2. 华南理工大学医疗器械研究检验中心, 广州 510006
2. Medical Devices Research and Testing Center, South China University of Technology, Guangzhou 510006, China
微塑料是指环境中粒径小于5 mm的塑料类污染物, 包括颗粒、薄膜和纤维等不同形貌类型[1].微塑料作为一种新型污染物, 已成为全球性的环境问题, 近年来受到国内外广泛关注, 然而目前大多数研究都集中于水生态系统[2~4].由于土壤是由复杂的矿物-有机质组成, 并且水环境的研究方法不适用于土壤生态研究等原因, 使得微塑料对土壤环境污染影响的研究较少[5].事实上大部分塑料碎片都是在陆地上被生产, 使用并丢弃的[6].微塑料可以通过长期的农用地膜残留、有机肥和污泥的施用、地表水灌溉和大气沉降等方式进入土壤环境[7].这些进入土壤中的微塑料, 在长期的风化作用、紫外照射及其与土壤中其他组分的相互作用下, 表面逐步老化、粗糙, 微塑料逐渐裂解, 粒径变小, 比表面积增大, 吸附位点增加, 表面官能团增多, 疏水性增强, 辛醇/水分配系数升高, 在土壤pH、盐度、有机质和离子交换等复杂因素的调控下, 对土壤重金属和有机污染物的吸附能力也逐渐增强, 从而改变土壤理化性质, 影响土壤生态系统健康[8, 9].因此, 研究微塑料污染对土壤环境的影响十分必要.
迄今为止, 虽然已有大量关于由电子废物拆解所导致当地土壤重金属污染的报道[10], 但微塑料表面从周围土壤中所吸附重金属以及微塑料本身固有重金属的数据仍知之甚少.此外, 微塑料可为微生物提供吸附位点, 使其长期吸附在微塑料表面, 形成生物膜, 并可以伴随微塑料的迁移, 扩散到其他生态系统中, 改变生态系统的菌群和功能[11].目前, 已有研究报道微塑料表面微生物具有高丰富度和多样性的特征, 包括一些对海洋生物多样性有危险的致病性菌株[11~13]; 但对寄居在土壤微塑料表面微生物的报道仅有2篇[14, 15].还有研究发现, 电子废物拆解区土壤微塑料表面微生物的来源与微塑料周围的土壤环境有着密不可分的关系[15], 但影响其表面微生物群落组成的土壤环境因子尚不清楚.这些都极大地限制了微塑料在生态毒理学和微生物学方面的研究进展.
以广东汕头市贵屿镇为研究对象, 该区域自20世纪90年代, 由上千家家庭式小作坊, 使用原始粗暴的拆解方法回收电子废弃物中的各类贵金属及可回收零部件[16].与此同时, 电子废弃物拆解过程中所产生大量的微塑料被随意倾倒在土壤中.因此, 本研究探究该区域典型拆解场地土壤中的微塑料从周围环境中吸附到其表面的金属成分, 对比微塑料固有的重金属含量与土壤重金属含量; 并分析微塑料表面微生物群落结构组成与土壤环境因子之间的关系, 以期为我国电子废物拆解区土壤中微塑料污染调查和研究提供基础数据信息和科学参考价值.
1 材料与方法 1.1 样品采集针对研究区域内3块废弃的以不同拆解方式所造成的电子废物拆解样地:北林(手工拆解)、龙岗(塑料粉碎)和仙彭(露天焚烧)为调查对象(图 1), 共采集了75个样本进行分析.在每块样地中, 用直径为5 cm的土钻随机钻取0~20 cm土层土样(n=5), 将土样用四分法混合均匀后过2 mm筛, 剔除细根、石块和动植物残体等, 自然风干后, 用于测定土壤理化性质和重金属含量; 并随机采集微塑料(n=17)和其周围土壤(n=3)分别装至2 mL无菌离心管中后, 放入冷藏箱带回实验室以便后续处理分析.
