环境科学  2022, Vol. 43 Issue (9): 4636-4646   PDF    
引用本文
夏鑫, 乔航, 孙琪, 刘坤平, 陈香碧, 何寻阳, 胡亚军, 苏以荣. 有机物料投入对喀斯特地区土壤磷素赋存形态与含phoD基因细菌群落的影响[J]. 环境科学, 2022, 43(9): 4636-4646.
XIA Xin, QIAO Hang, SUN Qi, LIU Kun-ping, CHEN Xiang-bi, HE Xun-yang, HU Ya-jun, SU Yi-rong. Effects of Organic Materials on Phosphorus Fractions and phoD-harboring Bacterial Community in Karst Soil[J]. Environmental Science, 2022, 43(9): 4636-4646.
有机物料投入对喀斯特地区土壤磷素赋存形态与含phoD基因细菌群落的影响
夏鑫1,2, 乔航1,2, 孙琪1,2, 刘坤平1,3, 陈香碧1, 何寻阳1, 胡亚军1,4, 苏以荣1     
1. 中国科学院亚热带农业生态研究所亚热带农业生态过程重点实验室, 长沙 410125;
2. 中国科学院大学, 北京 100049;
3. 中国科学院环江喀斯特农业生态试验站, 广西 547100;
4. 湖南农业大学农学院, 长沙 410125
收稿日期: 2021-11-30; 修订日期: 2022-01-23
基金项目: 国家自然科学基金项目（41601260）
作者简介: 夏鑫(1997~), 女, 硕士研究生, 主要研究方向为土壤生态与农业环境和喀斯特地区土壤磷活化, E-mail: xiaxin191@mails.ucas.ac.cn
通信作者: 胡亚军, E-mail: yjhu@isa.ac.cn; 苏以荣, E-mail: yrsu@isa.ac.cn
摘要: 针对喀斯特地区有机物料盈余、土壤养分贫瘠和易流失的特点，设置长期有机物料还田小区定位试验，试验包括6个处理：不施肥对照（CK）、无机肥（NPK）、无机肥+玉米秸秆（NPKS）、无机肥+农家肥（NPKM）、无机肥+滤泥（NPKL）和无机肥+甘蔗灰（NPKA）.研究不同有机物料投入对土壤磷赋存形态和磷活化功能微生物（含有机磷矿化基因细菌）群落结构的影响.通过3 a断续的观测，结果表明，土壤全磷（TP）、速效磷（Olsen-P）和二钙磷（Ca2-P）含量呈逐年增加趋势，而氯化钙磷（CaCl2-P）含量呈先降低再增加的趋势；与不施肥对照相比，有机物料投入尤其是滤泥配施能显著提高土壤全氮（TN）、TP、Olsen-P、CaCl2-P和Ca2-P含量，其次是甘蔗灰和农家肥配施处理；相关分析表明，CaCl2-P、Ca2-P和Olsen-P均与土壤交换性钙（Ca-ex）含量显著正相关；冗余分析（RDA）表明土壤TN、Ca-ex、有机碳（SOC）和土壤全钾（TK）含量是影响土壤磷组分的关键因子.高通量测序分析含有机磷矿化基因（含phoD基因）细菌群落结果表明，与不施肥对照相比，秸秆还田配施无机肥处理显著增加土壤含phoD基因细菌丰富度，但各处理间含phoD基因细菌群落结构无显著差异.RDA分析结果表明，土壤Ca-ex、TK、Olsen-P、pH和SOC是驱动含phoD基因细菌群落变化的关键因子.总体上看，无机肥配施滤泥、甘蔗灰和农家肥是广西喀斯特地区农田土壤较为合适的养分管理方式.研究可为喀斯特地区有机废弃资源利用与土壤磷素管理提供科学依据.
关键词: 喀斯特地区土壤      有机物料      磷素有效性      含phoD基因细菌群落      土壤微生物     
Effects of Organic Materials on Phosphorus Fractions and phoD-harboring Bacterial Community in Karst Soil
XIA Xin1,2 , QIAO Hang1,2 , SUN Qi1,2 , LIU Kun-ping1,3 , CHEN Xiang-bi1 , HE Xun-yang1 , HU Ya-jun1,4 , SU Yi-rong1     
1. Key Laboratory of Agro-ecological Processes in Subtropical Region, Institute of Subtropical Agriculture, Chinese Academy of Sciences, Changsha 410125, China;
2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China;
3. Huanjiang Station of Karst Ecosystem, Chinese Academy of Sciences, Guangxi 547100, China;
4. College of Agronomy, Hunan Agriculture University, Changsha 410125, China
Abstract: Efficient utilization of organic materials based on the rich resources in the karst region can promote soil fertility. Microorganisms have a crucial influence on soil phosphorus availability. phoD is considered to be the encoding phosphatase gene that can reflect the hydrolysis of organophosphorus compounds for the soil bacterial community. Molecular analysis of the phoD-harboring bacterial gene provides insight into promoting soil phosphorus availability under different fertilization managements. However, the effects of organic materials on soil phosphorus fractions associated with phoD-harboring bacterial communities are poorly understood. This study comprehensively investigated the effects of organic materials on soil phosphorus availability and explored environmental drivers of phoD-harboring bacteria in the Karst region. Here, six treatments were designed in the field as follows: non-fertilized control (CK), inorganic fertilization (NPK), inorganic fertilization combined with straw (NPKS), inorganic fertilization combined with manure (NPKM), inorganic fertilization combined with sludge (NPKL), and inorganic fertilization combined with sugarcane ash (NPKA). The phoD-harboring bacterial community in Karst region soil was analyzed using high-throughput sequencing. The results showed that the content of total P (TP), Olsen-P, and Ca2-P increased with the years after organic material application, whereas the content of CaCl2-P first decreased and then increased. Compared to that under the CK treatment, organic material application, especially NPKL treatment, significantly increased soil total nitrogen (TN), TP, Olsen-P, CaCl2-P, and Ca2-P contents, followed by those in the NPKA and NPKM treatments. Correlation analysis showed that the contents of CaCl2-P, Ca2-P, and Olsen-P were significantly positively correlated with soil exchangeable calcium (Ca-ex) content. Redundancy analysis (RDA) showed that TN, Ca-ex, soil organic carbon (SOC), and total potassium (TK) contents were the key factors affecting soil P fractions. Using high-throughput sequencing, we found that only NPKS increased the richness of phoD-harboring bacteria compared to that under the control treatment. No significant difference was observed in the phoD-harboring bacterial community among all treatments. The RDA model selected the Ca-ex, TK, Olsen-P, pH, and SOC as the key environmental predictors for the phoD-harboring bacterial community. In summary, soil phosphorus availability can be improved through the input of organic materials and inorganic fertilizer combined with manure, sludge, and ash. These additions were suitable for nutrient management and sustainable development in farmland soil in the Karst region of Guangxi.
Key words: karst soil      organic materials      phosphorus availability      phoD-harboring bacterial community      soil microorganism     

