2. 广州大学珠江三角洲水质安全与保护教育部重点实验室, 广州 510006;
3. 广州大学环境科学与工程学院, 广州 510006
2. Key Laboratory for Water Quality and Conservation of the Pearl River Delta, Ministry of Education, Guangzhou University, Guangzhou 510006, China;
3. School of Environmental Science and Engineering, Guangzhou University, Guangzhou 510006, China
传统的硝化反硝化生物脱氮工艺, 耗氧量高且需额外投加有机碳源[1].作为近年来生物脱氮的研究热点, 全程自养脱氮(completely autotrophic nitrogen removal over nitrite, CANON)工艺是一种基于亚硝化的全程自养生物脱氮工艺, 该工艺是在一体化反应器体系内同时实现亚硝化与厌氧氨氧化反应[2].CANON工艺无须添加有机碳源和节省50%耗碱量、62.5%耗氧量[3], 脱氮途径短[4].然而, CANON工艺理论上只能去除89%的氮素, 产生11%的硝氮, 并且不能去除废水中不同基质浓度的有机物[5].考虑到实际运行中CANON工艺受到溶解氧、温度、pH值和微生物分布特征等因素的影响, 其脱氮效率往往达不到理论值.顾澄伟等[6]以纤维载体为填料, 同时接种亚硝化污泥和ANAMMOX泥, 85 d成功启动CANON工艺, 稳定运行下平均总氮去除率为74.4%.付昆明等[7]通过接种CANON污泥, 以人工配制无机高氨氮废水为对象, 经过60 d成功启动CANON反应器, 总氮去除率最高为75.6%.而同步亚硝化、厌氧氨氧化耦合反硝化(simultaneous partial nitrification, ANAMMOX, and denitrification, SNAD)工艺是在CANON工艺基础上额外添加有机碳源引入适量的反硝化菌.相比于CANON工艺, SNAD工艺能同时实现有机物和总氮去除率的提高[8].
目前, 关于SNAD工艺的研究多采用SBR反应器[9~12], 而针对浸没式生物滤池反应器(submerged biological aerated filter, SBAF)启动SNAD工艺的研究鲜有报道.有研究表明, 采用SBAF能提高氨氮去除率并且微生物附着在填料粗糙多孔的内部和表面, 从而维持较高的生物量和减少生物量的流失[13, 14].浸没式生物滤池反应器采用连续进水的方式可以及时排除反应器内的有害物质, 避免有害物质的积累导致脱氮性能的下降[15].与此同时, 其采用气水平行上向流, 使水和气进行极好地均分, 能有效防止气泡在滤层中凝结, 并且其较好的气水混合效果能有效避免滤料的堵塞[16].
因此, 本试验采用浸没式生物滤池反应器, 接种亚硝化污泥和富集ANAMMOX菌的火山岩填料, 在常温下实现了SNAD系统的启动及稳定运行, 并考察了启动前后各种细菌的丰度变化情况, 以期为浸没式生物滤池SNAD工艺在工程实践中的应用提供借鉴和依据.
1 材料与方法 1.1 试验装置和材料本试验采用浸没式生物滤池反应器(图 1).装置由有机玻璃制成, 高100 cm, 内径9 cm, 有效容积为2 L.采用直径4~10 mm的黑色火山岩为填料, 其孔隙率为58.5%, 装填高度70 cm.滤池底部装填5 cm厚的玻璃珠承托层.反应器采用上向流, 沿水流方向每隔一段距离设取样口和取料口, 取样口高度分别为10、30、50、70和90 cm, 取料口高度分别为15、40和65 cm.反应器底部设曝气装置, 由转子流量计控制曝气量大小, 滤池底部设有进水口, 顶部设有排气口, 外部设置水浴层(23~27℃)并缠绕黑色塑料袋以避光和保温.滤柱上方设有温度和pH在线监测系统.
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图 1 反应器装置示意 Fig. 1 Schematic diagram of the submerged biological aerated filter (SBAF) |
本试验用水采用模拟晚期垃圾渗滤液废水, 配水中添加适量的NH4Cl、NaHCO3、K2HPO4和葡萄糖配置而成, 添加微量元素溶液0.35mL·L-1.其中微量元素溶液成分为FeCl3·6H2O 3.515 g·L-1、MnCl2·4H2O 0.359 g·L-1、CuSO4·5H2O 0.075 g·L-1、ZnSO4·7H2O 0.300 g·L-1和CoCl2·6H2O 0.375 g·L-1.由于配水中溶解氧浓度较高, 且试验过程中没有对原水进行吹脱, 因此少量NH4+-N氧化成NO2--N, NO3--N为0~5 mg·L-1, 主要来源于自来水自身.进水pH通过NaHCO3调节, 控制在7.5~8.5.
