环境科学  2022, Vol. 43 Issue (12): 5819-5831   PDF    
引用本文
赵炎, 袁新生, 唐瑞杰, 邵晓辉, 李凯凯, 文昌丽, 陈绮琦, 伍延正, 孟磊, 汤水荣. 添加生物炭对琼北地区双季稻田生物固氮的影响[J]. 环境科学, 2022, 43(12): 5819-5831.
ZHAO Yan, YUAN Xin-sheng, TANG Rui-jie, SHAO Xiao-hui, LI Kai-kai, WEN Chang-li, CHEN Qi-qi, WU Yan-zheng, MENG Lei, TANG Shui-rong. Effect of Biochar Application on Biological Nitrogen Fixation in Double Cropping Paddy Field in Northern Hainan[J]. Environmental Science, 2022, 43(12): 5819-5831.
添加生物炭对琼北地区双季稻田生物固氮的影响
赵炎, 袁新生, 唐瑞杰, 邵晓辉, 李凯凯, 文昌丽, 陈绮琦, 伍延正, 孟磊, 汤水荣     
海南大学热带作物学院, 海口 570228
收稿日期: 2021-12-27; 修订日期: 2022-04-01
基金项目: 海南省自然科学基金青年基金项目(320QN196); 海南省自然科学基金高层次人才项目(320RC493, 2019RC049); 国家自然科学基金项目(41671243)
作者简介: 赵炎(1996~), 女, 硕士研究生, 主要研究方向为土壤生物固氮, E-mail：2455063819@qq.com
通信作者: 伍延正, E-mail: wyz198712@163.com; 孟磊, E-mail: menglei@hainanu.edu.cn
摘要: 生物固氮有助于植物对土壤中有效氮的利用，减少农业生态系统中无机氮肥的使用.生物炭可以通过其特殊物理结构调节土壤理化性质，提高土壤微生物的丰度和活性，然而关于生物炭对水稻土生物固氮方面的研究并未深入了解.试验共设置3个处理：施磷钾肥对照（CK）、当地常规施肥处理（CON）和常规处理配施20 t·hm-2生物炭（B），采用qPCR和高通量测序分析固氮基因（nifH）的丰度和群落结构变化，探讨生物炭添加对琼北地区双季稻田土壤固氮微生物的影响.结果表明，相比CK和CON处理，添加生物炭提高了土壤pH和土壤有机碳（SOC）含量以及作物产量.同时nifH基因丰度与土壤pH和SOC呈显著正相关.与CK处理相比，添加生物炭处理增加了nifH基因丰度以及显著改变了早稻季土壤固氮微生物的群落结构，常规施肥处理减少了nifH基因丰度而对固氮微生物群落影响相对较小.施用生物炭使固氮微生物群落优势属发生了变化，地杆菌属（Geobacter）、嗜糖假单胞菌属（Pelomonas）、固氮螺菌属（Azospirillum）、厌氧粘细菌属（Anaeromyxobacter）和铁氧化细菌属（Sideroxydans）等是所有处理中的优势菌属.相比CK处理，生物炭处理显著增加了嗜糖假单胞菌属的相对丰度，而常规施肥处理增加了地杆菌属的相对丰度.结果表明，生物炭添加具有一定的减肥潜力，为减少琼北地区稻田氮肥施用，提高氮肥利用率提供了理论依据.
关键词: 双季稻田      生物固氮      生物炭      nifH基因      微生物多样性      微生物群落结构     
Effect of Biochar Application on Biological Nitrogen Fixation in Double Cropping Paddy Field in Northern Hainan
ZHAO Yan , YUAN Xin-sheng , TANG Rui-jie , SHAO Xiao-hui , LI Kai-kai , WEN Chang-li , CHEN Qi-qi , WU Yan-zheng , MENG Lei , TANG Shui-rong     
College of Tropical Crops, Hainan University, Haikou 570228, China
Abstract: Biological nitrogen fixation contributes to the pool of plant-available N in soil and helps to minimize the use of inorganic N fertilizer in agricultural ecosystems. Biochar can regulate the physical and chemical properties of soil and improve the abundance and activity of soil microorganisms through its special physical structure. However, research on the diazotrophs of paddy soil by biochar is insufficient. This experiment consisted of three treatments: no nitrogen as the control (CK), conventional fertilization (CON), and conventional fertilization combined with 20 t·hm-2 biochar (B). qPCR and high-throughput sequencing were used to analyze the abundance and community structure of nitrogen-fixing genes (nifH) and to investigate the effects of biochar on soil diazotrophs in double-cropping paddy fields in northern Hainan province. The results showed that the addition of biochar increased soil pH, soil organic carbon (SOC) content, and crop yield compared with that in the CK and CON treatments. Meanwhile, the abundance of the nifH gene was significantly positively correlated with soil pH and SOC. Compared with that in the CK treatment, biochar treatment increased the abundance of the nifH gene and significantly changed the community structure of the soil diazotroph community in the early-rice seasons, whereas the conventional fertilization treatment reduced the abundance of nifH genes and had relatively no significant effect on the diazotroph community. The application of biochar changed the dominant genus of soil diazotrophs. Geobacter, Pelomonas, Azospirillum, Anaeromyxobacter, and Sideroxydans were the dominant bacteria in all the treatments. Compared with that in the CK treatment, biochar significantly increased the relative abundance of Pelomonas, whereas conventional fertilization increased the relative abundance of Geobacter. The results showed that biochar addition had the potential to reduce fertilizer application, which provides a theoretical basis for reducing nitrogen fertilizer application and improving nitrogen use efficiency in paddy fields in northern Hainan province.
Key words: double-cropping paddy fields      biological nitrogen fixation      biochar      nifH gene      microbial diversity      microbial community structure     

