2. 广东省农业农村污染治理与环境安全重点实验室, 广州 510642;
3. 深圳市源清环境科技服务有限公司, 深圳 518000
2. Guangdong Provincial Key Laboratory of Agricultural & Rural Pollution Abatement and Environmental Safety, Guangzhou 510642, China;
3. Shenzhen Yuanqing Environment Technology Service Co., Ltd., Shenzhen 518000, China
畜禽粪肥还田是推动农业绿色低碳发展、改善农村生态环境、实现乡村振兴战略和“双碳”目标的重要举措.抗生素是畜禽粪肥中普遍存在的典型污染物, 长期大量施用畜禽粪肥势必会向农田生态系统输入大量外源抗生素[1, 2].蔬菜生产基地强调有机肥的施用, 较高的复种指数和施肥频率导致蔬菜基地土壤抗生素污染尤为严重[3~5].畜禽粪肥常施于土壤表层, 而蔬菜根系主要生长于土壤表层, 且生长周期较短, 更容易受畜禽粪肥还田引起的抗生素污染.
TCs在畜禽粪肥和蔬菜基地土壤中被普遍检出且含量较高[6~8].TCs污染不仅会破坏土壤环境中的微生物群落[9, 10], 还会影响蔬菜的生长[11], 甚至被蔬菜吸收累积[12~14], 从而严重威胁蔬菜安全和土壤生态安全.目前针对TCs对蔬菜安全和土壤生态安全的研究主要采用盆栽模拟试验[11~14]或田间调查[3, 5, 8, 15~17]的研究方法, 较少开展田间试验[18].虽然可以较方便地改变或控制试验条件, 但盆栽试验在土壤团聚体数量和结构, 以及蔬菜生长环境等方面均与田间实际情况生产存在一定的差异[19], 从而不能真实反映田间实际生产情况.与田间调查研究方法相比, 田间试验研究方法通过进行局部控制, 从而具有在较小地段内试验环境条件等非处理因素较易控制的优点.
因此, 本文结合盆栽试验和田间试验的研究方法, 采用当地农户习惯性施肥方式, 调查畜禽粪肥还田引起的3种主要TCs[四环素(TC)、土霉素(OTC)和金霉素(CTC)]在土壤-蔬菜系统中的分布特征; 并采用ADI-HQ和SSD-RQ分别对蔬菜可食部分TCs污染的人体健康风险和土壤TCs污染的生态风险进行评估, 通过系统和真实地掌握畜禽粪肥还田时3种主要TCs对农产品安全和土壤生态安全的影响, 旨在为畜禽粪肥的安全利用和环境风险控制提供科学依据.
1 材料与方法 1.1 盆栽试验方案盆栽试验土壤取自田间试验地点(27°09′59″N, 113°37′45″E).其pH为6.84, ω(有机质)为18.5 g·kg-1, ω(碱解氮)为118.2 mg·kg-1, ω(有效磷)为117.9 mg·kg-1, ω(速效钾)为79.3 mg·kg-1; 土壤沙粒(>0.05 mm)、粉粒(0.01~0.05 mm)和黏粒(< 0.01 mm)占比分别为34%、44%和22%; 未检出TC、OTC和CTC.供试畜禽粪肥取自广州市某现代化生猪养殖企业, ω(TC)、ω(OTC)和ω(CTC)分别为16.9、107.9和54.2 mg·kg-1.供试蔬菜品种为菜心(Brassica parachinensis), 其种子购自广东省农业科学研究院.
盆栽试验在华南农业大学网室进行, 每盆用土5 kg.设置2个畜禽粪肥施用水平(P1和P2), P1为50 g·pot-1[参照田间试验施用水平, 并根据土壤容重(1.12 g·cm-3)计算得到], P2为P1的130%, 即65 g·pot-1.对照处理(CK-P)不施畜禽粪肥, 施用复合肥(N ∶P ∶K=15 ∶15 ∶15)2.20 g·pot-1.畜禽粪肥和复合肥均采用拌施方式, 在种植前与土壤混合均匀.以理论计算得出盆栽前土壤中3种TCs含量, ω(TC)、ω(OTC)和ω(CTC)分别为169、1 079和542 μg·kg-1(P1), 219.7、1 402.7和704.6 μg·kg-1(P2).每个处理设3个重复.
