土壤微生物作为土壤中最活跃的部分, 其群落对土壤改良措施极其敏感, 为了应对环境变化, 土壤微生物群落组成结构、活性和多样性均会有所改变, 土壤物质和能量交换及循环等过程, 也直接受土壤微生物新陈代谢的影响[1], 其活动还和土壤养分转化密切相关, 维持土壤肥力的同时还能通过分解腐殖质来调节生态[2].其中, 土壤真菌通过分解土壤中的动植物残体, 来平衡土壤能量流动和养分转化等土壤生态过程, 在维持生态系统功能和生态系统健康方面发挥重要功能[3].土壤环境的细微改变都将引起真菌群落结构和多样性的变化[4].因此, 真菌是评价土壤健康和安全状况的响应物种之一, 其群落结构和多样性具有指示土壤肥力的作用.
土壤退化是一个全球性环境问题, 人们对土壤改良进行了许多探索, 关于土壤改良方面的措施如有机肥、生物炭和微生物肥等均有报道[5~7].这些措施对土壤理化性质和酶活性等均有重要影响, 相应的土壤真菌群落结构和多样性也发生显著变化.施加有机肥可通过改善土壤状况, 在一定程度上促进营养物质循环, 缓解土壤养分不均衡现象, 减少病害风险, 并调节土壤真菌群落结构, 提高土壤真菌群落丰富度[8~10].生物炭施入土壤后可促进土壤真菌的大量繁殖, 提高土壤真菌的活性, 其丰富的孔隙结构也为土壤真菌提供了栖息环境[11, 12].微生物肥能够改善土壤质量, 具有使用安全方便、不污染环境、促进碳氮循环的独特优势[13].微生物肥对土壤真菌多样性起到调节作用.提高根围土中真菌群落的丰富度的同时, 还改变了真菌群落的结构[14, 15].
在我国南方红壤区, 分布着大面积的侵蚀退化林地, 这类林地土壤具有有机质含量低、酸性强、肥力低、黏重板结和保水保肥性能差等特点, 因而植被稀疏, 水土流失问题严重.有机肥、生物炭和微生物肥等对退化林地土壤改良, 植被生态恢复具有较大潜力.而真菌群落结构和多样性可以很好地表征土壤肥力.但目前关于有机肥、生物炭和微生物肥对退化林地表土真菌的影响研究较少, 其对真菌群落的不同调控作用尚需进一步明晰.因此, 本研究采用Illumina MiSeq高通量测序技术揭示侵蚀退化林地土壤表层真菌群落结构对有机肥、生物炭和石灰+微生物肥料这3种土壤改良措施的响应, 以期为南方红壤区侵蚀退化林地植被生态恢复提供科学指导及理论支撑.
1 材料与方法 1.1 研究区概况试验地位于江西省吉安市泰和县老虎山小流域, 土壤为第四纪红色黏土发育而成的红壤, 厚度一般为3~40 cm; 试验地属中亚热带湿润季风气候, 多年平均雨量为1 363 mm.平均气温为18.6℃, 海拔在80~200 m之间, 境内丘坡平缓, 坡度多在5°左右.
1.2 试验设计与样品采集2016年8月, 于江西省吉安市泰和县(水土保持站)老虎山小流域内选取坡向(东北)和坡度一致、地表裸露的马尾松(Pinus massoniana)林地, 在其内随机布设4个10 m×10 m样地, 设置对照(CK处理):不施加任何肥料; 施加生物炭(B处理):360 kg·hm-2, 等高条带开沟5~10 cm并拌土回填, 生物炭购于宜春市丰城宁能生物质发电有限公司, 原料为水稻秸秆, 采用连续立式生物质化炉生产, 炭化温度为450℃.生物炭的基本性质为pH 10.4, ω(有机碳) 467.0 g·kg-1, ω(全氮) 5.90 g·kg-1, ω(全磷) 1.50 g·kg-1, ω(全钾) 29.50 g·kg-1; 施加有机肥(A处理):360 kg·hm-2, 等高条带开沟5~10 cm并拌土回填, 有机肥为当地的油菜枯饼, 该有机肥含ω(有机质)70.3%, ω(全氮)5.01%, ω(五氧化二磷)1.08%, ω(氧化钾)1.82%; 施加石灰+微生物肥(T处理):360 kg·hm-2, 先施加石灰后再施加微生物肥, 等高条带开沟5~10 cm并拌土回填.微生物肥料购买于江苏新天地生物肥料工程中心有限公司, 是南京农业大学植物营养与肥料系研制的专用微生物肥料-Bio抗土传病高效生物肥, 每g肥料抗病菌种有效活菌数≥5, ω(有机质)≥25%, ω(氮+磷+钾)≥6%这4种处理, 之后不再施肥, 每种处理设置3个重复.