随着化学氮肥生产和施用量的增加, 氮肥利用率越来越低, 而化肥的过度使用已经引起了严重的环境问题, 例如土壤酸化、重金属污染及温室气体排放增加并且气态和溶解态的氮流失导致了水和空气污染的增加及生物多样性的丧失等一系列环境问题[1, 2].海南地处热带地区, 水稻是该地区主要的粮食作物, 土壤受发育母质及气候影响, SOC含量低、土壤偏酸性或弱酸性且保水保肥能力较差, 使得当地农户为满足作物生长而进行化肥的大量投入, 因而有必要减少稻田土壤氮肥施用.稻田生态系统具有保持土壤肥力、提供粮食保障和生态调节等多种功能, 我国水稻土面积约3 000万hm2, 约占全国耕地面积的1/4, 在我国主要粮食中占60%[3], 在不施氮肥的条件下, 水稻种植可以提供的蛋白质是玉米种植的1.5倍[4, 5], 其中主要原因是稻田生态系统能进行生物固氮而不断为水稻生长提供氮素[6].

氮是农业生态系统中的重要元素[7], 尽管在大气中含量丰富, 但植物不能直接利用氮气, 而是通过固氮、硝化和有机氮矿化吸收无机氮来满足生长需要[8].生物固氮是固氮微生物通过固氮酶的催化作用把空气中的N2转化为活性氮的过程, 其有助于植物对土壤中有效氮的吸收利用, 并有利于减少农业生态系统中无机氮肥的使用.土壤是微生物的聚集地, 微生物对周围环境变化比较敏感, 其中固氮微生物中的固氮菌是一组能够固定大气中N2的土壤微生物, 它可以向宿主植物提供容易获得的氮源[9], 固氮微生物活性在细菌和古细菌分类群中高度保守, 包括一些自主生活细菌、硫酸盐还原细菌和共生固氮微生物[10, 11].编码部分固氮酶的nifH基因已被广泛用于研究陆地生态系统中的固氮微生物群落[12, 13].了解不同施肥措施对稻田土壤固氮微生物的丰度及群落结构的影响将有利于提出合理的减肥增产措施.

生物炭作为一种新型土壤改良剂, 已在世界范围内作为改良剂进行试验, 以提高土壤肥力[14], 生物炭的稳定性决定了其固碳、改善土壤结构和提高土壤肥力等功能的有效性[15].有研究表明生物炭有益于增加共生生物固氮(63%), 提高植物对氮素的吸收(11%), 减少土壤氮素的淋失(26%)[16], 而生物炭增加氮素固持的作用取决于生物炭类型、添加率、土壤特性和环境条件, 并且表明生物炭添加在热带地区对作物产量的效益要高于温带地区[17].有研究报道了不同施肥方式、施肥处理以及耕作方式等因素对稻田土壤固氮微生物和群落结构及丰度的影响[7, 18~21], 而对于生物炭添加对稻田土壤固氮微生物影响的研究较少, 固氮微生物主要受到氧含量、SOC含量、土壤pH以及施氮含量的影响[22].添加生物炭对这些环境因素会产生影响, 从而影响固氮微生物的群落结构和丰度, 所以有必要了解生物炭添加下水稻田固氮微生物的丰度和群落结构的变化规律.椰子壳是一类数量极其丰富且廉价的废弃木质纤维源, 其中含有椰糠(70%), 以椰壳为原料制备生物炭[23], 由于制备过程相对简单且产品性能突出, 近几年来相关的研究较多.相对于普通活性炭而言, 椰糠生物炭具有较大的比表面积和丰富的孔隙结构[24], 将其用于粮食作物生产将有益于改良土壤pH、增加作物产量.