磷(P)是作物生长发育的必需营养元素, 是影响作物生长和产量的关键因素.大量施用磷肥是保障作物高产的重要措施.土壤富含的钙、铝和铁锰氧化物等对磷素专性吸附和固定的能力强, 一般土壤磷肥的当季利用率不足20%[1], 被土壤吸附固定的盈余磷素具有导致面源污染的潜在风险, 提高磷肥利用率是磷肥安全利用的前提, 也是土壤学科研究的前沿.

土壤中磷素具有复杂的无机磷和有机磷形态, 磷素的赋存形态在很大程度上决定了其有效性的供给.土壤无机磷一般分为钙磷酸盐、铝铁磷酸盐和闭蓄态磷.在石灰性土壤中, 无机磷以钙磷酸盐为主, 根据顾益初等[2]的研究, 将钙磷酸盐分成二钙磷(Ca2-P)、八钙磷(Ca8-P)和十钙磷(Ca10-P)这3种类型, 其中Ca2-P有效性最高, 是作物的第一有效磷源[3].土壤可溶性磷(CaCl2-P)是能够被作物根系直接吸收的磷素, 也能反映土壤磷素的潜在流失风险[4].土壤有机磷(Po)是土壤磷库重要的组成部分, 但不同类型的土壤中有机磷含量变幅较大.微生物通过分泌磷酸酶、植酸酶等胞外酶实现有机磷的矿化, 释放磷酸根离子[5~8]. phoD基因编码碱性磷酸酶是土壤细菌负责矿化有机磷的关键基因[9, 10], 已有研究表明含phoD基因细菌群落结构受到有机物料投入的影响[11, 12].因此, 在石灰性土壤中, Ca2-P、CaCl2-P和Po这3个磷组分可能会对磷素有效性影响较大.