1.2 田间试验方案田间试验地点位于华南农业大学农场.小区面积为2 m×2.5 m, 设置施用畜禽粪肥处理(F)和对照处理(CK-F).畜禽粪肥施用量参考珠三角蔬菜基地习惯性施肥水平[2.2 kg·(m2×茬)-1], 即11 kg·plot-1; 对照处理不施畜禽粪肥, 施用复合肥(N ∶P ∶K=15 ∶15 ∶15)500 g·plot-1, 参照《广东省2020年主要农作物科学施肥意见》.畜禽粪肥以基肥的形式在种植前一次性撒施于土壤表层, 然后进行人工翻土覆盖; 复合肥则分别作为基肥和3次追肥撒施或浇施.每个处理设3个重复.
1.3 试验管理与样品采集施肥当天(2018年12月30日), 采用移栽方式移植菜心幼苗(4~5片真叶).盆栽试验移苗为3株·pot-1, 田间试验的移植密度按农户种植习惯.整个盆栽期间用蒸馏水进行浇灌, 保持田间持水量的50% ~60%, 避免产生渗漏; 整个田间试验期间用自来水进行浇灌, 根据天气情况和菜心长势每天浇水1~2次, 保持田间持水量的50% ~70%.分别于29 d和33 d后(约75%的菜心保持抽薹)收获盆栽试验和田间试验, 采集菜心和土壤样品.
1.4 样品中TCs的提取、测定与质量控制采用HLB小柱对土壤、植物和畜禽粪肥样品TCs进行提取, 采用高效液相色谱-三重四极杆串联质谱(HPLC-MS-MS)对提取液中TCs进行检测.样品中TCs的提取和仪器分析详细步骤见文献[16].
在样品的提取与仪器检测过程中进行相应的程序空白、分析空白、空白加标、样品加标、检测限、定量限和标准曲线等质量控制和质量保证措施.程序空白和分析空白样品中均未检出TCs; 样品中3种TCs加标回收率、检测限、定量限和标准曲线相关系数见表 1.文中所呈现的TCs数据均未经回收率校正.
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表 1 样品中3种TCs加标回收率、检测限、定量限和标准曲线相关系数1) Table 1 Recovery rate, limits of detection and quantification, and correlation coefficient of standard curve of three TCs in samples |
1.5 生物富集系数(BCF)和转运系数(TF)的计算方法
BCF是指生物体中污染物的含量与其生长环境中的含量之比, 是用来评价生物对环境污染物的富集作用的一种指标.菜心地上部和地下部对土壤中3种TCs的BCFs可按公式(1)进行计算.
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(1) |
TF是指植物地上部污染物浓度与地下部污染物浓度的比值, 是用来评价植物将污染物从地下部向地上部的运输和富集能力的一种指标.菜心对3种TCs的TF可按公式(2)进行计算.
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(2) |
本文采用ADI-HQ法对菜心可食部分TCs污染进行人体健康风险评估, 即每日摄入剂量(ADD)与每日允许摄入量(ADI)的比值, 其计算见公式(3).
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(3) |
式中, ADI表示日允许摄入量, TC、OTC和CTC的日允许摄入量分别为5.7、5和10 μg·(kg·d)-1[20]; ADD可通过公式(4)计算得到.
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(4) |
式中, cv表示蔬菜中单一TCs含量, mg·kg-1; IR表示蔬菜日摄入量, 成人和儿童分别为500 g·d-1和300 g·d-1[21]; BW表示体重, 成人和儿童分别为65 kg和25 kg.
当HQ≤0.1, 为低风险; 0.1 < HQ < 1, 为中风险; HQ≥1, 为高风险.
1.6.2 土壤TCs污染的生态风险评估本文采用SSD-RQ法对土壤TCs残留进行生态风险评估, 即测定环境浓度(MEC)与预测无效应浓度(PNEC)的比值, 其计算见公式(5).