因此, 本试验以琼北地区的双季稻为研究对象, 在当地农户常规施肥基础上添加椰糠生物炭处理, 通过两年的田间试验, 以qPCR和高通量测序技术并且结合作物产量来研究：生物炭的添加是否影响了琼北地区稻田土壤的nifH丰度和固氮微生物群落的数量、结构及多样性, 对其有何影响？分析固氮微生物群落与土壤理化性质相关性及其影响群落结构差异的关键因子, 有利于解决此类问题.

1 材料与方法 1.1 试验地概况

研究地点位于海南省澄迈县桥头镇西岸村(109°56′01″E, 19°56′58″N), 此地属于热带季风性气候[25], 年平均气温为23.80℃, 年均降雨量为1786.10 mm.该地区的土壤为滨海沉积物母质发育的砂壤土.

1.2 试验设计

本试验共设置3个处理：仅施磷钾肥对照(CK)、当地常规施肥处理(CON)和氮肥配施20 t·hm-2生物炭(B), 生物炭过2 mm筛后, 在第一年早稻季种植前以撒施的方式施入田中, 后进行土壤翻耕处理.每个处理设置3个重复, 共9个小区, 每个小区面积为21 m2(3 m×7 m).各试验小区随机区组排列, 每个小区四周起陇, 覆盖防水塑料膜, 四周埋入地下50 cm, 以防各小区间串水串肥.常规施肥处理在各小区插秧后保持田面水直到返青期和分蘖期, 分蘖肥施用后让田面水自然落干晒田以减少无效分蘖, 分蘖后期反复灌水-落干调节水分, 抽穗期保持田面水至灌浆期, 灌浆结束后自然落干到水稻收获.田间管理措施见表 1.

表 1 田间施肥管理 Table 1 Field fertilization management

早稻季施肥量为氮肥：120 kg·hm-2(尿素, 含氮46%)、磷肥：90 kg·hm-2(过磷酸钙, 含P2O516%)和钾肥：90 kg·hm-2(氯化钾, 含K2O 60%); 晚稻季肥料施用量为150 kg·hm-2(氮肥)、90 kg·hm-2(磷肥)和120 kg·hm-2(钾肥).早稻季施用氮肥比例是基肥∶蘖肥∶穗肥=5∶3∶2, 晚稻季施用氮肥比例是蘖肥∶穗肥=6∶4, 空白处理仅施用磷钾肥, 磷钾肥均一次性施入, 以撒施入田.

供试土壤: pH为5.9, ω[全氮(TN)]为2.8 g·kg-1, ω(SOC)为15.7 mg·kg-1, ω[碱解氮(AN)]为147.8 mg·kg-1, ω[速效磷(AP)]为122.5 mg·kg-1, ω[速效钾(AK)]为49.5 mg·kg-1, CEC为4.0 cmol·kg-1, ω(砂粒)为62.7%, ω(粉粒)为20.5%, ω(黏粒)为16.8%; 供试生物炭由椰糠在600℃下厌氧热解制成, 其pH为9.7, ω(N)为0.3%, 阳离子交换量(CEC)为8.2 cmol·kg-1, 灰分为35.1%, 比表面积为5.8 m2·g-1, ω(AP)为99.6 mg·kg-1, ω(AK)为65.1 mg·kg-1.

1.3 土壤样品采集与处理

每一季水稻收获时, 在田间观察试验小区, 了解情况后按照S形线路采样, 各点随机决定, 在每个小区内采取0 cm~20 cm的土壤样本, 共选取5个样本点组成一个混合样品, 重量在1 kg左右, 其中一部分新鲜土壤样品放入液氮罐中冷冻, 带回实验室后放入-80℃冰箱中保存, 用于微生物指标的测定.用于测定土壤理化指标的样品, 在进行实验室分析之前, 先进行风干处理, 之后过2 mm筛; 用于测定微生物指标的样品, 在测定前在冷冻干燥机中去除水分后进行测定.