有机物料投入一般被认为是提高土壤磷素有效供给的农业措施[13~16].一方面, 有机物料在分解过程中产生低分子量有机酸阴离子与土壤中吸附态磷产生竞争吸附[17, 18]; 另一方面, 有机物料作为微生物的碳源, 显著提高微生物数量与活性, 能够促进无机磷的活化与有机磷的矿化[19].有研究表明, 化肥与秸秆配施显著降低土壤磷吸附量, 而与牛粪配施则增强土壤磷吸附量, 表明有机物料类型对无机磷吸附解析的差别影响, 进而可能会对有效磷供给产生差异调控[20].近年来有研究发现长期不同有机物料的投入对含phoD基因细菌群落结构的影响存在差异[21~24], 有机物料类型对含phoD基因细菌群落结构的影响有待进一步研究.

我国西南喀斯特地区贫困人口众多, 耕地面积小, “人-地”矛盾突出, 容易陷入“贫困→土地高强度利用→土壤退化→贫困加剧”的恶性循环.该地区的农田土壤在长期高强度利用下退化严重[25].长期田间试验证实, 有机物料的投入能显著改善土壤肥力, 提高作物养分利用率[26~30].目前广西喀斯特地区养殖业、制糖工业发展迅速, 产生了大量秸秆、粪便、滤泥和糖渣等有机废弃物, 这为实现有机废弃物资源的可持续发展, 提升喀斯特地区农田土壤地力条件奠定了基础[31, 32].本研究通过设置对照、无机肥、无机肥+玉米秸秆、无机肥+农家肥、无机肥+滤泥和无机肥+甘蔗灰这6个处理, 通过探究不同有机物料投入对喀斯特地区磷素有效供给和磷活化功能细菌群落的影响, 以期提高废弃物资源利用率.

1 材料与方法 1.1 试验地概况

长期小区定位试验样地位于广西壮族自治区河池市(108°18′E; 24°43′N).该区属亚热带季风气候区, 年均降水量1 389.1 mm, 年均气温19.9℃, 主要地貌为典型喀斯特地貌.试验场地选择在典型的喀斯特峰丛洼地上.

1.2 试验设计

田间小区定位试验于2011年布置, 作物种植模式为玉米-大豆轮作模式, 设置6个处理：①不施肥对照(CK); ②无机肥(NPK); ③ 50%无机肥+50%玉米秸秆(NPKS); ④ 50%无机肥+50%农家肥(NPKM); ⑤ 50%无机肥+50%滤泥(NPKL)和⑥ 50%无机肥+50%甘蔗灰(NPKA).每个处理设置4个重复小区, 每个小区面积18 m2(3 m×6 m), 共24个小区.定位小区各施肥处理氮磷钾养分投入为玉米季N 200 kg·hm-2、P2O5 60 kg·hm-2和K2O 100 kg·hm-2; 大豆季N 22.5 kg·hm-2、P2O540 kg·hm-2和K2O 50 kg·hm-2.以有机肥替代无机肥的50%为基准, 其中NPKS和NPKA处理的施肥量按钾素计算, 不足50%的氮磷用无机肥补充, 而NPKM和NPKL处理的施肥量按氮素计算, 不足50%的磷钾用无机肥补充, 保证所有不同无机有机配施处理氮磷钾投入总含量相等.有机物料氮、磷和钾含量如表 1所示.

表 1 不同有机物料中氮、磷和钾含量/% Table 1 Nutrient contents of organic materials/%

1.3 样品的采集与测定

本研究于2012、2015和2019这3个年度采集土壤样品, 其中2012年和2015年土壤样品在作物的休闲季采集(冬季), 考虑到土壤微生物在作物休闲季活性较低, 在2019年玉米季的大喇叭口期采集土壤样品, 用于分析含phoD基因细菌群落结构. 3个年度的土壤样品均分析土壤理化性质和磷组分.土壤样品采集使用多点随机采样法, 用直径为5 cm的土钻在每个小区随机采集10个0~20 cm的土芯, 混合为一个土壤样品, 2012和2015年采集的土壤样品直接运回实验室, 2019年采集的土壤样品采用冰袋运回实验室.所有土壤样品经去除残存根系和碎石, 过2 mm筛并充分混匀, 2012和2015年的土壤样品经室内风干后用于分析土壤理化性质和磷组分, 2019年混合均匀的土壤样品分为两份, 一份样品在冷冻干燥后储存在-80℃进行phoD基因的分析, 另一份室内风干后测定土壤理化性质及磷组分状况.

