5.0, CuSO4·5H2O 1.57, CoCl2·6H2O 1.61.
LB培养基(g·L-1)：胰蛋白胨10, 酵母提取物5, NaCl 5.
在培养基中按1.5%的体积比加入琼脂粉以制备琼脂平板.所有培养基的初始pH值均调整为7.0, 并在使用前于121℃高压灭菌30 min.
1.2 菌种鉴定本研究中的活性污泥样品采集自石家庄市某城市污水处理厂A2O工艺的好氧池.分离纯化过程参考文献[11], 选择具有优异脱氮能力的菌株WS1进行深入研究.将WS1纯菌株接种至LB琼脂板, 培养48 h后采用扫描电镜观察菌体形态.
采用通用细菌引物27F/1492R, 扩增菌株WS1的16S rRNA基因.扩增产物由北京睿博兴科生物技术有限公司测序, 将测序结果提交至GenBank数据库, 并使用BLAST程序将该菌株的核苷酸序列与NCBI中已获得的其他微生物序列进行比对.利用MEGA 7.0软件构建菌株系统发育树.
1.3 脱氮功能基因的扩增以菌株WS1的基因组DNA为模板, 采用PCR技术分别扩增amoA(氨单加氧酶编码基因)、hao(羟胺氧化酶编码基因)、napA(硝酸盐还原酶编码基因)、nirS/nirK(亚硝酸盐还原酶编码基因)、norB(一氧化氮还原酶编码基因)和nosZ(一氧化二氮还原酶编码基因).PCR反应体系(50 μL)为：2×Taq PCR Master Mix 25 μL, DNA模板1 μL, F-primer(10 μmol·L-1)1 μL, R-primer(10 μmol·L-1)1 μL, ddH2O 22 μL.相应的引物序列和扩增程序分别如表 1和表 2所示, PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳分析.
|
表 1 脱氮功能基因的引物序列 Table 1 Primer sequences of denitrogenation functional genes |
|
|
表 2 脱氮功能基因的扩增程序1) Table 2 Amplification procedures of denitrogenation functional genes |
1.4 菌株WS1在低温下的脱氮特性研究
按1%(体积比)的接种量将菌株WS1的种子液分别接种至HNM、DM-1、DM-2和HNDM中, 在15℃和150 r·min-1条件下培养48 h.定期取样, 测定细胞生物量(D600)、NH4+-N、硝态氮(NO3--N)、亚硝态氮(NO2--N)、上清液中可溶性总氮(dissolved total nitrogen, DTN)和菌液中总氮(total nitrogen, TN)浓度.
1.5 环境因子对菌株WS1好氧反硝化性能的影响采用单因素控制变量法探究不同环境因子对菌株WS1好氧反硝化性能的影响.按1%(体积比)的接种量将WS1菌液接种至DM-1中, 以pH 7、转速150 r·min-1和温度15℃作为初始培养条件, 各实验组中只改变验证因子.在碳源实验中, 分别以葡萄糖、柠檬酸钠、乙酸钠和丁二酸钠作为唯一碳源; 在C/N实验中, 固定NO3--N浓度为50 mg·L-1, 通过改变柠檬酸钠质量, 调整C/N为1、5、10、16、20和30; 在pH实验中, pH分别设置为6、7、8、9和10; 在DO实验中, 通过调节转速为90、120、150和170 r·min-1控制培养基中的DO分别为3.6、4.5、5.9和6.8 mg·L-1; 在温度实验中, 分别设置培养温度为10、15、20和30℃.定期取样, 测定D600和NO3--N浓度.
1.6 氮平衡分析计算菌株WS1在HNM、DM-1、DM-2和HNDM中对不同形态无机氮的去除情况, 建立氮平衡关系, 解析菌株WS1对不同氮源的氮代谢途径.细胞氮(Cell-N)、气态氮(Gas-N)和脱氮效率的计算方法参考文献[12].
1.7 分析方法分别采用纳氏试剂分光光度法、紫外分光光度法、N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法和碱性过硫酸钾法测定NH4+-N、NO3--N、NO2--N和DTN/TN浓度. D600由分光光度法测定.
2 结果与讨论 2.1 菌种鉴定如图 1(a)所示, 菌株WS1在琼脂板上的成熟菌落为黄色, 表面湿润且光滑, 略有凸起, 边缘形状规则.图 1(b)菌株WS1的扫描电镜图像显示, 菌体呈杆状, 大小为0.6 μm ×(1.5~2.8)μm.将菌株的16S rRNA序列提交至GenBank数据库, 获得登录号OM017179.利用BLAST工具获得与菌株WS1相似度最高的菌株序列, 采用邻接法构建系统发育树, 由图 1(c)可知, 菌株WS1与Glutamicibacter protophormiae strain DSM 20168的序列相似度最高(99.86%), WS1归属于谷氨酸杆菌属(Glutamicibacter), 因此鉴定菌株WS1为谷氨酸杆菌, 并将其命名为Glutamicibacter sp. WS1.
|
(a)菌落形态; (b)扫描电镜图; (c)系统发育树 图 1 菌株WS1的形态和系统发育树 Fig. 1 Morphology and phylogenetic tree of strain WS1 |
谷氨酸杆菌广泛存在于水体和土壤环境中, 已有研究报道了该类菌属具有异养硝化(heterotrophic nitrification, HN)能力, Chen等[13]从沼气池中分离出1株新型HN细菌Glutamicibacter arilaitensis EM-H8, 该菌株能够通过HN作用有效去除羟胺.然而, 关于谷氨酸杆菌的耐低温和HN-AD特性尚未见报道.菌株WS1可能是首次被报道的具有耐低温特性和HN-AD能力的谷氨酸杆菌.