1.4 理化指标的测定

pH采用电位法(水∶土为2.5∶1); 速效磷采用钼蓝比色法; 碱解氮采用碱解扩散法; 速效钾采用1 mol·L-1乙酸铵溶液(pH=7)浸提, 用火焰光度计测定; 阳离子交换量采用乙酸铵交换-蒸馏法测定; 有机质采用重铬酸钾-硫酸消化法; 生物炭灰分测定：马弗炉600℃高温灼烧3 h, 之后进行测定; 土壤机械组成采用比重法测定[26].

1.5 土壤微生物DNA提取

采用土壤DNA提取试剂盒DNeasy PowerSoil Kit(100)12888-100提取土壤DNA, 称取约0.5 g新鲜土壤, 按照试剂盒提取说明书进行有序操作, 提取完毕后采用微量紫外分光光度计(Nano drop 2000, USA)测定核酸浓度, 将收集管中的DNA冷冻保存(-80℃).

1.6 固氮基因丰度测定

固氮微生物基因丰度采用实时荧光定量(qPCR)法测定水稻土壤中nifH基因拷贝数.所用引物为：nifH-FAAAGGYGGWATCGGYAARTCCACC AC/nifH-RTTGTTSGCSGCRTACATSGCCATCAT[27].将提取的DNA样品稀释10倍后作为qPCR模板进行扩增, 反应体系为20 μL, 其中10 μL 2×T5 Fast qPCR Mix(SYBR Green I), 正反向引物各1 μL, 1 μL DNA模板, 其余用无菌水补齐.梯度稀释标准质粒同时进行荧光定量PCR扩增, 计算nifH基因的丰度.

1.7 Illumina MiSeq测序及生物信息学分析

提取样品总DNA后, 根据保守区设计得到引物, 在引物末端加上测序接头, 进行PCR扩增并对其产物进行纯化、定量和均一化形成测序文库, 建好的文库先进行文库质检, 质检合格的文库用Illumina HiSeq 2500进行测序.高通量测序(如Illumina HiSeq等测序平台)得到的原始图像数据文件, 经碱基识别(Base Calling)分析转化为原始测序序列(Sequenced Reads); 对数据进行分析, 原始数据利用QIIME(version 1.8.0)和USEARCH(version 10.0)软件进行分析, 通过数据预处理、质量过滤、双端序列拼接去除嵌合体、引物及低质量序列, 从而得到最终有效序列.然后利用FunGene Pipeline转换成氨基酸, 转换成的蛋白质序列不符合nifH蛋白的将被舍弃, 剩下的按照97%序列相似性水平划分成不同的分类操作单元(OTU).选取的OTU代表序列使用MEGAN(version 5.8.1)软件在NCBI数据库进行序列比对(序列号为PRJNA 810776), 鉴定出代表序列相应的微生物分类.使用QIIME软件对序列进行多样性指数(ACE、Chao1、Shannon和Simpson指数)计算.

1.8 数据处理与分析方法

本试验数据用微软Excel处理, 使用SPSS 23.0对数据进行皮尔森相关性分析(Pearson correlation)和单因素方差分析(One-way ANOVA), P < 0.05表示有显著差异; R语言Vegan软件包做非度量多维尺度(non-metric multidimensional scaling, NMDS)分析, 随机森林分析和作图.CANOCO 4.5软件做固氮微生物群落结构与环境因子的RDA分析.

2 结果与分析 2.1 添加生物炭对水稻土壤理化性质的影响

由表 2可知, 2019年早晚稻季收割后, 土壤AN含量在CK处理高于其它处理, 但在2020年早稻季中, AN含量明显下降, 在晚稻季与其他处理含量无显著差异.相比于CK处理和CON处理, 在两年四季水稻中, 生物炭添加显著提高了土壤pH(P < 0.05), 其中在2019年晚稻季和2020年早稻季pH较高; 与CON处理相比, B处理降低了土壤AP含量(2020年早稻季除外), 并且每年晚稻季达到显著(P < 0.05); B处理相比CON处理显著提高了水稻土壤SOC含量(P < 0.05), 相比CK处理SOC含量提高, 并且自每年晚稻季达到显著; B处理相比CK处理和CON处理, AK含量有所提高(2020年晚稻季除外), 仅在2020年早稻季达到显著(P < 0.05).