土壤pH采用Mettler-toledo 320 pH计测定, 水土比为2.5∶1; 土壤有机碳(SOC)采用硫酸-重铬酸钾容量法测定[33]; 全氮(TN)采用半微量凯氏法-流动注射仪分析法[33], 用流动注射仪(AA3, SEAL, DE)自动上机测定; 全钾(TK)采用浓硫酸-高氯酸消煮法, 原子吸收仪(NOVAA350, Analytik Jena, DE)测定[33]; 土壤交换性钙(Ca-ex)采用1 mol·L-1乙酸铵溶液浸提, 电感耦合等离子体-原子发射光谱仪(ICP-OES-5110, Agilent, USA)测定[33]; 全磷(TP)采用浓硫酸-高氯酸消煮, 钼锑抗显色法测定[33]; Olsen-P采用0.5 mol·L-1碳酸氢钠溶液浸提, 钼锑抗显色法测定[33]; CaCl2-P采用0.01 mol·L-1氯化钙溶液浸提, 鉴于CaCl2-P含量较低, 采用灵敏度更高的孔雀石绿比色法测定[34]; Ca2-P采用0.25 mol·L-1碳酸氢钠溶液浸提, 钼锑抗显色法测定[33]; 土壤Po采用差减法测定[33], 具体方法为：将1.00 g土壤平均分为两份, 其中一份用550℃灼烧1 h, 取出冷却, 一份不灼烧, 两份样品分别用0.2 mol·L-1硫酸溶液浸提, 钼锑抗显色法测定, 灼烧后土壤样品与未灼烧的土壤样品测定差值即为有机磷含量.

采用PowerSoil DNA试剂盒(Mobio, Carsbad, CA, USA)提取土壤DNA, 使用超微量分光光度计(NanoDrop one, Thermo Fisher, USA)测定所提取土壤DNA的质量和浓度.采用phoD-F733(5′-TGGGAYGATCAYGARGT-3′)和phoD-R1083 (5′-CTGSGCSAKSACRTTC CA-3′)引物对phoD基因片段进行扩增[35], 25 μL的PCR反应体系如下：正向和反向引物各0.8 μL, 12.5 μL DNA聚合酶, 1 μL DNA, 无菌水9.9 μL.PCR扩增程序为：95℃变性5 min, 95℃下30 s, 58℃下30 s, 72℃下30 s, 30个循环, 最后72℃延伸5 min. PCR产物经过纯化后, 采用Novogene公司的Illumina NovaSeq 6000测序仪(2×250 bp双端测序)对PCR产物进行测序.测序得到的原始图像数据经base calling转化为序列数据, 再对序列数据进行过滤.分析流程大致如下：①过滤掉序列数据中的引物和bar-code序列; ②用flash软件将有重叠的序列数据对进行拼接; ③使用QIIME软件对拼接数据进行过滤, 过滤掉含N较多或含低质量碱基较多的序列; ④过滤掉拼接序列中的嵌合体序列; ⑤参考Hu等[36]功能基因高通量测序分析方法, 采用Usearch以75%的相似度进行OTU聚类, 提取每个OTU代表序列在NCBI数据库中进行比对, 去除比对结果为非phoD基因序列; ⑥合并所有样品序列, 综合所有数据再次进行OTU聚类及序列比对.在计算phoD基因丰富度之前, 对每个样品进行抽平, 以消除不均匀的序列偏差, 每个样本抽取14 653条序列.

1.4 数据的统计与分析

采用SPSS 19.0统计软件对土壤理化性质和磷组分数据进行正态性、方差齐性检验, 并通过该软件采用单因素方差分析(One-way ANOVA)中的Duncan检验法分别比较了不同有机物料投入处理和不同年限对土壤理化性质和磷组成影响的差异; 采用R语言(4.0.5)进行土壤磷组分与各理化因子之间的相关分析、土壤磷组分与有效磷之间的回归分析、不同有机物料投入处理下含phoD基因细菌群落的非度量多维尺度分析(NMDS)和相似性分析(ANOSIM), 其中相关性分析通过ggcor包实现, 回归分析通过“lm函数”实现, NMDS和ANOSIM分析通过vegan包实现; 采用CANOCO5.0分别以磷组分和含phoD基因细菌群落为响应变量, 土壤理化因子为解释变量进行冗余分析(redundancy analysis, RDA), 分析各个土壤理化因子对磷组成和含phoD基因细菌群落影响的大小.