反应器接种的亚硝化污泥来自于实验室稳定运行的亚硝化SBR反应器, 反应器亚硝化率在85.9%以上, 亚硝化容积负荷在0.6 kg·(m3·d)-1左右, 污泥浓度为3500 mg·L-1, 接种量为1 L.富集ANAMMOX的填料来自运行稳定的上向流火山岩填料厌氧氨氧化滤柱, 总氮去除率稳定在85.5%左右, 总氮去除负荷为0.5 kg·(m3·d)-1.
1.3 试验方法反应启动前6 d为挂膜阶段, 采用SBR运行方式对反应器进行挂膜, 利用蠕动泵将容器中的模拟废水打入反应器中, 并将反应器出水回流至上述容器中, HRT为24 h.反应器运行分为4个阶段.阶段一:CANON工艺启动阶段.反应器采用连续流低曝气方式, 通过逐渐降低进水NO2--N浓度和间歇曝气的方法提高AOB的活性, 使得AOB和ANAMMOX在同一反应器内协同生长.阶段二:CANON工艺工况优化及稳定运行.通过提高进水负荷并调节曝气量和曝停时间寻找使反应器总氮去除率及总氮去除负荷均达到最佳值的运行工况.阶段三:SNAD启动阶段.通过添加不同基质浓度的有机物富集反硝化菌, 进一步提高总氮去除率同时去除COD.阶段四:SNAD稳定运行, 控制反应器在最优工况条件下运行, 从而提高出水水质.
1.4 检测指标和方法本试验废水中氮素测定采用国家标准方法, 具体方法见表 1.本研究中有一些指示系统运行情况的参数与指标:总氮、总氮去除率、总氮去除负荷, 氨氮去除率、游离氨(FA)和特征比, 其计算方法如下:
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表 1 检测指标和分析方法 Table 1 Detection indicators and analysis methods |
1.5 DNA提取与荧光定量PCR
本试验分别在第6、55和115 d从滤池底部和中上部取料口取出生物样品, 采用PowerSoil DNA Isolation Kit试剂盒(MoBio公司, 美国)提取活性污泥中的DNA, 提取后的DNA产物经Q3000紫外分光光度计(Quawell Technology Inc, 美国)测定其浓度和纯度, 提取好的DNA置于-80℃冰箱保存, 便于后续进行定性定量分析.
本试验中涉及到的脱氮微生物主要有AOB、NOB、ANAMMOX和反硝化菌, 因此分别用其相关功能基因片段的质粒来作为定量标准品.利用Stepone实时定量PCR仪对样品的脱氮功能菌及功能基因进行定量.扩增反应总体积为25 μL, 包括1 μL DNA模板和24 μL反应液, 反应液由12.5 μL 2 Taq PCR Master mix (上海生工), 9.5 μL 1x TE buffer (上海生工)和正反向引物各1 μL组成.每个样品重复3次.定量PCR所用的引物及扩增程序如表 2所示.
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表 2 试验所用引物及其扩增程序 Table 2 Primers used in the experiment and the amplification procedures |
2 结果与分析 2.1 反应器不同阶段运行效能及控制策略
本试验先启动CANON工艺, CANON工艺稳定运行后外加不同浓度的葡萄糖为碳源引入反硝化菌启动SNAD工艺.反应器运行过程中氮素去除情况与各个阶段的控制参数, 总氮去除负荷、氨氧化率和总氮去除率变化, 分别如表 3和图 2所示.
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表 3 各阶段进出水水质及工况调节1) Table 3 Water quality and condition adjustment of the influent and effluent at different stages |
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图 2 反应器中的氮素变化 Fig. 2 Variations of nitrogen concentrations |
经过6 d厌氧状态下的挂膜, AOB的活性受到了严重抑制.反应器启动初期, AOB氧化NH4+-N的能力受限制, 亚硝化速率低于厌氧氨氧化速率, NO2--N消耗速率大于其生成速率, 呈现NH4+-N去除率较低的情况, 亚硝化生成的NO2--N不足以提供给ANAMMOX进行反应.付昆明等[20]的研究表明, 随着初始NO2--N浓度增加, ANAMMOX的底物限制因素解除且脱氮效率提高.故第7 d起进水NO2--N浓度为50 mg·L-1以保证ANAMMOX有足够的NO2--N基质进行反应, 同时反应器开始以间歇曝气连续流的模式运行.第14 d出水NH4+-N浓度为0.0 mg·L-1, 说明体系内AOB活性有一定的提高.第38 d反应器的总氮去除负荷达到1.1 kg·(m3·d)-1并能稳定运行, 总氮去除率连续5 d大于70.0%, 反应器启动成功.