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(5) |
式中, MEC为测定环境含量, 即测定土壤TCs含量, μg·kg-1; PNECwater可通过公式(6)计算得到.
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(6) |
式中, AF参考《欧盟风险评价技术指南》, 本文取值为5; HC5(hazardous concentration for 5% the species)可以采用物种敏感分布法(species sensitivity distributions, SSD)获得.SSD曲线的构建:第一步, 毒性数据的获取与筛选; 第二步, 模型选择与SSD曲线的构建拟合; 第三步, HC5的计算.SSD曲线的具体构建方法见文献[16].
当RQ≤0.1, 为低风险; 0.1 < RQ < 1, 为中风险; RQ≥1, 为高风险.
1.7 数据处理文中所有数据均为平均值±标准误(n=3); 利用统计分析软件SPSS 22进行了单因素方差分析(one-way ANOVA), 处理间差异显著性比较采用Duncan's多重比较(P=0.05)和t检验.
2 结果与讨论 2.1 菜心地上部和地下部的生物量盆栽试验和田间试验菜心均长势良好.盆栽试验各处理地上部生物量约为110 g·pot-1(表 2), 处理间无显著差异(P>0.05, 下同); 然而高水平施肥量处理(P2)地下部生物量显著高于对照处理(CK-P)和低水平施肥处理(P1)(P < 0.05, 下同).田间试验施用畜禽粪肥处理(F)地上部生物量为8 086 g·plot-1, 显著高于对照处理(CK-F).与对照处理(CK-F)相比, 施用畜禽粪肥处理(F)地上部和地下部生物量分别增加17.5%和7.8%, 说明施用畜禽粪肥在一定程度上能促进菜心生长.
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表 2 盆栽试验和田间试验菜心地上部和地下部生物量1) Table 2 Biomass of aboveground and underground parts of Chinese flowering cabbage under pot and field experiments |
2.2 菜心对TCs的吸收累积特征
盆栽试验和田间试验的对照处理(CK-P和CK-F)菜心植株地上部和地下部均未检测出3种TCs, 而施用畜禽粪肥处理菜心植株地上部和地下部均检测出3种TCs(图 1), 说明菜心可以吸收累积畜禽粪肥还田引入的TCs.且盆栽试验菜心地上部和地下部3种TCs含量随土壤TCs初始含量的增加而增加; 地下部3种TCs含量高于地上部[图 1(b)], 其TF值均小于1.0(表 3), 说明菜心对畜禽粪肥还田引起的土壤TCs污染主要累积于菜心根部, 这与已有研究的结果一致[12~14, 22].
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采用Duncan's多重比较对菜心地上部和地下部TCs含量进行显著性差异分析, 同一处理具有相同小写字母表示差异不显著(P>0.05) 图 1 菜心地上部和地下部3种TCs含量 Fig. 1 Three tetracycline antibiotic contents in aboveground part and underground part of Chinese flowering cabbage |
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表 3 菜心对土壤中3种TCs的富集系数(BCF)和转运系数(TF) Table 3 Bioconcentration factors (BCFs) and translocation factors (TFs) of three tetracycline antibiotics for Chinese flowering cabbage |
结果显示[图 1(a)], 盆栽试验菜心地上部(以干重计)ω(TC)、ω(OTC)和ω(CTC)分别为5.93~6.87、24.04~29.25和2.18~4.37 μg·kg-1, 远低于贺德春等[12]、迟荪琳等[13]和王卫中等[14]对萝卜、小白菜和生菜的研究结果, 这可能主要是因为本文盆栽试验土壤3种TCs含量远低于已有研究设置水平(≥5 mg·kg-1).本文盆栽试验菜心地上部TCs含量也低于Sun等[9]和Kumar等[23]研究的结果, 当土壤ω(TCs)为1 mg·kg-1时, 卷心菜、莴苣和菠菜(以鲜重计)中ω(OTC)介于180~550 μg·kg-1[9]; 洋葱和卷心菜(以鲜重计)中ω(CTC)介于2.0~11.0 μg·kg-1[23].但高于刘娣[24]的研究, 当土壤ω(TCs)为20 mg·kg-1时, 一个月后小白菜茎叶(以干重计)中ω(TC)和ω(CTC)仅为2.0~4.0 μg·kg-1.因此, 与已有蔬菜吸收累积TCs的研究报道相比, 本文盆栽试验菜心地上部3种TCs含量处于较低水平.同时, 本文盆栽试验菜心地上部3种TCs含量也低于粮食作物玉米[23, 25].