2 结果与分析 2.1 长期不同有机物料投入下土壤养分性质的变化

各处理间土壤基本理化性质在2012年无显著差异.在2015年, NPKA处理的SOC含量显著高于NPK处理, 但这两个处理均与其他处理无显著差异; NPK处理的土壤TN含量显著低于其他各处理, 且其他各处理差异不显著; 土壤ω(TP)的变化范围为0.62~0.74 g·kg-1, 其中NPK处理最高; 土壤pH、TK和Ca-ex各处理间差异不显著.在2019年, 土壤pH在NPK处理最低, 显著低于CK、NPKM、NPKL和NPKA处理, 与NPKS无显著差异; 土壤TN含量在CK处理最低, 各处理的土壤TN含量较CK均有增加; 土壤ω(TP)的变化范围为0.72~0.89 g·kg-1, 各处理的土壤TP含量较CK处理有不同幅度的增加, NPKL和NPKA处理增幅最大; 各处理SOC、TK和Ca-ex无显著差异.整体上, 2012~2019年各处理间TP和Ca-ex呈显著增加趋势, 而土壤SOC、TN和TK均无明显变化(表 2).

表 2 不同有机物料下土壤养分概况1) Table 2 Soil nutrients under different organic materials application

2.2 长期不同有机物料投入下土壤磷赋存形态变化

如图 1, 各处理CaCl2-P含量在2012年和2015年无显著差异, 2019年NPKL处理的CaCl2-P含量显著高于其他处理, NPKM、NPKA处理CaCl2-P含量显著高于CK处理, 整体上, 从2012~2019年, CaCl2-P含量呈先递减再递增的趋势.NPKL处理的Ca2-P含量在2012年和2019年均显著高于其他处理, 在2015年显著高于CK、NPKS、NPKM和NPKA处理, 且从2012~2019年NPKL、NPKM和NPKA处理的Ca2-P含量呈现递增趋势, 而CK和NPK处理变化不显著.各处理的土壤Po含量在2012年和2015年均无显著差异, 在2019年Po含量在各处理中呈现差异, 其中NPKS处理最低, NPKL处理最高, 从2012~2019年, CK、NPK、NPKS和NPKA处理的Po含量有递减的趋势, 而NPKM和NPKL无明显变化(图 1).整体上, 2012~2019年各处理Olsen-P含量有递增的趋势. 2012年各施肥处理的Olsen-P含量均显著高于CK处理; NPKL处理Olsen-P含量在2015年和2019年均显著高于其他处理, 且NPKM和NPKA处理的Olsen-P含量显著高于CK处理(图 2).

不同小写字母表示不同处理之间的显著性差异(P < 0.05), 不同大写字母表示不同年份之间的显著性差异(P < 0.05) 图 1 不同有机物料投入下土壤磷组分含量 Fig. 1 Content of soil phosphorus fractions under different organic material applications

不同小写字母表示不同处理之间的显著性差异(P < 0.05), 不同大写字母表示不同年份之间的显著性差异(P < 0.05) 图 2 不同有机物料投入下土壤有效磷含量 Fig. 2 Soil available phosphorus under different organic material applications

2.3 土壤环境因子与磷组分的相关关系

相关分析结果表明(图 3)：Olsen-P与TP、TK和Ca-ex呈显著正相关; CaCl2-P与SOC和Ca-ex呈显著正相关; Ca2-P与TP、TK、Ca-ex、CaCl2-P和Olsen-P呈显著正相关; 土壤Po与TN、TK、SOC和pH呈显著正相关, 与TP和Ca-ex呈显著负相关, 见图 3.

不同颜色表示相关系数(蓝色和红色分别表示正相关和负相关); *、**和***分别表示P < 0.05、P < 0.01和P < 0.001 图 3 土壤环境因子与土壤磷组分的相关关系 Fig. 3 Relationships between fractions of the soil phosphorus with environmental factors

土壤磷组分与Olsen-P回归分析表明(图 4), 2012~2019年各磷组分与Olsen-P相关性逐年增强, CaCl2-P和Po与Olsen-P从相关关系不显著到显著正相关, Ca2-P与Olsen-P的相关性从弱相关关系(P < 0.05)到强相关关系(P < 0.001). 2019年, Ca2-P与Olsen-P的相关性高(R2=0.789, P < 0.001), Po与Olsen-P的相关性较低(R2=0.352, P < 0.01).