岳秀等[21]在淹没式生物滤池反应器中经过51 d实现CANON的快速启动, 最高总氮去除率为85.9%.本试验中反应器用时38 d, 实现亚硝化、厌氧氨氧化的协同脱氮, 总氮去除负荷超过1.1 kg·(m3·d)-1.其主要基于以下几点:本反应器以生物膜法启动CANON工艺, 其原理主要是AOB在膜外利用溶解氧实现亚硝化, 提供基质和低溶解氧的环境在膜内进行厌氧氨氧化.其次, 本反应器采用火山岩填料, 其孔隙和比表面积大, 有利于微生物依附于其表面和内部孔道, 维持反应器内较高的生物量, 火山岩填料反应器较其他形式的生物膜反应器具有较好的处理效果[22].第三, 本反应器启动采用间歇曝气的方式, 间歇曝气造成的短暂厌氧环境能够有效抑制NOB的生长, 而对AOB无明显影响.研究表明, 间歇曝气相对于连续曝气更快实现AOB和ANAMMOX的富集, 更有利于达到较好的总氮去除效率, 维持CANON的稳定运行[23].第四, 反应器较大高径比配合上向流的运行方式, 使得各滤层的微生物与基质接触充分.第五, 本反应器接种的是亚硝化污泥和富集ANAMMOX的填料, 有利于菌群合理的空间分布, AOB生长在填料外层, 并为膜内的ANAMMOX创造良好的厌氧条件.同时, 接种富集ANAMMOX的填料能够实现ANAMMOX的快速生长富集.
2.1.2 阶段二(39~69 d):CANON工艺工况优化及稳定运行该阶段为实现较高的氮素去除负荷, 缩短HRT至6 h同时不断优化曝气量, 曝气时间和停曝时间之比.由于曝气量过大或曝气时间过长会抑制ANAMMOX生长速率和活性并使NOB增殖影响反应器内菌群平衡, 出水水质恶化, 而曝气量过小或曝气时间过短会导致较低的氨氧化率.曝气量的调节应该遵循2个原则:出水效果尽量达到最大氨氧化率;在满足反应器较好的出水效果的同时控制特征比值ΔTN/ΔNO3大于8, 防止NOB过度增殖影响亚硝化稳定性[24].通过对反应器曝气及曝停时间的优化, 确定在进水NH4+-N为300 mg·L-1, HRT为6 h时的最佳运行工况, 曝气量为0.4 L·min-1, 曝气时间与停曝时间分别调节为40、80 min运行达到最佳出水水质.此时平均氨氧化率与总氮去除率分别为89.9%、78.4%, 平均总氮去除负荷达到1.9 kg·(m3·d)-1.
2.1.3 阶段三(70~115 d):SNAD启动期第70 d开始, 向进水中加入碳源, 在70~85 d控制进水有机物浓度为30 mg·L-1, C/N为0.1, 其他工况保持不变.反应器出水硝氮开始下降, 从26.0 mg·L-1降至22.8 mg·L-1, 平均总氮去除率从81.6%升至86.1%, 同时平均总氮去除负荷从1.7 kg·(m3·d)-1升至2.2 kg·(m3·d)-1.在86~102 d控制进水有机物值为60 mg·L-1, C/N为0.2.反应器出水硝氮继续下降至19.9 mg·L-1, 最高总氮去除率达90.8%, 同时最高总氮去除负荷达2.3 kg·(m3·d)-1.有研究表明低浓度有机物下反硝化菌和ANAMMOX能同时进行并相互促进, 从而提高总氮去除率[25~27].赖杨岚等[28]发现, COD、C/N分别为113.9 mg·L-1、1.46时TN去除率达到最高.本试验在有机物浓度为60 mg·L-1的工况下总氮去除率达到最大90.8%, 超过了CANON工艺的理论最高总氮去除率(约为89%), 实现了自养脱氮和反硝化耦合.这是由于低浓度的有机物会促使反硝化菌生长并产生无机碳, 而适量的无机碳能促进厌氧氨氧化反应的进行[29].
从第102 d开始进水有机物浓度增加至90 mg·L-1时, 反应器出水氨氮浓度显著上升, 氨氮去除率均值降至86.7%, 总氮去除率平均值降至80.4%, 表明有机物浓度的增加促使好氧异养菌的生长速率加快并与AOB竞争溶解氧, 导致AOB可利用的溶解氧减少, 这与李冬等[30]的研究成果吻合.第108 d将曝气量由原来的0.4 L·min-1调节至0.5 L·min-1, 但不改变曝气时间和停曝时间之比.这是由于较长的停曝时间有利于抑制NOB的活性并能降低曝气时溶解氧对ANAMMOX的影响.在提高曝气量后, 总氮去除率和氨氮去除率均恢复至最佳水平, 分别为91.4%和100%.