2.2 PCR扩增功能基因如图 2所示, 利用PCR技术从菌株WS1中成功扩增出amoA、napA、nirS和nirK基因. amoA是硝化过程中的关键基因, 它通过编码氨单加氧酶(AMO), 催化NH4+-N转化为羟胺(NH2OH)[14], amoA基因的扩增表明菌株WS1具有潜在的异养硝化能力. napA基因通常被作为鉴定好氧反硝化细菌的典型标志[15], napA基因能够转录表达周质硝酸盐还原酶(NAP), napA基因的扩增表明该菌株能够将NO3--N催化还原为NO2--N.在其他HN-AD菌株中也扩增出了napA基因, 如Acinetobacter sp. ND7[16]和Pseudomonas balearica strain RAD-17[17].亚硝酸盐还原酶(NIR)是由nirS或nirK基因编码的能够将NO2--N还原为NO的关键酶[18], 其中, nirS基因编码细胞色素cd1型亚硝酸盐还原酶(cd1-NIR), nirK基因编码铜型亚硝酸盐还原酶(Cu-NIR).目前, nirS和nirK基因已在部分HN-AD细菌中分别被扩增, 如在Acinetobacter indicus ZJB20129[19]和Exiguobacterium mexicanum strain SND-01[20]中扩增出了nirS基因, 在Pseudomonas sp. DM02[21]和Halomonas sp. HRL-9[22]中扩增出了nirK基因.
|
图 2 菌株WS1功能基因的扩增 Fig. 2 Amplification of functional genes in strain WS1 |
值得注意的是, 先前研究普遍认为在同一菌体中, nirS和nirK基因不能同时存在[23].随着研究的深入, 目前研究人员已从部分菌株中同时扩增出了这两种功能基因, 如Jang等[24]从Bradyrhizobium nitroreducens sp. nov.中同时扩增出了nirS和nirK基因.同样, 本研究也从菌株WS1中扩增出了nirS和nirK基因, 再次证实了在同一反硝化菌株中nirS和nirK基因可以共存的结论, 这可能是首次在具有HN-AD特性的菌体中发现该现象, 关于菌株WS1中nirS和nirK基因的作用模式(共同主导NO2--N还原或其中一个为冗余基因)有待进一步研究.另外, 在菌株WS1中并未检测到hao、norB和nosZ功能基因, 可能是该菌株中不存在以上3种基因, 即菌株WS1驱动的是不完整的HN-AD/AD过程, 也可能是本实验选用的引物与菌株所含功能基因不匹配所致.综上, amoA、napA、nirS和nirK基因的成功扩增, 从基因角度证明了菌株WS1具有HN和AD能力.
2.3 菌株WS1的低温脱氮特性 2.3.1 NH4+-N为氮源在以NH4+-N为唯一氮源的15℃培养体系中, 菌株WS1的生长曲线和脱氮情况如图 3所示.在0~12 h菌株生长相对缓慢, 12 h后生长进入对数期, NH4+-N浓度急剧下降, 在36 h时NH4+-N去除率达到100%, NH4+-N平均去除速率为1.26 mg·(L·h)-1, 显著高于Acinetobacter junii ZMF5 [0.21 mg·(L·h)-1][25]在30℃的NH4+-N去除速率.NO2--N和NO3--N通常被认为是发生异养硝化的重要标志[11], 在整个反应过程中, 几乎没有NO2--N累积, 12 h时观察到NO3--N浓度达到峰值为9.44 mg·L-1, 说明菌株WS1发生了硝化作用.随后NO3--N浓度逐渐降低, 初步表明菌株WS1在进行硝化的同时也伴随着反硝化进行.反应48 h后, DTN去除率达到84.89%.表 3揭示了不同氮源条件下菌液中TN浓度的变化情况, 反应结束时TN浓度由60.29 mg·L-1降低到32.63 mg·L-1, 表明有45.88%的NH4+-N转化成了气态氮, 进一步证实菌株WS1具有HN-AD能力.以上结果表明, 菌株WS1在15℃低温条件下具有良好的NH4+-N去除能力.