(a)~(c)表示2012年，(d)~(f)表示2015年，(g)~(i)表示2019年 图 4 土壤CaCl2-P、Ca2-P和Po组分与Olsen-P的回归关系 Fig. 4 Relationships between soil Olsen-P content and the fractions of phosphorus

采用冗余分析探究环境因子对土壤磷组分的影响(图 5).因子筛选结果表明, TN(F=27.3, P=0.002)、Ca-ex(F=27.3, P=0.002)、SOC(F=7.2, P=0.014)和TK(F=6.3, P=0.01)是影响磷素组分的显著因子.且Po与TN、SOC和TK呈显著正相关, CaCl2-P、Ca2-P和Olsen-P与Ca-ex呈显著正相关.

蓝线和红线分别表示为土壤磷组分和土壤环境因子 图 5 环境因子与土壤磷组分的RDA分析 Fig. 5 Redundancy analysis revealing the effects of environmental factors on soil phosphorus fractions

2.4 有机物料投入对含phoD基因细菌多样性与群落结构的影响

与CK相比, 所有处理均有增加含phoD基因细菌的丰富度的趋势, 但仅NPKS处理差异显著, 香农多样性指数在所有处理间差异不显著(图 6).

不同小写字母表示不同处理之间的显著性差异(P < 0.05) 图 6 phoD基因的细菌α多样性丰富度和香农多样性指数 Fig. 6 The α diversity of phoD-harboring bacterial richness and Shannon index

各处理中蓝细菌门(Cyanobacteria)相对丰度最高(39.3%), 其次为浮霉菌门(Planctomycetes, 17.2%)、变形菌门(Proteobacteria, 6.6%)、厚壁菌门(Firmicutes, 4.9%)、放线菌门(Actinobacteria, 0.7%) (图 7).相对丰度排序前6的物种丰度在各处理间均无显著差异(图 8). RDA分析结果表明, Ca-ex(F=7.8, P=0.002)、TK(F=4.1, P=0.002)、Olsen-P(F=3.5, P=0.008)、pH(F=2.6, P=0.032) 和SOC(F=2.7, P=0.036)是影响含phoD基因细菌群落结构的关键因子, 所有预测因子共解释群落结构变异的57.15%[图 9(a)]. 基于Bray-Curtis距离的非度量多维尺度排序结果表明, 未施肥对照处理与所有有机物料投入处理的含phoD基因细菌群落结构存在分离趋势, 但相异性统计结果表明, 各处理含phoD基因细菌群落结构差异不显著[P>0.05, 图 9(b)].

图 7 门分类水平上含phoD基因细菌群落比较 Fig. 7 Comparison of soil phoD-harboring bacterial groups at phylum level

不同小写字母表示不同处理之间的显著性差异(P < 0.05) 图 8 相对丰度排序前6的OTU Fig. 8 OTU with relative abundance in the top six

图 9 含phoD基因细菌群落结构与环境因子变化的RDA分析和含phoD基因细菌群落结构排序 Fig. 9 RDA analysis between phoD-harboring bacterial community and environmental factors and the diagram of phoD-harboring bacterial community structure based on Bray-Curtis dissimilarity

3 讨论 3.1 土壤磷含量及其组分对有机物料投入的响应

8 a田间试验结果表明, 各有机物料处理下土壤有效磷在前4 a增幅较快, 后4 a增幅变缓, 该结果表明持续有机物料投入提高土壤有效磷供给可能是非线性的.本试验前期有机物料投入对有效磷供给影响较大, 其原因可能是有机物料矿化分解过程的中间产物如有机酸等, 对土壤钙离子具有络合作用, 产生对磷素的竞争吸附, 从而提高磷素的有效性.在试验后期, 有机物料矿化的中间产物对钙离子的络合趋于饱和, 导致中间产物的竞争吸附能力下降, 从而使有机物料促进磷活化的能效降低.总体上, 土壤Ca-ex含量与Olsen-P和磷组分均呈极显著正相关(P < 0.001), 这一结果与Tunesi等[37]的研究结果一致, 表明提高土壤Ca-ex含量能够促进磷素有效性.