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图 1 采样点示意 Fig. 1 Information of sampling sites |
微塑料表面微观形貌运用扫描电子显微镜(SEM, Merlin, Zeiss, Germany)进行观察鉴定, 并结合能谱仪(EDS, XFlash Detecor 6|30, Bruker, Germany)分析所选取的表面微域的金属元素组成.土壤重金属含量以及微塑料固有的重金属含量采用ICP-OES(iCAP 7200, Thermo Scientific, USA)进行测定, 其测定方法参照文献[17].土壤理化性质见表 1, 其测定方法参照文献[18], 即土壤pH值采用便携式pH计(FE20, Mettler Toledo, Switzerland), 水土比为2.5 ∶1, 振荡30 min后测定.土壤有机质(SOM)用(Analytikjena)multi N/C 3100型TOC分析仪测定.总氮(TN)用元素分析仪(Elementar Vario EL Ⅲ, Germany)测定, 铵态氮用靛酚蓝比色法, 硝态氮用紫外分光光度法来测定速效氮(AN)含量.速效磷(AP)测定采用钼锑抗比色法, 使用酸液浸提土样中的磷, 随后以钼锑钪显色剂进行显色, 然后使用紫外-可见分光光度计测定总磷(TP)含量.分别通过火焰原子吸收分光光度法(FAAS)和中性醋酸铵法测定总钾(TK)和速效钾(AK)的含量.
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表 1 土壤理化性质1) Table 1 Physicochemical properties of sampled soils |
1.3 微塑料表面微生物分离
将微塑料样品带回实验室后, 对其表面微生物进行分离.首先向无菌离心管中滴入磷酸缓冲盐溶液, 置于自动振荡器中振荡, 将振荡后的微塑料用无菌镊取出; 再将与微塑料一起振荡后的混合溶液置于高速冷冻离心机中离心, 弃上清液, 得到微塑料表面微生物, 并保存在-80℃冰箱内, 直到DNA提取.
1.4 DNA提取和16S扩增子测序使用HiPure Soil DNA试剂盒(Magen Biotech, Guangzhou, China)对样品进行DNA提取, Qubit 3.0 Fluorometer(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)检测DNA样品的浓度, MetaVxTM文库构建试剂盒, 构建测序文库.以30~50 ng DNA为模板, 采用包含"CCTAC GGRRBGCASCAGKVRVGAAT"序列的上游引物341F和包含"GGACTACNVGGGTWTCTAATCC"序列的下游引物806R扩增V3和V4区.另外, 通过PCR向16S rDNA的PCR产物末端加上带有Index的接头, 以便进行测序.
使用Agilent 2100生物分析仪(Agilent Technolo-gies, Palo Alto, CA, USA)检测文库质量, 并且通过Qubit 3.0 Fluorometer检测文库浓度.DNA文库混合后, 按Illumina MiSeq(Illumina, San Diego, CA, USA)仪器使用说明书进行2×250 bp双端测序, 由MiSeq自带的MiSeq Control Software(MCS)读取序列信息.
1.5 数据分析首先利用QIIME(1.9.1)[19]对原始数据进行去接头和低质量过滤处理, 然后去除嵌合体序列, 得到有效序列后进行聚类分析, 按97%的序列相似度进行归并和OTU划分, 并选取每个OTU中丰度最高的序列作为该OTU的代表序列, 通过将OTU代表序列与Silva 132数据库的模板序列相比对, 获取每个OTU所对应的分类学信息.随后采用Spearman等级相关系数对微塑料表面细菌群落平均丰度前50的属和土壤环境因子之间的关系进行探索, 并用R语言的Heatmap包绘制热图.
2 结果与分析 2.1 微塑料表面形态及吸附的金属元素如图 2所示, 从土壤样品中随机挑选出微塑料, 通过SEM观察其表面形态.在观察前, 将微塑料样品用超声波清洗, 除那些抗超声波的材料外, 大多数松散附着的材料都从微塑料表面去除.图 2表明, 所有的微塑料表面都具有老化和降解的迹象; 包括裂痕、孔洞, 及不均匀的凸起和凹陷[图 2(a)和2(b)], 表层似乎已与下层分开[图 2(a)].图 2(c)和2(d)表明微塑料表面还具有粗糙的毛边, 鳞状的凸起和附着的颗粒等等.利用SEM所配备的EDS对微塑料表面的金属元素组成进行分析.EDS能谱显示微塑料表面存在多种类型的金属元素, 如Si、Cd、Ba、Pb和Al等元素(图 3).但在同一微塑料样品的不同表面位置, 金属元素类型存在较大差异, 说明微塑料所携带的一些金属元素并非本身存在, 而是来自于周围土壤环境.