|
图 3 NH4+-N为氮源时菌株WS1的生长曲线和脱氮特性 Fig. 3 Growth curve and nitrogen removal characteristics of strain WS1 with NH4+-N as nitrogen source |
|
|
表 3 不同氮源条件下菌株WS1对TN的去除 Table 3 TN removal by strain WS1 under different nitrogen sources |
2.3.2 NO3--N为氮源
图 4揭示了菌株WS1以NO3--N为唯一氮源时的生长曲线和培养过程中各形态氮的浓度变化.由图 4可知, 0~10 h为菌株WS1的适应期, 之后菌株生长进入对数期, 48 h时生物量D600达到1.05; 在30~34 h, NO3--N的最大去除速率为3.36 mg·(L·h)-1, 优于Pseudomonas sp. Y39-6 [1.77 mg·(L·h)-1]在20℃的NO3--N去除速率[26]; 随着反应进行NO3--N浓度持续降低, 48 h时去除率达到98.10%, 平均反硝化速率为1.11 mg·(L·h)-1.在整个培养过程中, NO2--N少量累积, 在34 h浓度最高为3.32 mg·L-1, 随后被完全去除, 证实菌株WS1在NIR的催化下进行了AD作用.此外, 在34 h时观察到NH4+-N浓度略有升高, 这可能是由同化NO3--N还原为NH4+-N(assimilatory nitrate reduction to ammonium, ANRA)或异化NO3--N还原为NH4+-N(dissimilatory nitrate reduction to ammonium, DNRA)所致[27].在Vibrio sp. Y1-5[28]和Pseudomonas sp. JQ-H3[29]中也观察到了相似现象.反应48 h后, DTN去除率达到81.97%.由表 3可知, 菌液中TN浓度由63.58 mg·L-1降低至30.45 mg·L-1, 表明大约52.11%的NO3--N通过AD作用下转化为了气态氮.以上结果表明, 菌株WS1在15℃低温条件下具有良好的NO3--N去除能力.
|
图 4 NO3--N为氮源时菌株WS1的生长曲线和脱氮特性 Fig. 4 Growth curve and nitrogen removal characteristics of strain WS1 with NO3--N as nitrogen source |
以NO2--N和NO3--N为混合氮源验证菌株WS1的生长和低温好氧反硝化特性.如图 5所示, 0~12 h为菌株的适应期, 生长缓慢, 之后菌株生长进入对数期, 48 h菌株生物量达到最高, D600为1.07.在0~24 h, NO3--N快速去除, 去除率为83.14%, 该过程中NO2--N浓度有所上升, 表明部分NO3--N通过AD作用转化为了NO2--N; 24 h时, NO3--N几乎被完全去除, 同时NO2--N进入快速去除阶段; 在24~36 h内NO2--N平均去除速率为2.13 mg·(L·h)-1, 反应结束时去除率达到99.87%.以上结果表明, 当NO2--N和NO3--N共存时, 菌株WS1优先利用NO3--N进行同化和反硝化作用, NO3--N不足时开始消耗NO2--N.有研究表明, NO2--N的存在会对菌体产生毒害作用进而抑制反硝化过程[30], 本研究中菌株WS1对初始浓度为25 mg·L-1的NO2--N表现出了较强的耐受性和去除特性, 可能归因于NO2--N的初始浓度未超过其对微生物的毒害阈值(30 mg·L-1)[9].在整个培养过程中, NH4+-N浓度一直处于较低水平, 39 h时其浓度略有升高, 可能是由死亡菌体释放.反应完成后, 约有85.52%的DTN被去除, 53.62%的TN被去除(表 3), TN浓度的降低表明有气态氮生成.以上结果表明菌株WS1在15℃低温条件下具有卓越的AD能力.
|
图 5 NO3--N+NO2--N为氮源时菌株WS1的生长曲线和脱氮特性 Fig. 5 Growth curve and nitrogen removal characteristics of strain WS1 with NO3--N and NO2--N as nitrogen sources |
在以NH4+-N和NO3--N为混合氮源的培养体系中, 菌株WS1的生长曲线和脱氮情况如图 6所示.在前12 h, 菌株处于适应期, 生长缓慢, 之后生长进入对数期.在0~36 h内, NH4+-N浓度从26.17 mg·L-1降低至4.68 mg·L-1, 48 h时NH4+-N完全去除.与NH4+-N的去除趋势不同, 在0~12 h内NO3--N浓度从初始的34.2 mg·L-1增加到36.61 mg·L-1, 可能是NH4+-N通过HN作用贡献; 随后NO3--N开始大幅削减, 48 h时NO3--N去除率达到94.92%.分析发现, 在NH4+-N和NO3--N的混合体系中, 当生物量较低时, 菌株WS1优先利用NH4+-N而非NO3--N进行同化作用, 该现象也发生于Ochrobactrum anthropi HND19[31]和Acinetobacter sp. JR1[32]中.在整个脱氮过程中, 菌株WS1对NH4+-N的平均去除速率为0.55 mg·(L·h)-1, 低于其在HNM中对NH4+-N的去除速率[1.26 mg·(L·h)-1], 可能是因为NO3--N的存在使得NH4+-N和NO3--N之间产生了反馈抑制, 从而影响了NH4+-N去除[19].此外, 36 h时NO2--N累积为2.54 mg·L-1, 实验后期NO2--N几乎被完全去除.反应结束时, DTN去除率达到77.93%, TN去除率达到48.37%(表 3), TN的去除表明菌株WS1在HN-AD和AD的作用下将无机氮转化为了气态氮.由此可见, 菌株WS1具有良好的HN-AD能力.
|
图 6 NH4+-N+NO3--N为氮源时菌株WS1的生长曲线和脱氮特性 Fig. 6 Growth curve and nitrogen removal characteristics of strain WS1 with NH4+-N and NO3--N as nitrogen sources |
综上所述, 菌株WS1是1株高效的HN-AD细菌, 在15℃的低温条件下能够有效降解多种含氮底物, 这有利于它占据广泛的生态位, 更好地适应不同的水环境.