滤泥、农家肥和甘蔗灰投入能够持续增加Ca2-P含量, 而Ca2-P是土壤中有效磷和植物磷吸收的主要来源[38], 说明相较于玉米秸秆, 这3种有机物料活化磷素的能力更强. 3种有机物料对磷素的活化机制可能存在共性机制, 也存在差异机制.有机物料投入引起的磷素竞争吸附机制是主要的共性机制, 而不同有机物料的特点也会导致磷素活化的差异, 比如：农家肥的投入引入了较多的外源微生物, 这些微生物中可能存在多种解磷菌[39].甘蔗灰质地细小、疏松多孔, 比表面积大, 稳定性高, 其竞争吸附能力可能高于农家肥和滤泥[40].滤泥中含较多的活性碳源, 能够为微生物提供碳源底物, 从而促进微生物磷素活化.各处理Po含量超过300 mg·kg-1, 但有效磷和Po的回归系数(0.352)远小于和Ca2-P的回归系数(0.789), 表明有效磷主要来源于土壤无机磷组分, 而不是有机磷组分.值得注意的是, 未施肥对照的Po含量并未低于各施肥处理, 理论上, 在不施肥处理中, 微生物为满足自身磷的需求, 有机磷的矿化速率会加快, 导致Po含量的降低.造成这一结果可能原因是不施肥土壤中, 有效磷的含量高于5 mg·kg-1, 已经能够满足微生物的基本需求.有趣的是, 本研究发现各有机物料处理下的CaCl2-P在8 a内先降低后增加, 而CaCl2-P是作为磷素流失风险评估的指标之一, 这说明长期施加有机物料对降低磷素流失风险可能具有时效性, 在有机物料投入前期增加的速效磷能够被植物和微生物利用, 使得磷素流失风险降低, 而后期持续增加的速效磷造成盈余磷增加, 可能加剧磷素流失风险.

3.2 含phoD基因细菌群落对有机物料的响应

本研究中有机物料投入与不施肥和无机肥处理的含phoD基因细菌群落呈现分离, 但差异不显著, 这与另一个喀斯特长期有机无机肥配施定位试验结果不一致[36].这可能存在多方面的原因, 一是本研究采用的引物与前述研究不一致, 本研究采用的引物扩增范围更宽, 可能导致群落差异不显著; 二是本研究处理时间不够长; 三是本研究采集土壤样品是处于雨季, 土壤含水量高, 某一类的微生物快速生长可能干扰试验处理对微生物群落的影响, 本研究中也的确观察到适应水生环境的含phoD基因蓝细菌大量存在.本研究中, 相对丰度前6的OTU在各处理之间差异性不显著, 与丰度较高的含phoD细菌相比, 稀有的含phoD细菌可能对有机磷矿化影响较大, 已有研究也证实了这一观点[41].

与已有研究的结果一致, 本研究亦发现有机碳是驱动含phoD基因细菌群落结构的主要因子, 这说明了碳源底物对微生物有机磷矿化的重要性.有研究表明碱性磷酸酶基因丰度与碳矿化相关的酶活性和基因丰度显著正相关[42], 并认为微生物对有机磷的矿化是有机碳源矿化的副产物[43].另外, 交换性钙也被认为是影响含phoD基因细菌群落结构的关键因子.有研究表明, 钙离子是碱性磷酸酶的重要辅酶因子, 可能对特定微生物碱性磷酸酶的分泌具有促进作用, 从而导致含phoD基因细菌群落产生分异[44].土壤TK也能显著影响含phoD基因细菌群落, 这与Wang等[45]的研究结果一致, 但土壤TK对含phoD基因细菌群落影响的机制尚不明确.

4 结论

(1) 不同有机物料投入均能够提高土壤磷素有效性, 与玉米秸秆、农家肥和甘蔗灰相比, 滤泥对磷有效性的提升效果最佳.土壤有效磷主要来源于无机Ca2-P组分, 而非有机磷组分.

(2) 在喀斯特地区的土壤中, 土壤磷素有效性与交换性钙含量密切相关, 提高喀斯特土壤交换性钙含量能促进土壤磷素有效性.滤泥、农家肥和甘蔗灰的投入下, 交换性钙的含量相对较高.

(3) 相对丰度高的含phoD基因细菌在各处理间并未表现显著差异, 不同有机物料投入对含phoD基因细菌群落影响差异亦不显著, 但众多的土壤因子影响了含phoD基因细菌群落结构.

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