表 2 土壤基本理化性质1) Table 2 Basic physical and chemical properties of soil

2.2 添加生物炭对nifH基因丰度影响

如图 1所示, 固氮微生物群落丰度通过使用qPCR定量nifH基因来确定, 在2019年双季稻所有处理中nifH基因丰度(以干土计, 下同)范围在(1.49~8.81)×107 copies·g-1, 2020年早稻、晚稻季土壤的所有处理中nifH基因的丰度在(6.59~20.96)×107 copies·g-1, 整体上看, 2020年的nifH基因丰度高于2019年.两年双季稻中相比于CK处理, B处理nifH基因丰度分别增加了50%、37%、82%和17%; 而CON处理nifH基因丰度则在两年早、晚稻季中分别减少了12%、12%、11%和33%.相关分析表明, nifH基因丰度与土壤pH和SOC呈显著正相关(P < 0.05), 而与AN呈显著负相关(P < 0.05)(图 2).

不同小写字母表示处理间差异显著(P < 0.05); Z19表示2019年早稻季, W19表示2019年晚稻季, Z20表示2020年早稻季, W20表示2020年晚稻季 图 1 各处理水稻土壤中nifH基因丰度的变化 Fig. 1 Changes in nifH gene abundance in paddy field soils under different treatments

*表示在0.05级别(双尾), 相关性显著; **表示在0.01级别(双尾), 相关性显著 图 2 土壤nifH基因与环境因子相关性 Fig. 2 Correlation between soil nifH genes and environmental factors

2.3 固氮微生物群落的多样性和组成

经过质量过滤后, 从四季36个样品中共获得了138 459个高质量序列, OTU(97%相似性)范围为784~938, 具体取决于样本(表 3).Chao1指数和ACE指数常用来分析微生物群落的丰富程度, Shannon指数和Simpson指数用来估算样品中微生物的多样性, 其中Shannon值越大, 说明群落的多样性越高, 而Simpson值则相反, 与Shannon指数不同的是可以表示其分布的均匀性.在两年四季水稻中, B处理显著提高了ACE指数和Chao1指数(P < 0.05), 并且随着种植季数的增加而增加; 与CK处理相比, B处理增加Shannon指数在2019年早稻季和2020年晚稻季达到显著水平; Simpson指数在四季水稻中B处理均低于CK和CON处理; CON处理的ACE指数和Chao1指数比CK处理高, 在2020年早稻季显著增高(P < 0.05).

表 3 各处理水稻土壤中的OTU数量和固氮微生物群落多样性指数1) Table 3 Number of OTUs and diversity indices of the diazotrophic communities in the paddy soils in all the treatments

如图 3所示, 在门水平上, 相对丰度较高的有变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、蓝细菌门(Cyanobacteria)和厚壁菌门(Firmicutes), 相对丰度共计为95.4%~99.4%, 其中变形菌门是绝对优势菌门, 占比为89.9%~98.8% (图 3).在纲水平上, 放线菌纲(Actinobacteria)、γ-变形菌纲(γ-Proteobacteria)、β-变形菌纲(β-Proteobacteria)、δ-变形菌纲(δ-Proteobacteria)和α-变形菌纲(α-Proteobacteria)相对丰度较高, 共计67.0%~78.0%, 其中变形菌纲占比为49.1%~57.2%(图 4).在属水平上, 四季水稻土壤样品中的优势属为地杆菌属(Geobacter, 3.1%~10.8%)、嗜糖假单胞菌属(Pelomonas, 0.2%~11.8%)、固氮螺菌属(Azospirillum, 1.3%~5.6%)、厌氧黏细菌属(Anaeromyxobacter, 1.2%~2.1%)、铁氧化细菌属(Sideroxydans, 0.3%~5.3%)、慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium, 0.5%~2.2%)、弗兰克氏菌属(Frankia, 0.3%~1.8%)和伯克霍尔德菌属(Burkholderia, 0.4%~2.2%), 它们占样品中固氮基因总序列的13.9%~24.2%(图 5).B处理中嗜糖假单胞菌属丰度明显高于CK和CON处理, 相比CK处理, B处理嗜糖假单胞菌属增加36.7%~1 444.9%, CON处理地杆菌属增加9.5%~29.2% (图 5).利用非度量多维尺度分析(NMDS)对不同处理的固氮菌群落结构相似性进行二维排序, 结果表明生物炭处理固氮菌群落结构在每年的早稻季都与CK处理和CON处理能很好地区分, B处理与CON和CK处理相似性较远, 晚稻季中这种差异不明显(图 6), 说明添加生物炭影响了早稻季土壤固氮菌群落结构.