2.4 环境因子对菌株WS1脱氮性能的影响 2.4.1 碳源有机碳不仅为细菌的生长提供能量, 而且为菌体的氮代谢提供电子供体[31].由菌株WS1在不同类型碳源下的生长曲线和反硝化特性可知(图 7), 在以柠檬酸钠和乙酸钠为唯一碳源时, 菌株WS1长势好, 脱氮效果显著.其中柠檬酸钠是菌株好氧反硝化的最佳碳源, 以此为碳源培养60 h后NO3--N去除率可达100%; 其次是乙酸钠, 去除率达到95.62%.菌株WS1几乎不能利用葡萄糖和丁二酸钠进行生长和代谢, 这可能与不同碳源的分子结构和化学性质有关[33].已有研究表明, HN-AD菌更倾向于利用有机酸(柠檬酸)进行生长和繁殖, 因为其分子结构简单, 且有机酸更容易进入三羧酸(TCA)循环, 为细胞提供动力和能量[7].柠檬酸作为TCA循环的产物, 能直接被微生物利用, 这可能是该菌株能有效利用柠檬酸钠进行生长和代谢的主要原因[34].因此, 选择柠檬酸钠作为该菌株在低温下进行好氧反硝化的最佳碳源.
|
图 7 碳源对菌株WS1生长和脱氮性能的影响 Fig. 7 Effect of carbon source on the growth and denitrification performance of strain WS1 |
C/N是影响生物脱氮的关键因素, 不同C/N对菌株WS1好氧反硝化过程的影响如图 8所示, 随着C/N的升高, 菌株生物量和好氧反硝化效率整体均呈升高趋势, 主要原因是充足的有机碳为微生物的生长和脱氮提供了足够的能量和电子供体[35].当C/N为1时, 菌株WS1生长缓慢, NO3--N去除率最低, 有机碳的缺乏限制了能量供应, 抑制了菌株的生长和繁殖[36]; 当C/N为5时, 菌株生物量D600为0.38, NO3--N去除率为40.38%, 表明即使在低C/N下该菌株也具有一定的脱氮能力; 当C/N升高至10时, 菌株生物量和NO3--N去除率分别增加至0.69和92.50%; 继续提升C/N至16和20时, 菌株生物量达到最高均为0.93, NO3--N去除率分别升高至100%和99.39%; 当C/N进一步增加至30时, 菌株生物量(D600=0.87)和反硝化效率(96.89%)均略微低于C/N 16~20, 但依旧保持在较高水平, 说明菌株WS1能够耐受较高浓度的有机碳, 优于Zobellella sp. B307[37]和Pseudomonas stutzeri XL-2[38].综上可知, 菌株WS1在低温条件下具有较广的C/N适用范围, C/N为16时其生物量和反硝化效率均为最高.当前WWTPs中的C/N一般在10左右, 而菌株WS1在C/N为10时仍然表现出了较高的反硝化能力, 表明菌株WS1在处理低温和低C/N的污水领域有较大的应用潜能.
|
图 8 C/N对菌株WS1生长和脱氮性能的影响 Fig. 8 Effect of C/N on the growth and denitrification performance of strain WS1 |
pH通过引起细胞膜上电荷的变化影响微生物代谢, 进而影响好氧反硝化性能[39].初始pH对菌株WS1生长和NO3--N去除的影响如图 9所示.菌株WS1在pH为7~10时生长和反硝化效果显著, D600为0.52~0.61, NO3--N去除率均高于97%, 这一结果与大多数HN-AD菌都能在中性或微碱性环境中生长的结论一致[40]; 其中, 当pH为8时, 菌株生物量(D600=0.64)和NO3--N去除率(100%)均为最高; 在pH为9~10时, 菌株生物量虽略有下降, 但仍表现出了优异的反硝化效能, 反应完成时NO3--N几乎被完全去除.然而, 菌株WS1在pH为6时几乎不能进行正常的生长和代谢, 主要原因是酸性环境抑制了菌株的反硝化酶活性.许多研究者报道了相同的结果, Zheng等[41]研究发现Pseudomonas stutzeri PCN-1在pH为6的环境中反硝化效率低下.可知菌株WS1对酸性环境极为敏感, 但对碱性环境具有一定的耐受性, 后续实验中将pH 8作为菌株WS1低温生长和好氧反硝化的最适pH.
|
图 9 pH对菌株WS1生长和脱氮性能的影响 Fig. 9 Effect of pH on the growth and denitrification performance of strain WS1 |
本研究通过调节转速改变培养基中的DO, 探究不同DO对菌株WS1生长和好氧反硝化性能的影响.如图 10所示, 当转速为90 r·min-1[ρ(DO)3.6 mg·L-1]时, 菌株生物量和反硝化效率均处于较低水平, 可能是较低的DO抑制了NAP的活性, 进而影响反硝化效率[42].将转速逐步提高到120 r·min-1[ρ(DO)为4.5 mg·L-1]、150 r·min-1[ρ(DO)为5.9 mg·L-1]和170 r·min-1[ρ(DO)为6.8 mg·L-1], 菌株生物量D600为0.79~0.83, NO3--N去除率均为100%, DO的增加促进了氮代谢酶的催化作用, 提高了反硝化效率[28].此外, 高转速条件还可以加速O2和NO3--N之间的传质速率, 增强菌株与底物的接触, 从而提高脱氮效率[38]. 当转速在120~170 r·min-1之间时, 菌株WS1的反硝化效率最高, 即菌株WS1的最适ρ(DO)为4.5~6.8 mg·L-1.有研究表明, 过高的DO会抑制微生物的生长和代谢[43], 而在菌株WS1中未出现此现象, 表明菌株WS1具有较高的DO耐受性.