盆栽试验菜心地上部3种TCs含量高低顺序为:OTC>TC>CTC.其中OTC含量显著高于TC和CTC, 这可能是因为试验土壤OTC的初始含量远高于TC和CTC(见1.1节); 菜心地上部和地下部TC含量高于CTC, 而土壤TC初始含量低于CTC, 说明TC更容易被菜心吸收累积.BCF结果显示(表 3), 菜心地上部和地下部对TC和OTC的BCF值接近, 二者高于CTC的BCF值(TC≈OTC>CTC), 与生菜和小白菜对3种TCs的BCF大小顺序不一致(CTC>OTC≈TC)[11, 12].本文菜心对CTC的BCF≤0.05, 与生菜和小白菜一致; 对TC和OTC的BCF介于0.05~0.07, 高于生菜和小白菜[11, 12].已有研究表明, 蔬菜对TCs的吸收累积不仅受土壤TCs初始含量的影响[12~14], 还与蔬菜品种和TCs种类密切相关.如, Ahmed等[26]对比研究了黄瓜、番茄和生菜对TCs的吸收累积情况, 结果表明, 番茄茎叶和果实中均是OTC含量最高, 生菜茎叶中是CTC含量最高; 而黄瓜茎叶和果实中3种TCs含量高低顺序则与TCs种类相关.
田间试验菜心地上部(以干重计)ω(TCs)介于10.59~45.03 μg·kg-1.Kang等[18]采用田间试验方法调查11种蔬菜对稻草与鸡粪/猪粪堆肥中CTC的吸收情况, 蔬菜ω(CTC)不超过2.0 μg·kg-1, 大部分样品ω(CTC)低于0.5 μg·kg-1, 低于本研究田间试验菜心地上部ω(CTC)为22.52 μg·kg-1, 这可能是因为本研究土壤CTC的初始含量(540 μg·kg-1)高于Kang等[18]的研究(≤72.6 μg·kg-1, 大部分≤1 μg·kg-1).与田间调查文献相比, 本文田间试验菜心TCs含量高于珠三角污灌区蔬菜(4.0~10.1 μg·kg-1)[27]和施用畜禽粪肥蔬菜ω(OTC)和ω(CTC)(分别为0.29 μg·kg-1和0.10 μg·kg-1)[16].
与盆栽试验结果相比, 田间试验菜心地上部和地下部3种TCs含量显著高于盆栽试验(图 1).这可能是因为:第一, 蔬菜对TCs的吸收累积程度随环境含量的升高而增加[22], 而本文田间试验土壤TCs残留含量高于盆栽试验(原因分析见2.3节); 第二, 作物对土壤/溶液中TCs的吸收累积是一个通过胞外运输的主动过程, 受蒸腾作用大小的影响[28, 29].本文田间试验开放环境下的菜心蒸腾作用大于盆栽试验半封闭网室, 更有利于菜心对土壤TCs的吸收和转运.田间试验菜心TF值小于盆栽试验(表 3), 说明与盆栽试验相比, 田间试验菜心地下部TCs含量增加程度大于地上部, 这可能是因为田间试验土壤TCs的生物有效性高于研磨过筛的盆栽试验.
2.3 土壤中TCs的残留特征盆栽试验和田间试验的对照处理(CK-P和CK-F)土壤中均未检出3种TCs, 而施用畜禽粪肥处理土壤均检测出3种TCs(表 4), 说明施用含有TCs的畜禽粪肥会导致土壤TCs污染.盆栽试验土壤ω(TC)、ω(OTC)和ω(CTC)分别介于85.27~174.08、410.94~1 013.68和163.81~313.11 μg·kg-1, 介于国内长期施用畜禽粪肥蔬菜基地土壤TCs污染残留含量范围[16, 30, 31].