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图 2 土壤中微塑料的表面形貌特征 Fig. 2 Surface morphology of microplastics in the soil |
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图 3 土壤中微塑料的SEM-EDS局部影像图 Fig. 3 SEM-EDS images of microplastic in the soil |
基于EDS所检测出微塑料样品表面的重金属元素, 分别对3块样地的微塑料以及其周围土壤的7种重金属(Pb、Cd、Cr、As、Ba、Co和Ni)含量进行了测定.微塑料和土壤中各重金属含量见图 4, 微塑料固有的重金属含量在不同样地中有所不同, 这可能是由于在每块样地所拆解的电子废物种类不同所导致的.而土壤的重金属含量在不同样地中的差异却不明显.此外, 除龙岗样地土壤中Ni的含量高于微塑料的浓度之外, 微塑料中各重金属含量均高于周围土壤.不难发现Ba在所有重金属中含量最高, 尤其在龙岗和北林样地, Ba在微塑料中的含量比在土壤中高出103数量级.Ba在塑料中主要以BaSO4的形式存在, 因具有化学惰性强, 稳定性好、耐酸碱、硬度适中、高比重、高白度和能吸收有害射线等优点, 因此作为填料广泛添加于各种塑料中, 如聚丙烯(PP)和尼龙(PA)等.
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图 4 3块样地微塑料及土壤的重金属含量 Fig. 4 Contents of heavy metals of microplastics and soils from three plots |
图 5展示了3块样地中土壤微塑料表面细菌群落平均丰度前50的属与土壤环境因子之间的关系.在不同的样地中, 有些微塑料表面细菌群落与同样的土壤环境因子之间的相关性是一致的.例如:Pedomicrobium属在龙岗样地和仙彭样地中与土壤AP都呈显著正相关, Flavisolibacter和Bryobacter属在龙岗样地中的相关性与在北林样地保持一致.但有些微塑料表面细菌群落与相同的土壤环境因子之间的相关性却恰恰相反.例如:Qipengyuania属和Phenylobacterium属在龙岗样地中与土壤pH呈显著负相关, 与Pb和Ni呈显著正相关; 但在北林样地中与土壤pH呈显著正相关, 与Pb和Ni呈显著负相关.同时, Gaiella属和Dongia属在龙岗样地中与土壤TK和AK呈显著正相关, 与Co、Ba、Cr、TN、AN、SOM和TP呈显著负相关; 但在北林样地中与土壤TK和AK却呈显著负相关, 与Co、Ba、Cr、TN、AN、SOM和TP呈显著正相关.此外, Sphingomonas属在龙岗样地中与土壤AP呈显著正相关, 但在仙彭样地中却与其为显著负相关.
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图 5 3块样地微塑料表面细菌群落平均丰度前50的属与土壤环境因子的相关性热图 Fig. 5 Heat map of correlations between the top 50 microplastic-associated bacterial genera and environmental factors in three plots |
由于长期暴露在土壤中, 以及原始的拆解方法, 如化学、机械和露天焚烧等可能是造成贵屿土壤微塑料表面形态发生变化的主要原因.这些因素增加了微塑料表面的粗糙程度, 改变了其理化性质, 金属的积累可能通过二价阳离子和氧阴离子与塑料表面带电或极性位点之间的相互作用, 以及中性金属-有机复合物与疏水性表面之间的非特异性相互作用而进行[20].同时, 实验室实验和实地环境监测也证明了微塑料可以从周围环境中吸附金属离子[21~24].另外, 微塑料表面所形成的生物膜以及由于风化作用所形成的极性官能团(例如:酮)都会增加金属的积累[25, 26].因此, 由于微塑料长期存在于环境中并与微生物接触, 它们之间的相互作用值得关注.并且随着微塑料在环境中的分解, 极性或表面积的增加仍可提高对金属的吸附能力.
然而, 通过探究微塑料对金属的长期吸附数据以及微塑料自身的重金属与土壤所含重金属浓度相对比, 发现微塑料携带的大部分重金属来源于其固有负载.由图 4可见, 贵屿土壤微塑料含有较高的重金属含量, 这可能归因于微塑料主要来源于各类电子废物.在塑料制造过程中, 金属通常作为固有负载添加(例如催化剂、颜料和稳定剂), 以提高塑料的日常使用性能[22, 27].总的来说, 微塑料中添加了不同浓度水平的重金属, 这一结论与之前的研究一致[17, 28, 29].