|
图 10 转速对菌株WS1生长和脱氮性能的影响 Fig. 10 Effect of shaking speed on the growth and denitrification performance of strain WS1 |
大多数HN-AD菌株的脱氮能力受温度影响显著[44].图 11显示了菌株WS1在不同培养温度下的生长曲线和NO3--N去除情况.从中可知, 随着温度升高, 菌株WS1的生长速率和反硝化效能均呈升高趋势.在10℃时, 菌株WS1的生长和脱氮均受到明显抑制, 可能的原因是低温抑制了反硝化酶的活性; 在15~30℃温度范围内, 低温环境会降低菌株的生长速率和好氧反硝化速率, 但对反应结束时的生物量和脱氮效能影响较小, 在15℃时菌株最大生物量D600为1.08, NO3--N去除率为99.49%, 高于Acinetobacter sp. ND7[16]在20℃的反硝化效率(79.23%); 菌株WS1在30℃的生长速率和反硝化速率均为最高, 该温度下菌株生长直接进入对数期, 24 h时细胞生物量D600达到最大为1.06, 且NO3--N去除率达到99.84%, 反应完成时去除率达到100%, 30℃是菌株WS1的最佳好氧反硝化温度, 该结果与Acinetobacter sp. strain C-13[2]和Acinetobacter sp. FYF8[45]的最适温度一致.菌株WS1较广的适用温度(15~30℃)表明其在WWTPs中的应用几乎不受季节变化的影响.
|
图 11 温度对菌株WS1生长和脱氮性能的影响 Fig. 11 Effect of temperature on the growth and denitrification performance of strain WS1 |
采用氮平衡法分析不同氮源条件下菌株WS1的氮代谢途径.由表 4可知, 以NH4+-N为唯一氮源时, 约有37.77%的初始氮转化为细胞氮, 菌株的同化效率显著高于其他3种氮源条件, 表明相比于NO3--N和NO2--N, NH4+-N更容易被WS1同化利用, 相似的结果见于Rhizobium sp. WS7[11].另外, 47.12%的气态氮生成表明菌株WS1同步进行了AD作用, 推测菌株WS1首先以NH4+-N为氮源通过HN作用生成NO3--N, 然后通过AD作用生成气态氮.结合功能基因的扩增, 推导菌株WS1对NH4+-N的代谢以HN-AD和同化作用为主.
|
|
表 4 菌株WS1在不同氮源中的氮平衡分析 Table 4 Nitrogen balance analysis of strain WS1 with different nitrogen sources |
以NO3--N为唯一氮源时, 约有27.88%的初始氮转化为细胞氮, 54.09%的初始氮转化为气态氮.以NO2--N和NO3--N同时为氮源时, 约有29.63%的初始氮转化为细胞氮, 55.89%的初始氮转化为气态氮.对比发现, 当NO2--N+NO3--N为氮源时, 菌株的同化效率和好氧反硝化效率均略高于以NO3--N为唯一氮源时的效率, 可能是由于在AD、ANRA或DNRA过程中, NO2--N的存在省去了NO3--N还原为NO2--N的过程.基于功能基因napA、nirS和nirK的扩增, 推测菌株WS1的代谢终产物为NO, N2O和N2可能是潜在终产物, 具体的气态氮类型还需进一步分析.
以NH4+-N+NO3--N为氮源时, 约有27.95%的初始氮转化为细胞氮, 显著低于NH4+-N为唯一氮源时的同化效率, 表明菌株WS1更偏好利用NH4+-N进行生长.49.98%的气态氮生成表明菌株可以通过HN-AD和AD作用将NH4+-N和NO3--N转化为气态氮, 基于氮平衡分析和功能基因扩增, 推测菌株WS1主要是通过HN-AD、AD和同化作用代谢NH4+-N和NO3--N.
菌株WS1对不同氮源的氮代谢路径如图 12所示.分析发现菌株WS1在低温好氧条件下主要通过HN-AD/AD和同化作用降解无机氮, 其中大部分的无机氮(47%~56%)通过菌株的HN-AD/AD作用转化为了气态氮, 表明该菌株在实际低温水处理中可有效减少污泥产量, 具备较高的应用价值.
|
图 12 菌株WS1的氮代谢路径 Fig. 12 Nitrogen metabolism pathways of strain WS1 |
(1) 从WWTPs活性污泥中筛选出1株具有耐低温特性的土著HN-AD细菌, 经分子生物学鉴定其为谷氨酸杆菌(Glutamicibacter), 并命名为Glutamicibacter sp. WS1, 该菌株的发现丰富了耐低温HN-AD微生物的菌种库.