(a)2019年早稻季, (b)2019年晚稻季, (c)2020年早稻季, (d)2020年晚稻季，下同 图 3 不同水稻季土壤固氮菌群落门水平上的相对丰度 Fig. 3 Relative abundance of diazotrophic genera at phylum level in different rice seasons

图 4 不同水稻季土壤固氮菌群落纲水平的相对丰度(>1%) Fig. 4 Relative abundances of diazotrophic genera at class level in different rice seasons(>1%)

图 5 不同水稻季土壤固氮菌群落属水平的相对丰度(>1%) Fig. 5 Relative abundances of diazotrophic genera at genus level in different rice seasons(>1%)

当stress小于0.2时，表明NMDS分析具有一定的可靠性 图 6 基于OTU水平下四季水稻土壤的固氮菌群落非度量多维尺度分析 Fig. 6 NMDS analysis of diazotroph communities in paddy soil in four seasons at OTU level

2.4 固氮微生物群落结构及其与土壤性质的关系

通过RDA分析来观察所有处理中微生物群落结构的差异, 并且可视化了土壤理化性质与微生物群落组成的关系, 四季水稻中前两个主坐标一起分别解释了98.4%、84.3%、94.5%和96.5%的群落结构变化.添加生物炭的处理和对照处理之间的群落组成差异与pH、SOC、AP和AK的含量差异有关(图 7).由表 4所示, 在4个水稻季中嗜糖假单胞菌属与pH呈正相关, 并且在2020年早稻季达到显著, 与SOC和AK在前3个季水稻中呈正相关, 其中与SOC相关性在2019年晚稻季达到显著(P < 0.05), 在2019年早稻与AK呈显著正相关(P < 0.05); 嗜糖假单胞菌属与AP在2020年早稻季达到显著正相关(P < 0.05), 而在2019年晚稻季呈现负相关; 地杆菌与土壤理化性质相关性变异较大, 仅在2020年晚稻季与pH呈显著负相关(P < 0.05); 慢生根瘤菌属与pH和SOC呈负相关, 其中在2020年早稻季达到显著(P < 0.05); 除了2020年早稻季之外, 固氮螺菌属在其他三季与AN都呈正相关, 与pH在2020年早稻季呈显著正相关(P < 0.05)(表 4).随机森林分析可以用来表征固氮微生物群落中对样品间差异具有重要性的物种, 如图 8所示, 对每季土壤样品中影响较大的菌分别为嗜糖假单胞菌属、弗兰克氏菌属、蓝杆菌属和外硫红螺菌属.各水稻季中, 固氮菌的贡献率均有所变化, 整体来看, 在四季水稻土壤中, 嗜糖假单胞菌属对于固氮群落间的差异具有较为重要的作用, 另外固氮螺菌属、地杆菌属在群落间的重要性也相对较大.

红线和红字表示不同的环境因子, 蓝线和蓝字表示相对丰度大于1% 的物种 图 7 各处理间固氮微生物群落的冗余分析(RDA) Fig. 7 Redundancy analysis(RDA)of diazotroph microbial communities across treatments

表 4 固氮优势菌属相对丰度与土壤理化性质之间的相关性分析1) Table 4 Correlation between relative abundance of dominant genera of diazotrophs and physicochemical properties

图 8 四季水稻土壤样品的随机森林分析 Fig. 8 Random forest analysis of paddy soil samples in four seasons

2.5 添加生物炭对水稻产量的影响

在两年的大田试验期间, 除2020年早稻季种植水稻期间受台风影响产量较低外, 其余水稻季中添加生物炭处理的水稻产量显著高于对照处理(P < 0.05), 并且高于CON处理的产量.2019年早稻季和晚稻季的平均产量分别为7.66 t·hm-2和5.69 t·hm-2, 与对照处理相比, B处理在早稻季增产18.87%, 晚稻季增产63.17%; 2020年早稻和晚稻季平均产量分别为3.24 t·hm-2和7.68 t·hm-2, 与对照处理相比, B处理在晚稻季增产102.92%(图 9).从增产率来看, 在第二年晚稻季中, B处理增加较多.表 5显示, 水稻产量与嗜糖假单胞菌属呈显著正相关, 与固氮螺菌属、弗兰克氏菌属、伯克霍尔德菌属和外硫红螺菌属呈显著负相关.