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表 4 土壤中3种TCs残留含量及降解率1) Table 4 Residual concentrations and degradation rate of three tetracycline antibiotics in soil |
3种TCs残留含量高低趋势与所施用畜禽粪肥中3种TCs含量高低趋势一致, 即:OTC>CTC>TC, 且三者之间差异显著, 其中OTC含量占3种TCs残留总含量的60%以上.这与本课题组前期对广州市北郊和珠三角典型蔬菜基地土壤3种TCs污染调查结果一致[15, 16], 也与Li等[32]对珠三角典型蔬菜基地土壤3种TCs污染调查结果一致, 从而也进一步说明OTC是珠三角农田土壤主要的TCs污染物.
田间试验土壤3种TCs残留含量高低趋势与盆栽试验结果一致, 但田间试验土壤TCs残留含量显著高于盆栽试验.这可能主要是由于本研究试验在冬季进行, 盆栽试验场所为半封闭网室, 其温度高于田间试验开放场所, 从而更有利于TCs的降解.有研究表明, 高温的夏季土壤中TC、CTC和OTC的检出率和含量均低于低温的冬季[33].
盆栽试验土壤TCs渗漏量和菜心对TCs的累积量(< 0.1%)均可忽略不计, 土壤TCs的环境行为主要包括吸附残留和降解, 从而可通过计算残留率而获得3种TCs在土壤中的降解率(表 4).而田间试验土壤TCs的环境行为不仅包括吸附残留和降解, 还有可能通过径流迁出土体, 以及通过渗流迁往更深的次表层土壤[34], 因此, 无法通过计算残留率而获得3种TCs在土壤中的降解率.从表 4可知, 盆栽试验土壤3种TCs降解率高低顺序为:CTC>OTC>TC.TC的降解率最低, 这可能是因为TC的lgKd相对较大, 生物降解率相对较低[35]; OTC的lgKd小于CTC, 但其降解率却显著低于CTC, 与文献[36]对畜禽粪便中CTC和OTC降解研究的结果一致.土壤中3种TCs降解率介于40% ~70%, 低于刘娣[24]研究的结果, 但也说明TCs在土壤环境中不难降解.因此, 随畜禽粪肥引起的土壤TCs污染对短生长周期的作物的影响更应引起关注.
2.4 风险评估 2.4.1 菜心可食部分TCs污染的健康风险盆栽试验和田间试验菜心可食部分(地上部)TCs污染对成年人和儿童的危害商值见图 2.
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图 2 菜心中3种TCs健康风险商值(HQ) Fig. 2 Health risk assessment (HQ) values for three tetracycline antibiotics in Chinese flowering cabbage |
盆栽试验菜心TCs污染对成人[图 2(a)]和儿童[图 2(b)]的人体健康危害商值趋势一致, 3种TCs的HQ值大小顺序为OTC>TC>CTC, 且随畜禽粪肥施用量的增加而升高, 但均属于低风险(HQ≤0.1).田间试验菜心TCs污染对成人和儿童的人体健康风险商值均高于盆栽试验, 且3种TCs的HQ值大小顺序与盆栽试验不一致, 为OTC>TC≈CTC.其中TC和CTC对成年人和儿童的HQ≤0.1, 为低风险; OTC对成年人的HQ≤0.1, 为低风险, 但对儿童的HQ超过0.1, 为中风险.
目前, 农产品污染对人体的非致癌健康风险评估主要采用规定允许最大残留浓度(MRL)对比法和ADI值对比法.我国暂时没有规定蔬菜中TCs的MRL, 但规定了动物性食品中3种TCs的MRL为100 μg·kg-1; 世界卫生组织规定3种TCs的ADI值为30 μg·(kg·d)-1.有研究采用此方法, 通过对比蔬菜中TCs实测含量是否超过100 μg·kg-1和计算ADD值是否超过1 800 μg·d-1[30 μg·(kg·d)-1×60 kg=1 800 μg·d-1, 世界卫生组织成年人平均体重为60 kg]来确定蔬菜是否存在健康风险[16, 18, 37], 结果表明, 蔬菜TCs污染的健康风险较低.与以上已有报道相比, 本文选用了更严格的标准, 参照文献[20], 选用TC、OTC和CTC的ADI值分别为5.7、5和10 μg·(kg·d)-1; 同时, 调整人体健康风险等级的划分标准, 当HQ>0.1时, 即存在中风险.因此, 本文菜心TCs污染对人体健康风险等级也相应会高于文献[16, 18, 37]的报道.