(2) amoA、napA和nir基因的成功扩增, 从基因角度为菌株WS1具有HN和AD潜能提供了理论依据, 值得注意的是nirS和nirK基因共存于菌株WS1中.
(3) 菌株WS1在15℃具有高效的HN和AD能力, NH4+-N为氮源时, 菌株的平均硝化速率为1.26 mg·(L·h)-1; NO3--N为氮源时, 菌株的平均反硝化速率为1.11 mg·(L·h)-1.此外, 分别以NH4+-N、NO3--N、NO2--N+NO3--N和NH4+-N+NO3--N为氮源时, 菌株对各形态氮的去除率分别为100%、98.10%、99.87%+100%和100%+94.92%.
(4) 菌株WS1的最佳好氧反硝化条件：柠檬酸钠为碳源、C/N 16、pH 8、DO 4.5~6.8 mg·L-1和温度30℃.菌株WS1对温度和C/N具有较广的适应范围, 特别是在低温(15℃)和低C/N(10)条件下其对NO3--N的去除率仍可达到92.50%.
(5) 氮平衡分析结果表明, 菌株WS1对不同形态氮的去除方式均以HN-AD或AD为主, 其次为同化作用.
| [1] | Robertson L A, Kuenen J G. Aerobic denitrification-old wine in new bottles?[J]. Antonie Van Leeuwenhoek, 1984, 50(5): 525-544. |
| [2] | Chen H J, Zhou W Z, Zhu S N, et al. Biological nitrogen and phosphorus removal by a phosphorus-accumulating bacteria Acinetobacter sp. strain C-13 with the ability of heterotrophic nitrification-aerobic denitrification[J]. Bioresource Technology, 2021, 322. DOI:10.1016/j.biortech.2020.124507 |
| [3] | Yang T, Xin Y, Zhang L, et al. Characterization on the aerobic denitrification process of Bacillus strains[J]. Biomass and Bioenergy, 2020, 140. DOI:10.1016/j.biombioe.2020.105677 |
| [4] | Xie F X, Thiri M, Wang H. Simultaneous heterotrophic nitrification and aerobic denitrification by a novel isolated Pseudomonas mendocina X49[J]. Bioresource Technology, 2021, 319. DOI:10.1016/j.biortech.2020.124198 |
| [5] | Chen J L, Xu J, Zhang S N, et al. Nitrogen removal characteristics of a novel heterotrophic nitrification and aerobic denitrification bacteria, Alcaligenes faecalis strain WT14[J]. Journal of Environmental Management, 2021, 282. DOI:10.1016/j.jenvman.2021.111961 |
| [6] | Liu Y, Ai G M, Miao L L, et al. Marinobacter strain NNA5, a newly isolated and highly efficient aerobic denitrifier with zero N2O emission[J]. Bioresource Technology, 2016, 206: 9-15. DOI:10.1016/j.biortech.2016.01.066 |
| [7] | Hou P F, Sun X L, Fang Z M, et al. Simultaneous removal of phosphorous and nitrogen by ammonium assimilation and aerobic denitrification of novel phosphate-accumulating organism Pseudomonas chloritidismutans K14[J]. Bioresource Technology, 2021, 340. DOI:10.1016/j.biortech.2021.125621 |
| [8] | Lv P Y, Wei B H, Ma W K, et al. Nitrogen removal characteristics of a cold-tolerant aerobic denitrification bacterium, Pseudomonas sp. 41[J]. Catalysts, 2022, 12(4). DOI:10.3390/catal12040412 |
| [9] | Zhao T T, Chen P P, Zhang L J, et al. Heterotrophic nitrification and aerobic denitrification by a novel Acinetobacter sp. TAC-1 at low temperature and high ammonia nitrogen[J]. Bioresource Technology, 2021, 339. DOI:10.1016/j.biortech.2021.125620 |
| [10] | Yang Q, Yang T, Shi Y, et al. The nitrogen removal characterization of a cold-adapted bacterium: Bacillus simplex H-b[J]. Bioresource Technology, 2021, 323. DOI:10.1016/j.biortech.2020.124554 |
| [11] | Wei B H, Luo X, Ma W K, et al. Biological nitrogen removal and metabolic characteristics of a novel cold-resistant heterotrophic nitrification and aerobic denitrification Rhizobium sp. WS7[J]. Bioresource Technology, 2022, 362. DOI:10.1016/j.biortech.2022.127756 |
| [12] | Zhang N, Zhang Y T, Bohu T, et al. Nitrogen removal characteristics and constraints of an Alphaproteobacteria with potential for high nitrogen content heterotrophic nitrification-aerobic denitrification[J]. Microorganisms, 2022, 10(2). DOI:10.3390/microorganisms10020235 |
| [13] | Chen M P, Ding C Y, He T X, et al. Efficient hydroxylamine removal through heterotrophic nitrification by novel bacterium Glutamicibacter arilaitensis EM-H8[J]. Chemosphere, 2022, 288. DOI:10.1016/j.chemosphere.2021.132475 |
| [14] | Huang X J, Xu Y, He T X, et al. Ammonium transformed into nitrous oxide via nitric oxide by Pseudomonas putida Y-9 under aerobic conditions without hydroxylamine as intermediate[J]. Bioresource Technology, 2019, 277: 87-93. DOI:10.1016/j.biortech.2019.01.040 |
| [15] | Huang T L, Guo L, Zhang H H, et al. Nitrogen-removal efficiency of a novel aerobic denitrifying bacterium, Pseudomonas stutzeri strain ZF31, isolated from a drinking-water reservoir[J]. Bioresource Technology, 2015, 196: 209-216. DOI:10.1016/j.biortech.2015.07.059 |