不同小写字母表示处理间差异显著(P < 0.05); Z19表示2019年早稻季, W19表示2019年晚稻季, Z20表示2020年早稻季, W20表示2020年晚稻季 图 9 四季水稻各处理产量 Fig. 9 Yield of rice in four seasons under different treatments

表 5 水稻产量与nifH及固氮优势菌属相对丰度的相关性分析1) Table 5 Correlation analysis between rice yield and relative abundance of dominant diazotrophs

3 讨论 3.1 添加生物炭对土壤理化性质与nifH基因丰度的影响

施肥和添加生物炭改变了水稻土营养状况, 并可能通过影响土壤性质而影响土壤固氮微生物[28~30], 在本研究中, 生物炭添加提高了pH和SOC含量, 众所周知, 碳有效性对固氮率有很大影响, 并且碳有效性的增加通常会增强生物固氮[31].在土壤中添加生物炭后, 土壤固氮微生物可以直接利用生物炭中的活性有机碳.另外, 不同的pH值也会促进或抑制微生物生长代谢活性[32].本研究结果也表明, B处理下, AN含量在2019年双季稻中相比于CK处理显著降低, 但在2020年双季稻田中增加, 其中早稻季呈显著水平, 这可能是因为生物炭经过1 a的分解熟化, 土壤碳源消耗较多, 微生物在前一年固定的氮素被缓慢释放, 因而促进了第二年的土壤养分供应[33], 即生物炭对土壤AN的影响具有年际差异.

本研究中, 与CK处理相比, B处理显著提高了水稻土中nifH基因丰度(P < 0.05), CON处理降低了nifH基因丰度(在2020年晚稻达到显著, P < 0.05), 说明添加生物炭和施氮肥会影响水稻土中固氮微生物的数量.邓少虹等[34]的研究表明土壤固氮细菌nifH基因丰度与SOC含量呈极显著正相关, 与本研究的结果一致, 因此对于生物炭处理来说, 导致水稻土中nifH基因丰度增加的可能原因是: 本研究中nifH基因丰度与SOC显著正相关, 生物炭提高了土壤SOC, 给固氮微生物提供物质和能量来源促进生长和代谢, 从而有益于固氮微生物的繁殖[35, 36].另外, 高的水稻产量也会带来更多的根际分泌物, 为固氮菌提供更多的碳源, 促进其生长[37, 38], 同时添加生物炭提高了土壤的pH.有研究表明[39, 40], 酸性土壤pH提升能够增强营养物质的可利用性, 降低铝离子对作物生长的抑制作用, 从而促进微生物和作物生长.王晓洁等[41]的研究表明, 随着土壤pH的提高, 水稻土的固氮作用明显增强.因此, 在施用氮肥的基础上添加适量生物炭有利于水稻土固氮微生物的生长和繁殖.也有报道指出, 氮肥添加会增加nifH基因丰度[42, 43], 而Wang等[44]的研究结果与本研究的一致, 降低了nifH的丰度, 这种差异可能源于施肥时间跨度的不同, 也可能是水稻土壤对施用肥料的响应不一致, 会随着施肥方式、土壤类型及外源材料的添加表现出不同的趋势[45, 46].2020年的nifH基因含量要高于2019年, 这可能是土壤的AN含量在2019年要高于2020年(除早稻季的生物炭处理外), 或者是生物炭对水稻土壤中养分的影响会随着试验年限的变化而发生改变, 因此对nifH基因丰度的提升作用也可能具有一定的时间效应[38], 所以2019年nifH丰度较低.另外, nifH基因丰度与AN含量呈显著负相关也表明氮肥在本区域对固氮菌有一定的抑制效果.

3.2 添加生物炭对土壤中固氮微生物多样性和群落结构的影响

土壤的理化性质, 例如土壤水分, 碳源、氮源含量及土壤结构组成和pH等, 能够引起土壤中固氮微生物多样性的改变[32].其中有研究表明土壤pH可显著影响细菌的多样性, 并发现细菌群落的分布显著受到土壤pH的影响[47], 本研究中, 随着生物炭添加之后种植季数的增加, ACE指数和Chao1指数也增加, 原因在于, 生物炭的添加改变了四季水稻土壤中的pH, 并且在2020年双季稻田中相比于2019年早稻季pH更高.