于2020年8月采集土壤样品.取样时在条带状开沟处, 随机选取多个点, 去除表面的马尾松针叶, 铲去土壤表面约0~2 cm的土壤苔藓结皮层, 取2~5 cm土层的土壤样品, 混合均匀后作为一个样品, 即每种处理获得3个重复样品, 封装用保温箱4℃冷藏带回实验室.采回土样分为两份, 分别用于土壤化学性质和土壤微生物测定, 用于测定土壤化学性质的土样, 在室内充分自然风干, 人工挑除石头、残根等杂物后, 过2 mm和0.15 mm的筛; 用于测定土壤真菌群落结构和多样性的土样, 过0.15 mm筛, 冻存于-24℃冰箱, 用于土壤总DNA的提取.
1.3 土壤总DNA的提取、PCR的扩增和Illumina MiSeq测序土壤总DNA的提取采用GENEray DNA试剂盒, 并按照试剂盒规定步骤提取土壤总DNA.真菌ITS的PCR扩增: 选取特异性引物ITS1F(CTTGG TCATTTAGAGGAAGTAA)和ITS2(GCTGCGTTCTTC ATCGATGC)对真菌ITS片段进行扩增.PCR扩增条件为:95℃预变性10 min, 95℃变性10 s, 60℃退火34 s, 72℃延伸30 s, 40个循环, 72℃延伸10 min, 降温至10℃, 进行扩增.使用PAGE纯化试剂盒(GENEray, GK8020)和ABI 7500、ABI 7900荧光定量PCR仪对PCR扩增产物进行纯化和定量, 首先用Trimmomatic(V 0.33)软件对原始序列进行过滤, 然后使用cutadapt(V 1.9.1)软件进行引物序列的识别和去除, 得到不包含引物序列的序列, 接着使用FLASH(V 1.2.7)软件, 对上述序列进行拼接, 得到高质量序列, 最后使用UCHIME(V 4.2)软件, 鉴定并去除嵌合体序列, 得到最终有效序列, 试验样品委托北京百迈客生物科技有限公司进行高通量测序, 使用平台为Illumina HiSeq 2500.
1.4 土壤化学性质的测定土壤化学性质测定方法均参考鲁如坤的土壤农业化学分析方法[16], pH采用电极法测定, 有机质含量采用重铬酸钾外加热法测定, 全氮含量采用凯氏定氮法测定, 全磷含量采用钼锑抗比色法测定, 全钾含量采用火焰光度法测定.
1.5 数据处理使用Usearch(V 7.1)软件[17]进行数据处理; 使用RDP classifier软件进行物种比对注释; 使用Mothur软件在各分类水平上进行群落结构统计分析; 使用Alpha指数分析软件QIIME2计算: 可观测物种数、Chao1指数、ACE指数、Shannon指数和Simpson指数; 使用SPSS(V 20.0)对数据进行统计分析并构建样本聚类树用于计算样本间距离, 在(P<0.05)水平上分析数据差异性; 使用Origin软件进行作图.
2 结果与分析 2.1 不同土壤改良措施对土壤化学性质的影响土壤改良措施对土壤化学性质影响较大.和对照相比, 3种改土措施均显著提高了表土pH和有机质含量(P < 0.05), 但各改土措施间表土pH差异不大(表 1).而对于表土有机质含量, 则是施加有机肥显著高于另外两种肥料.3种改土措施对碳氮比影响不同, 施加生物炭和石灰+微生物肥对表土碳氮比有一定降低作用, 但降低值并未达到显著水平, 而施加有机肥则显著提高了表土碳氮比(P < 0.05).3种改土措施均提高了表土全氮含量且施加生物炭和石灰+微生物肥提高效果显著(P < 0.05).施加生物炭对表土全磷含量无影响, 但施加有机肥和石灰+微生物肥却对其有显著提高作用(P < 0.05).对于全钾, 施加有机肥降低了表土全钾含量, 其它改土措施均提高了表土全钾含量, 且相比于施加有机肥, 施加生物炭显著提高了表土全钾含量.