在贵屿, 废弃的拆解场地与农用地之间的距离很近, 并且当地农民使用污水灌溉农田, 甚至直接在有些未被修复过的拆解场地中种植农作物.农业的耕作会加速微塑料在土壤中的分解, 这可能会导致化合物的浸出, 对当地的食品安全造成危害.此外, 近期有研究表明, 亚微米级塑料可直接被作物的侧根部位吸收并在植物体中累积[30], 而这些微塑料可能会通过食物链的传播, 最终进入人体.虽然人们对生物体所摄入微塑料和重金属之间相互作用的影响知之甚少, 但可以进一步研究微塑料在模拟生理条件下所释放的重金属, 因为在肠道条件下有机污染物的浸出率比在海水中更高[31].微塑料的摄入为重金属、未反应残留单体和持久性有机污染物向生物体转移提供了潜在途径[32].不可否认的是, 塑料在分解成更小的微塑料后, 对生态系统的危害会增加, 造成这一现象的主要原因是微塑料在分解过程中会释放出重金属等有毒物质.
3.2 微塑料表面微生物与环境之间的相互作用由于微塑料表面具有疏水性以及较大的比表面积, 其可以作为微生物的寄居地[11, 12].虽然微塑料为惰性材料, 但其所含(表面吸附和内载固有)的污染物(持久性有机污染物和增塑剂等)可以作为微生物的生长碳源[15], 微生物可能更倾向于生活在微塑料表面.此外, 不同性质的塑料和塑料中添加剂(在制造过程中有意添加以提高材料性能的化合物)的数量和组成都会影响微塑料表面微生物的物种组成[33].但这些微生物主要来源于微塑料所处的周围环境, 因此环境因子的差异会直接影响微塑料表面微生物群落.在贵屿镇调研的由3种不同拆解方式所导致的电子废物污染场地具有不同的土壤环境因素, 这些因素与微塑料表面微生物的相关性也存在差异.为了适应不同的微塑料特性及其周围的生态环境, 这些微生物已经进化出很多的依附机制[33].此外, 拆解场地中存在大量的疏水性有机污染物, 而这些污染物在微塑料和土壤之间的传输可能会受到微生物的影响, 一方面是由于微生物的吸附特性, 另一方面是因为其具有代谢污染物的能力[34].许多细菌、真菌和藻类都有降解有机污染物的能力[35], 这也证明了微生物对塑料相关化学物质的积累和/或通过代谢去除具有很高的相关性, 并且可能会影响微塑料的生物可利用性.由于环境因素、材料和生物表面特性都会对微生物附着在微塑料表面造成影响, 任何栖息在微塑料表面的微生物都是选择过程的结果.影响微塑料表面的群落及其决定群落结构和演替模式的潜在因素是亟待解决的科学问题.
微生物不仅是构成土壤生态系统的重要组成部分, 也是环境塑料生物修复最有希望的候选者.然而, 大多数普通塑料被证明是非常顽固的, 即使在已知有利于微生物降解的条件下.此外, 一旦塑料进入了土壤环境中将会持久存在.不仅如此, 微塑料作为具有疏水表面的外源性颗粒, 极有可能为异养微生物活性提供新的底物, 使其表面微生物群落与周围环境和其他有机残留物明显不同[36~38].总之, 微塑料研究所面临的挑战是考虑在不同环境条件下, 不同种类微塑料与附着在其表面微生物的之间的相互作用, 从而为微塑料对土壤环境的影响提供科学的风险评估.
4 结论(1) 贵屿镇电子废物拆解区土壤微塑料表面具有老化和降解的迹象, 且存在多种金属元素; 但在同一微塑料样品的不同表面位置, 金属元素类型存在较大差异.
(2) 微塑料固有的重金属含量在不同样地中有所不同, 且几乎均高于周围土壤.
(3) Ba在塑料中主要以BaSO4的形式存在, 其含量比在土壤中高出103数量级.
(4) 在不同的样地中, 微塑料表面细菌群落与土壤环境因子之间的相关性有所差异.
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