据报道, 生物炭作为改良剂会影响土壤微生物群落结构[48], 本研究中, 观察了生物炭处理下的固氮微生物群落变化, 主要与土壤pH、SOC有关, NMDS分析表明每年早稻季B处理与CK和CON处理明显区分, 晚稻季区分较小(图 6), 可能的原因是早稻季种植前的作物为辣椒, 晚稻季种植前作物为水稻, 对相关微生物的影响存在差异.在四季水稻中CK和CON处理并未明显区分, 此结果与眭锋等[38]的研究氮肥的施用不会影响土壤固氮微生物的群落组成一致, 但与Wang等[44]研究的结果不一致, 其可能的原因是SOC是生物固氮的限制性养分, 且低SOC含量会限制固氮微生物的群落与丰度[44].在本研究中, 两年田间试验结果显示, 相比于CK处理, CON处理并未显著提高SOC的含量, 生物炭单独施用或与肥料一起添加到土壤中时, 通常会提高土壤SOC以及pH, 因此间接对固氮微生物的群落结构产生影响.在本研究中, 嗜糖假单胞菌属在2019年早稻季生物炭处理下占比高达11.9%, 相比CK处理和CON处理, B处理显著增加了嗜糖假单胞菌属的相对丰度.嗜糖假单胞菌属是一种利用H2固定大气中的N2的固氮细菌[49], 具有自生固氮能力, 主要受到温度和碳源的影响, 在本研究中, 相关分析表明其相对丰度与pH和SOC呈正相关(表 4), 生物炭处理提高了pH和SOC含量, 从而提高了嗜糖假单胞菌属的含量.慢生根瘤菌属在土壤中普遍存在, 是一种众所周知的固氮细菌[50], Yang等[30]和Meng等[51]指出慢生根瘤菌属为主要的优势菌, 在两年双季稻试验所有土壤处理中均发现了慢生根瘤菌属的存在, 仅占0.5%~2.2%, 与pH和SOC呈负相关, 由于B处理增加了pH和SOC含量, 因此在B处理中, 慢生根瘤菌属的含量相对较低.地杆菌属在本研究中也是一种优势菌属, 广泛分布于厌氧沉积环境, 在有氧水稻土泥浆环境中能够较好地生长.有研究表明[52], 长期施肥将会抑制地杆菌属相对丰度, 这与本研究结果施肥增加了其丰度不一致, 可能是长期施肥致土壤酸化严重.朱超[53]的研究发现pH过低对地杆菌属造成持续的抑制, 但适当调低土壤pH对后期地杆菌属的生长起促进作用.本研究中, 相比CK处理, CON处理降低了土壤pH, 但降幅较小, 因此施肥增加了地杆菌属的丰度.另外, 地理因素也会影响固氮微生物群落结构, 例如, Wang报道了黄杆菌属[44], Coelho报道了既具有固氮能力也可通过产生植物激素影响植物生长的拟杆菌属[50], 而这两个菌属在本研究中并未发现, 然而在其他研究中报道水稻土中的嗜糖假单胞菌属则较少.

3.3 添加生物炭对水稻产量的影响

有研究表明生物炭配施氮肥处理下可在2 a内持续提高水稻产量, 增产率在8%~12%[54].本研究结果表明, 与CK处理相比, CON和B处理水稻产量均有不同程度的增加, 且达显著水平(受台风季影响2020年早稻季除外), 这说明在当前试验条件下, 施用20 t·hm-2的生物炭配施化肥具有一定的可行性, 而与史登林等[55]的研究在贵州中等肥力黄壤稻田中生物炭与氮肥减量配施的增产效果不一致可能是由于土壤类型、土壤肥力以及耕作模式不同.人们常认为固氮微生物越丰富的农田土壤, 其作物的产量应该越高.本研究中, 水稻产量与嗜糖假单胞菌属呈显著正相关, 与nifH丰度呈正相关, 但不显著(表 5), B处理下水稻产量增加, 可能的原因是生物炭提高了nifH丰度和嗜糖假单胞菌属的相对丰度, 从而增加了水稻的固氮量, 并且嗜糖假单胞菌属在水稻土壤中具有较为重要的固氮作用.CON处理降低了nifH基因丰度, 但未达显著水平, 相关分析中产量与固氮螺菌属和弗兰克氏菌属显著负相关(P < 0.05, 表 5), 除2019年早稻季外, CON处理下二者的相对丰度降低, 加上肥料本身的氮素养分, 因此也增加了水稻的产量.另外, 因生物炭自身含有丰富的氮素, 尽管并非都是易分解或可有效利用的, 但由于能吸附氮素, 因此可提高土壤养分含量保证作物实现增产或稳产[56].

4 结论

本研究表明, 生物炭增加了土壤固氮微生物的nifH基因丰度, 改变了土壤固氮微生物的群落结构.具体而言, 添加生物炭后, 土壤pH和SOC显著提高, 与之显著相关的嗜糖假单胞菌属的丰度显著提高, 且嗜糖假单胞菌属与产量显著正相关, 因此产量也有所增加.添加生物炭对土壤养分的富集及nifH丰度有积极影响, 并在形成这些固氮群落中发挥了重要作用.本研究结果表明, 生物炭改良剂在提高海南水稻土壤的生物固氮方面具有很大的潜力, 添加适量生物炭条件下可考虑减少氮肥的施用量.

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