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表 1 不同改土措施对土壤化学性质的影响1) Table 1 Effects of different soil improvement measures on soil chemical properties |
2.2 不同土壤改良措施土壤真菌群落分布情况
由表 2可知, 在门分类水平上, 真菌门类群主要集中在子囊菌门(Ascomycota, 31.29% ~46.55%)和担子菌门(Basidiomycota, 30.07% ~70.71%).除施加有机肥外, 担子菌门在其它改土措施中均占绝对优势, 其中施加生物炭的相对丰度最高, 达到了70.71%, 施加有机肥的相对丰度最低, 仅为30.07%, 相较于对照, 施加有机肥担子菌门的相对丰度降低了48.52%, 施加生物炭处理、石灰+微生物肥的相对丰度分别提高了21.06%和4.45%, 施加有机肥子囊菌门的相对丰度提高了35.20%, 施加生物炭和石灰+微生物肥的相对丰度分别降低了53.76%和9.12%; 除施加有机肥外, 其它改土措施均降低了子囊菌门的相对丰度.
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表 2 不同土壤改良措施土壤真菌群落在门水平上的分布情况1) Table 2 Distribution of soil fungal community at phylum level under different soil improvement measures |
由表 3可知, 在属分类水平上, 相对丰度居前两位的为阿太菌属(Amphinema)和单形古根菌属(Archaeorhizomyces), 除施加有机肥外, 阿太菌属在其它改土措施中均占绝对优势, 其中施加生物炭的相对丰度最高, 达到了37.39%, 施加有机肥的相对丰度最低, 仅为8.65%, 相较于对照, 施加有机肥和石灰+微生物肥阿太菌属的相对丰度分别降低了67.34%和0.91%, 施加生物炭的相对丰度提高了41.15%; 除施加生物炭外, 施加有机肥和石灰+微生物肥均提高了单形古根菌属的相对丰度, 分别提高了320.90%和77.65%.
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表 3 不同改土措施土壤真菌群落在属水平上的分布情况1) Table 3 Distribution of soil fungal communities at genus level under different soil improvement measures |
2.3 不同土壤改良措施对土壤真菌多样性的影响
土壤微生物群落中各物种具有越大的均匀度和丰富度, 则认为群落具有越大的多样性, Shannon指数、ACE指数和Chao1指数越大, 则说明土壤微生物群落的物种多样性越大[18].由表 4可知, 和对照相比, 施加有机肥和生物炭均降低了真菌群落的丰富度, 施加石灰+微生物肥显著降低了真菌群落丰富度, 且施加有机肥、生物炭和石灰+微生物肥这3种改土措施间真菌群落丰富度差异不显著, 施加生物炭真菌群落丰富度高于其它两种改土措施; 和对照相比, 施加有机肥提高了真菌群落多样性, 施加生物炭和石灰+微生物肥降低了真菌群落多样性, 且各改土措施间真菌群落多样性差异不显著.
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表 4 不同土壤改良措施土壤真菌群落丰富度和多样性指数1) Table 4 Richness and diversity index of soil fungal community under different soil improvement measures |
基于距离算法得到不同改土措施土样的距离矩阵热图(图 1), 结合土壤样品门水平树状聚类可知, 施加有机肥和对照相比, 表土中真菌群落多样性有较低相似度; 施加生物炭、石灰+微生物肥和对照相比, 表土中真菌群落多样性有极高相似度.不同改土措施都增大了南方红壤区侵蚀退化林地表土真菌群落差异, 其中施加有机肥表土真菌群落发生了明显的改变.