| [16] | Xia L, Li X M, Fan W H, et al. Heterotrophic nitrification and aerobic denitrification by a novel Acinetobacter sp. ND7 isolated from municipal activated sludge[J]. Bioresource Technology, 2020, 301. DOI:10.1016/j.biortech.2020.122749 |
| [17] | Ruan Y J, Taherzadeh M J, Kong D D, et al. Nitrogen removal performance and metabolic pathways analysis of a novel aerobic denitrifying halotolerant Pseudomonas balearica strain RAD-17[J]. Microorganisms, 2020, 8(1). DOI:10.3390/microorganisms8010072 |
| [18] | Throbäck I N, Enwall K, Jarvis Å, et al. Reassessing PCR primers targeting nirS, nirK and nosZ genes for community surveys of denitrifying bacteria with DGGE[J]. FEMS Microbiology Ecology, 2004, 49(3): 401-417. DOI:10.1016/j.femsec.2004.04.011 |
| [19] | Ke X, Liu C, Tang S Q, et al. Characterization of Acinetobacter indicus ZJB20129 for heterotrophic nitrification and aerobic denitrification isolated from an urban sewage treatment plant[J]. Bioresource Technology, 2022, 347. DOI:10.1016/j.biortech.2021.126423 |
| [20] | Cui Y, Cui Y W, Huang J L. A novel halophilic Exiguobacterium mexicanum strain removes nitrogen from saline wastewater via heterotrophic nitrification and aerobic denitrification[J]. Bioresource Technology, 2021, 333. DOI:10.1016/j.biortech.2021.125189 |
| [21] | Deng M, Zhao X L, Senbati Y, et al. Nitrogen removal by heterotrophic nitrifying and aerobic denitrifying bacterium Pseudomonas sp. DM02: Removal performance, mechanism and immobilized application for real aquaculture wastewater treatment[J]. Bioresource Technology, 2021, 322. DOI:10.1016/j.biortech.2020.124555 |
| [22] | Ren J L, Wei C Z, Ma H J, et al. The nitrogen-removal efficiency of a novel high-efficiency salt-tolerant aerobic denitrifier, Halomonas alkaliphile HRL-9, isolated from a seawater biofilter[J]. International Journal of Environmental Research and Public Health, 2019, 16(22). DOI:10.3390/ijerph16224451 |
| [23] | Huang F, Pan L Q, Lv N, et al. Characterization of novel Bacillus strain N31 from mariculture water capable of halophilic heterotrophic nitrification-aerobic denitrification[J]. Journal of Bioscience and Bioengineering, 2017, 124(5): 564-571. DOI:10.1016/j.jbiosc.2017.06.008 |
| [24] | Jang J, Ashida N, Kai A, et al. Presence of Cu-Type (NirK) and cd1-Type (NirS) nitrite reductase genes in the denitrifying bacterium Bradyrhizobium nitroreducens sp. nov[J]. Microbes and Environments, 2018, 33(3): 326-331. DOI:10.1264/jsme2.ME18039 |
| [25] |
文刚, 王彤, 黄廷林, 等. 贫营养好氧反硝化菌株的脱氮特性及氮/碳平衡分析[J]. 环境科学, 2020, 41(5): 2339-2348. Wen G, Wang T, Huang T L, et al. Nitrogen removal performance and nitrogen/carbon balance of oligotrophic aerobic denitrifiers[J]. Environmental Science, 2020, 41(5): 2339-2348. |
| [26] | Zhang D Y, Liu Y, Han Y X, et al. Nitrate removal from low C/N wastewater at low temperature by immobilized Pseudomonas sp. Y39-6 with versatile nitrate metabolism pathways[J]. Bioresource Technology, 2021, 326. DOI:10.1016/j.biortech.2021.124794 |
| [27] | Xi H P, Zhou X T, Arslan M, et al. Heterotrophic nitrification and aerobic denitrification process: promising but a long way to go in the wastewater treatment[J]. Science of the Total Environment, 2022, 805. DOI:10.1016/j.scitotenv.2021.150212 |
| [28] | Li Y T, Wang Y R, Fu L, et al. Aerobic-heterotrophic nitrogen removal through nitrate reduction and ammonium assimilation by marine bacterium Vibrio sp. Y1-5[J]. Bioresource Technology, 2017, 230: 103-111. DOI:10.1016/j.biortech.2017.01.049 |
| [29] | Wang X J, Wang W Q, Zhang Y, et al. Simultaneous nitrification and denitrification by a novel isolated Pseudomonas sp. JQ-H3 using polycaprolactone as carbon source[J]. Bioresource Technology, 2019, 288. DOI:10.1016/j.biortech.2019.121506 |