不同C/N比下滤池沿程脱氮贡献率和总氮去除率变化如图 3所示, 在C/N为0.1时, 反硝化对脱氮的贡献大部分在滤池沿程高度10 cm, 并且此高度下总氮去除率达到68.1%, 说明该高度下CANON工艺能提供大量的硝氮给反硝化菌进行反应.随着沿程高度的增加, 总氮去除率和反硝化脱氮贡献率也迅速下降.随着C/N逐渐增大, 滤池沿程高度10 cm处的总氮去除率逐渐降低, 并且沿程高度30 cm处的总氮去除率和反硝化脱氮贡献率有所提高, 进一步证明了随着有机物浓度的增加, 反应器底部好氧异养菌增殖速率加快, 使得底部的总氮去除率降低.
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(a) C/N=0.1; (b) C/N=0.2; (c) C/N=0.3 图 3 不同C/N比下滤池沿程脱氮贡献率和总氮去除率变化 Fig. 3 Variations of the contribution rate of nitrogen removal and total nitrogen removal rate along the filtration layer for different C/N |
综上所述, 有机物浓度在60 mg·L-1以下时可以增强AOB和ANAMMOX的活性, 自养脱氮和反硝化实现较好的耦合.而有机物浓度在90 mg·L-1时却会使得倍增时间较短的好氧异养菌大量增殖, 并且与AOB竞争溶解氧, 使得反应器的氨氧化率下降.但是通过提高曝气量的策略可以使得AOB有充足的溶解氧可以利用, 在较短的时间内恢复到最佳处理效果, 同时结合间歇曝气的方式可以避免在此期间NOB的过量增殖.
2.1.4 阶段四(116~183 d):SNAD工艺稳定运行由阶段三可知反应器在60 mg·L-1的有机物浓度下达到较好的出水水质, 为进一步提高SNAD系统的稳定性和出水水质, 试验在阶段四采取减少曝气的策略以增强对NOB的抑制并降低曝气对反硝化菌生长速率的影响.故本阶段反应器在有机物浓度60 mg·L-1、曝气量0.4 L·min-1、曝停时间比为30:90、溶解氧在1.3~1.7 mg·L-1的工况下稳定运行67 d.研究表明, 相比于CANON工艺, SNAD工艺能提高总氮去除率从而提高出水水质.由表 3及图 2可知, SNAD工艺的最高总氮去除率达92.0%, 平均总氮去除率为91.0%, 平均出水硝氮为16.1 mg·L-1.与阶段二的CANON工艺相比, 平均总氮去除率提高了12.6%.
2.2 SNAD工艺运行过程中COD去除在CANON工艺中, 系统出水NO3--N浓度的控制极为重要.出水NO3--N浓度过高会影响出水的水质, 同时不利于总氮去除率的提高.根据CANON工艺的反应式, 在没有NOB的作用下, ΔTN/ΔNO3--N的理论值应为8.反应器运行期间ΔTN/ΔNO3--N的比值和COD变化如图 4和图 5所示.随着有机物浓度的提高, ΔTN/ΔNO3--N的比值从10逐渐上升到17, COD去除量逐渐增加, 最高COD去除率达80.4%, 这是由于反硝化菌生长速率和活性随着COD浓度的增加而逐渐增强.在SNAD稳定阶段, ΔTN/ΔNO3--N的比值上升到23, 出水COD值稳定在12.0~15.1 mg·L-1, 最高COD去除率达82.9%, 说明采取减少曝气的策略有利于反硝化菌的富集从而降低出水COD.
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图 4 FA和特征比ΔTN/ΔNO3--N变化 Fig. 4 Variations of the free ammonia concentration and ΔTN/ΔNO3--N |
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图 5 反应器内COD的去除效果 Fig. 5 COD removal efficiency in the reactor |
理论上反硝化过程去除1 g的NO3--N利用2.63 g有机物[24], 而该试验中COD的消耗量大于理论值, 说明反应器中存在好氧异养菌等其他菌种.如图 6所示, 分析了本试验滤池不同高度的碳素去除途径.以C/N为0.1为例, 进水COD为35.2 mg·L-1, 反应器沿程高度10 cm处COD剩余量为20.5 mg·L-1, 反硝化过程去除了4.5 mg·L-1的硝氮, 理论上需要11.8 mg·L-1 COD, 即其他异养菌去除了2.9 mg·L-1 COD.本试验中, 在C/N为0.1时有机物的引入使得滤池底部含有大量碳源, 有利于反硝化反应的进行, 此时COD的去除主要集中在沿程高度10 cm处的反硝化菌, 随着C/N比的增加, 此高度下其他异养菌脱碳贡献率从2.9%上升到15.9%, 同时沿程高度30 cm的COD去除率上升了20%, 说明该处反硝化菌在碳源充足的条件下其生长速率及数量都有所提高.