2.4.2 土壤TCs残留的生态风险目前, 除参考兽药国际协调筹划指导委员会给出的生态毒害效应触发值(100 μg·kg-1)来评价土壤中TC的污染以外[7], 评价因子-风险商值法(RAF-RQ)也是目前土壤中抗生素污染评价的常用方法之一[6, 8, 15, 17].RAF虽然运用简单, 操作性强, 但RAF法只考虑了污染物最敏感物种与其在某一条件下的毒性数据, 定性评价结果的不确定性较高.SSD基于不同物种对同一污染物敏感性的差异, 以多个有代表性敏感物种的急性或慢性毒性数据为基础, 选择统计分布并构建相应污染物的SSD曲线, 评估实测环境浓度下污染物对生态系统的风险.该方法要求所选物种需要囊括3个营养级(藻类、真菌、土壤动物和植物), 物种个数不少于5个.虽然操作复杂, 但由于所选生物物种营养级和个数均较多, 从而能提高污染物风险评估结果的科学性[38].
本文采用课题组已构建的土壤3种TCs的SSD曲线[16], 对施用畜禽粪肥引起的土壤中3种TCs污染进行生态风险评估, 结果见图 3.盆栽试验土壤3种TCs的RQ值大小顺序为:OTC>TC≈CTC, 且随畜禽粪肥施用量的增加而升高.P1处理OTC和P2处理TC与CTC的RQ均大于0.1, 属于中风险; P2处理OTC的RQ大于1.0, 属于高风险.田间试验土壤TCs的RQ值高于盆栽试验土壤, 3种TCs的RQ值大小顺序与盆栽试验相似, 即OTC>TC≈CTC.其中, TC和CTC的RQ大于0.1, 属于中风险; OTC的RQ大于1.0, 属于高风险.本文关于土壤TCs残留的生态风险研究结果高于本课题组前期对珠三角典型蔬菜基地土壤TCs污染生态风险评估的调查结果[16], 这可能是由于本试验中畜禽粪肥3种TCs含量较高, ω(TC)、ω(OTC)和ω(CTC)分别为16.9、107.9和54.2 mg·kg-1, 高于本课题组前期对珠三角典型蔬菜基地有机肥(畜禽粪肥简单堆制而成)的含量水平[16], 但与国彬[39]对广州市22个养殖厂的畜禽粪肥的调查结果基本在同一含量水平.因此, 畜禽粪肥还田引入的土壤TCs污染的生态风险不可忽视.
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图 3 土壤3种TCs的生态风险商值(RQ) Fig. 3 Ecological risk assessment (RQ) values for three tetracycline antibiotics in soil |
(1) 盆栽试验和田间试验菜心地上部和地下部TCs含量均以OTC为主; 盆栽试验和田间试验菜心地上部(以干重计)ω(OTC)分别高达29.25 μg·kg-1和45.03 μg·kg-1, 地下部含量(以干重计)ω(OTC)分别高达87.32 μg·kg-1和135.44 μg·kg-1; 且田间试验菜心地上部和地下部3种TCs含量均显著高于盆栽试验.
(2) 土壤TCs的残留以OTC为主, 盆栽试验和田间试验土壤ω(OTC)分别高达604.30 μg·kg-1和1 013.68 μg·kg-1; 3种TCs在田间试验土壤残留含量显著高于盆栽试验.
(3) 试验条件下, 除田间试验菜心OTC含量对儿童的人体健康具有中风险外(HQ>0.1), 其它处理菜心3种TCs含量对成年人和儿童的人体健康风险均较低(HQ≤0.1); 盆栽试验和田间试验土壤3种TCs残留均具有中等或高生态风险(HQ>0.1或HQ>1).
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