| [30] | Barathi S, Meng Y B, Yu Z, et al. Roles of nitrite in mediating the composition and metacommunity of multispecies biofilms[J]. Journal of Water Process Engineering, 2021, 40. DOI:10.1016/j.jwpe.2020.101764 |
| [31] | Ren J L, Bai X Y, Liu Y C, et al. Simultaneous nitrification and aerobic denitrification by a novel isolated Ochrobactrum anthropi HND19[J]. Bioresource Technology, 2021, 340. DOI:10.1016/j.biortech.2021.125582 |
| [32] | Yang J R, Wang Y, Chen H, et al. Ammonium removal characteristics of an acid-resistant bacterium Acinetobacter sp. JR1 from pharmaceutical wastewater capable of heterotrophic nitrification-aerobic denitrification[J]. Bioresource Technology, 2019, 274: 56-64. DOI:10.1016/j.biortech.2018.10.052 |
| [33] |
蔡茜, 何腾霞, 冶青, 等. 耐冷嗜碱蒙氏假单胞菌H97的鉴定及其好氧反硝化特性[J]. 环境科学, 2018, 39(7): 3314-3320. Cai X, He T X, Ye Q, et al. Identification and characterization of a hypothermic alkaliphilic aerobic denitrifying bacterium Pseudomonas monteilii strain H97[J]. Environmental Science, 2018, 39(7): 3314-3320. |
| [34] | Zhao K, Tian X L, Li H D, et al. Characterization of a novel marine origin aerobic nitrifying-denitrifying bacterium isolated from shrimp culture ponds[J]. Aquaculture Research, 2019, 50(7): 1770-1781. DOI:10.1111/are.14055 |
| [35] | Kim M, Jeong S Y, Yoon S J, et al. Aerobic denitrification of Pseudomonas putida AD-21 at different C/N ratios[J]. Journal of Bioscience and Bioengineering, 2008, 106(5): 498-502. DOI:10.1263/jbb.106.498 |
| [36] | Yang L, Wang X H, Cui S, et al. Simultaneous removal of nitrogen and phosphorous by heterotrophic nitrification-aerobic denitrification of a metal resistant bacterium Pseudomonas putida strain NP5[J]. Bioresource Technology, 2019, 285. DOI:10.1016/j.biortech.2019.121360 |
| [37] |
白洁, 陈琳, 黄潇, 等. 1株耐盐异养硝化-好氧反硝化菌Zobellella sp. B307的分离及脱氮特性[J]. 环境科学, 2018, 39(10): 4793-4801. Bai J, Chen L, Huang X, et al. Isolation and nitrogen removal characteristics of salt-tolerant heterotrophic nitrification and aerobic denitrification bacteria Zobellella sp. B307[J]. Environmental Science, 2018, 39(10): 4793-4801. |
| [38] | Zhao B, Cheng D Y, Tan P, et al. Characterization of an aerobic denitrifier Pseudomonas stutzeri strain XL-2 to achieve efficient nitrate removal[J]. Bioresource Technology, 2018, 250: 564-573. DOI:10.1016/j.biortech.2017.11.038 |
| [39] | Ren Y X, Yang L, Liang X. The characteristics of a novel heterotrophic nitrifying and aerobic denitrifying bacterium, Acinetobacter junii YB[J]. Bioresource Technology, 2014, 171: 1-9. DOI:10.1016/j.biortech.2014.08.058 |
| [40] | Song T, Zhang X L, Li J, et al. A review of research progress of heterotrophic nitrification and aerobic denitrification microorganisms (HNADMs)[J]. Science of the Total Environment, 2021, 801. DOI:10.1016/j.scitotenv.2021.149319 |
| [41] | Zheng M S, He D, Ma T, et al. Reducing NO and N2O emission during aerobic denitrification by newly isolated Pseudomonas stutzeri PCN-1[J]. Bioresource Technology, 2014, 162: 80-88. DOI:10.1016/j.biortech.2014.03.125 |
| [42] | Ren J L, Ma H J, Liu Y, et al. Characterization of a novel marine aerobic denitrifier Vibrio spp. AD2 for efficient nitrate reduction without nitrite accumulation[J]. Environmental Science and Pollution Research, 2021, 28(24): 30807-30820. DOI:10.1007/s11356-021-12673-8 |
| [43] | Huang H K, Tseng S K. Nitrate reduction by Citrobacter diversus under aerobic environment[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2001, 55(1): 90-94. DOI:10.1007/s002530000363 |
| [44] |
高宇轩, 靳静晨, 徐利杉, 等. 耐盐异养硝化-好氧反硝化菌Bacillus megatherium N07的分离及脱氮特性[J]. 生物技术通报, 2022, 38(7): 247-257. Gao Y X, Jin J C, Xu L S, et al. Isolation of halophilic heterotrophic nitrification-aerobic denitrification bacterium Bacillus megatherium N07 and its denitrification characteristics[J]. Biotechnology Bulletin, 2022, 38(7): 247-257. |
| [45] | Fan Y Y, Su J F, Zheng Z J, et al. Denitrification performance and mechanism of a novel isolated Acinetobacter sp. FYF8 in oligotrophic ecosystem[J]. Bioresource Technology, 2021, 320. DOI:10.1016/j.biortech.2020.124280 |