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(a) C/N=0.1; (b) C/N=0.2; (C) C/N=0.3 图 6 不同C/N比下滤池沿程脱碳贡献率和COD去除率变化 Fig. 6 Variations of the contribution rate of carbon removal and total carbon removal rate along the filtration layer for different C/N |
本试验通过定量PCR分析各阶段反应器中上部和底部的AOB、NOB、ANAMMOX和反硝化菌的丰度, 如图 7所示.结果表明, 本试验中阶段三反应器底部ANAMMOX和AOB拷贝数分别为1.33×108 copies·g-1和4.57×107 copies·g-1, 相比于阶段一ANAMMOX的丰度增长了1个数量级, AOB的丰度增长了1.5倍.Strous等[31]的研究发现, 在微观上ANAMMOX只有达到一定程度的细胞密度时(1010~1011 mL-1)才表现出活性.本试验反应器运行的各个阶段中, 无论是反应器中上部还是底部, ANAMMOX和AOB始终处于优势地位, 并且阶段三底部各功能菌丰度均大于中上部, 故系统在各个阶段皆能维持较好的脱氮能力.在SNAD系统中实现将硝化反应控制在亚硝酸盐氮阶段对于反应器稳定运行具有重要意义, NOB的过量增殖会使总氮去除能力下降, 故在反应器运行过程中应注意抑制NOB中的增殖.随着曝气量和曝停时间比值增大, 本反应器中不同阶段的中上部和底部NOB的丰度虽然有所增加, 但是其丰度(≤106 copies·g-1)比AOB低1个数量级, 这是由于反应器进水氨氮和pH较高, 即使在常温下也能保持较高的游离氨浓度, 从而能有效抑制NOB的增殖并维持短程硝化的稳定性[32].值得注意的是, 阶段二反硝化菌的数量比阶段一高3个数量级, 反而高于阶段三时加入有机物后反硝化菌的数量.这是由于进水负荷的提高使得部分微生物不适应环境而菌体自溶, 为反硝化菌提供了充足的碳源.研究表明, 微生物在营养物质匮乏时能够通过酶促反应将大分子形式的EPS代谢为小分子营养物质, 促使微生物产生更多的溶解性胞外聚合物(SEPS)和松散型胞外聚合物(LB-EPS), 从而被细菌作为碳源和能源利用[33].从图 4可知, 阶段二时特征值ΔTN/ΔNO3--N为10, 大于CANON工艺理论值8, 这是由于该阶段反应器内存在一定的内源反硝化和自养反硝化.阶段三反硝化菌的丰度有所下降并且比ANAMMOX丰度低了2个数量级, 进一步说明反应器内反硝化脱氮占比较低, 绝大部分的总氮去除是依靠厌氧氨氧化.
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图 7 试验各阶段反应器内菌群丰度 Fig. 7 Abundance of microbial communities in each phase |
(1) 在浸没式曝气生物滤池中, 接种亚硝化污泥和厌氧氨氧化填料, 实现了亚硝化、厌氧氨氧化的协同脱氮, 在常温下反应器仅运行38 d总氮去除率可达86.0%, 总氮去除负荷达到1.1 kg·(m3·d)-1.
(2) 有机物浓度在30 mg·L-1和60 mg·L-1时可以增强AOB和ANAMMOX的活性, 自养脱氮和反硝化实现较好的耦合.当有机物浓度增加到90 mg·L-1时好氧异养菌大量增殖导致氨氧化率下降, 此时通过提高曝气量的策略可以使脱氮效果快速恢复到最佳水平.
(3) SNAD工艺稳定运行67 d, 最高总氮去除率达92.0%, 平均出水硝氮在16.1 mg·L-1.与阶段二的CANON工艺相比, 平均总氮去除率提高了12.6%.
(4) 通过定量PCR技术分析得出以火山岩为填料的浸没式生物滤池反应器有利于ANAMMOX和AOB的富集生长.启动前后ANAMMOX的丰度增加了1个数量级, 并且在高游离氨浓度和间歇曝气的条件下能有效抑制NOB的增殖.
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