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CK表示对照; A表示施加有机肥; B表示施加生物炭; T表示施加石灰+微生物肥 图 1 不同土壤改良措施土样的距离矩阵热图 Fig. 1 Distance matrix heat map of soil samples with different soil improvement measures |
RDA分析主要是用来表明不同土壤改良措施土壤中真菌门和土壤化学性质之间的相互关系.如图 2所示, 土壤化学性质共解释土壤优势真菌门群落结构变化的32.31%, 第一轴和第二轴的解释量分别为18.51%和13.80%. 分析可得, 隐真菌门(Rozellomycota)和表土碳氮比有较强的正相关性, 担子菌门和表土有机碳及碳氮比有较强的负相关性, 毛囊菌门(Mucoromycota)和表土全氮有较强的正相关性, 被孢霉门(Mortierellomycota)和表土pH有较强的正相关性, 子囊菌门、壶菌门(Chytridiomycota)和表土pH及全氮有较强的负相关性.如图 3所示, 土壤真菌多样性和土壤化学性质之间相关性分析结果表明, 表土pH和真菌Chao1指数、总OTU值呈极显著负相关(P<0.01), 和ACE指数呈显著负相关(P<0.05), ACE指数和全磷含量呈显著负相关(P<0.05), Simpson指数和Shannon指数与各土壤环境因子相关关系不显著(P>0.05).
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SOC表示土壤有机碳, TN表示全氮, SOC.N表示土壤碳氮比, 1 表示被孢霉门(Mortierellomycota), 2 表示隐真菌门(Rozellomycota), 3 表示未分类门(Unclassified), 4 表示壶菌门(Chytridiomycota), 5 表示子囊菌门(Ascomycota), 6 表示担子菌门(Basidiomycota), 7 表示毛囊菌门(Mucoromycota); 实线箭头表示在门分类水平上的真菌种群; 虚线箭头表示土壤环境因子 图 2 真菌门和土壤环境因子的冗余分析 Fig. 2 Redundancy analysis of fungi and soil environmental factors |
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TK表示全钾, TN表示全氮, TP表示全磷, SOC表示土壤有机碳, SOC.N表示土壤碳氮比; **和*分别表示P < 0.01和P < 0.05水平显著相关 图 3 土壤真菌多样性指标和土壤化学性质的相关性 Fig. 3 Correlation between soil fungal diversity index and soil chemical properties |
和对照相比, 3种改土措施均显著提高了表土的pH且各改土措施间差异不大(P>0.05), 这可能是因为肥料中含有丰富的—COO—(—COOH)和—O—(—OH)等含氧官能团[19], 施入土壤后, 可以提高土壤pH.3种改土措施均显著提高了表土的有机质含量, 相较于施加生物炭和石灰+微生物肥, 施加有机肥的表土有机质分别提高了44.38%和36.42%, 刘学彤等[20]认为长期定位施肥可提高土壤有机质含量, 改善土壤肥力, 和本研究结果一致, 这可能是因为适量肥料施加对土壤有机质存在累积作用, 张文学等[21]基于全量数据集和最小数据集评价土壤肥力质量综合指数(IFITDS和IFIMDS), 结果显示施加有机肥能提高红壤稻田的土壤肥力指数.施加生物炭和石灰+微生物肥显著提高了表土的全氮含量, 生物炭的施加在显著改变土壤碳循环的同时, 还可以提升土壤碳库储量[22], 施加生物炭土壤全氮含量提高, 可能是因为生物炭含有的不稳定组分存在降解, 施入土壤后因矿化作用而释放出大量的N元素, 且长期施肥会显著影响红壤的养分状况和微生物生物量碳氮[23].施加生物炭和石灰+微生物肥, 显著提高了表土的全磷含量, 这和袁访等[24]的研究结果一致.生物炭自身含有的磷, 一般以稳定形态存在, 施入后和土壤中活性磷库相互补充, 来维持土壤磷元素的平衡, 这是造成施加生物炭土壤全磷含量基本不变的原因[25], 而石灰+微生物肥能增加土壤全磷的含量, 可能是因为石灰+微生物肥通过改变土壤的理化性质以及通过土壤生物和非生物过程, 来促进磷元素的累积和转化[26].
3.2 不同土壤改良措施对土壤真菌多样性的影响和对照相比, 3种改土措施表土真菌群落α多样性总体上并不存在显著差异(P < 0.05), 且只有施加有机肥才提高了表土的Simpson指数和Shannon指数, 即施加有机肥可提高表土真菌群落的α多样性, 这和Pu等[27]关于有机肥均会增加土壤真菌群落多样性的结论一致, 施加有机肥的表土Shannon指数最高, 说明检测到的真菌种类最多, 表明在各改土措施中, 施加有机肥最有利于形成丰富度高的表土真菌群落.荀卫兵等[28]的研究发现, 长期施用有机肥可以通过增加红壤微生物多样性提高土壤多功能性, 进而提高土壤微生物群落稳定性和养分周转下效率, 和本研究结果一致, 施加有机肥提高了表土真菌群落多样性, 微生物群落多样性的提高有利于微生物群落稳定性的提高.3种改土措施均降低了表土的ACE指数和Chao1指数, 即施加3种肥料均降低了表土真菌群落的丰富度, 施加石灰+微生物肥的表土, 其丰富度指数和多样性指数降幅最大, 这和Bai等[29]关于微生物肥料能显著降低苜蓿根区土壤真菌多样性和丰富度的结论一致.通过距离矩阵热图还可以发现, 施加有机肥, 相较于其它改土措施, 更有利于土壤真菌差异化的形成, 能够形成更加丰富多样的土壤真菌群落.
3.3 土壤真菌群落和环境因子间的相互关系土壤微环境理化性质和土壤真菌群落间的协同演变过程是极其复杂的[30], 不同优势真菌门和环境因子间存在显著的相关关系.已有研究表明土壤的非生物性质(如pH等)是土壤真菌群落的主要调节因子[31], 而被孢霉门和毛囊菌门分泌的物质(如不饱和脂肪酸和草酸等)又会和土壤中的碳酸钙、铁离子和锰离子等发生反应, 进而影响土壤pH, 这可能是造成被孢霉门、毛囊菌门和表土pH相关性较强的原因[32].退化侵蚀红壤养分较为贫瘠, 土壤碳氮含量和质量会对土壤微生物群落产生直接影响, 这可能是造成隐真菌门和表土有机碳含量及碳氮比, 被孢霉门、毛囊菌门和表土全氮含量相关性较强的原因.pH是影响土壤真菌群落的显著因素, 且pH对土壤微生物群落产生的生理胁迫是具有选择性的, 本研究表土pH和真菌丰富性指数呈显著负相关, 这和代子雯等[33]的研究结果相反, 可能是因为土壤类型和立地植物不同造成的差异.
3.4 不同土壤改良措施对土壤中真菌组成的影响由于外源肥料的施加, 会对土壤生境和理化性质产生影响[34], 进而直接或间接地决定了土壤真菌的种类、数量和其分布规律[35].施加有机肥提高了子囊菌门的相对丰度, 可能是因为有机肥增加了土壤中的有机质含量而导致的, 降低了担子菌门的相对丰度, 和罗俊等[36]的试验结果一致, 而施加生物炭和石灰+微生物肥却恰恰相反.本研究结果表明子囊菌门和担子菌门为表土真菌优势菌门, 这和李媛媛等[37]研究中国水仙根际土壤微生物群落组成的结论一致.子囊菌门主要为腐生菌, 它通过分解土壤中的有机物质来增加土壤有机质含量, 而担子菌门主要是通过分解土壤中的木质素来提高其相对丰度[38, 39], 而本研究所施加的生物炭原料为富含木质素水稻秸秆, 这也正是在3种改土措施中, 施加生物炭担子菌门相对丰度最高的原因.
4 结论南方红壤区侵蚀退化林地表土结构和肥力的提升是提高地表植被覆盖度, 防治水土流失的关键.表土中真菌对土壤环境的改变具有高度敏感性, 其群落结构和多样性能较好地预示土壤结构和肥力的提升.本研究发现有机肥、生物炭和石灰+微生物肥均改变了表土真菌群落结构, 但不同土壤改良措施对优势真菌门和属的影响有所不同.另外, 3种土壤改良措施对表土真菌丰富度有较大降低作用, 但对多样性指数无显著影响.土壤改良措施对表土真菌群落结构和多样性的影响主要和土壤改良措施提高了表土pH、全氮和有机碳有关.本研究对于高效利用土壤改良措施调节南方红壤区侵蚀退化林地表土真菌群落结构以修复林下土壤生态环境, 提供了实际背景意义和理论研究基础.
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