环境科学  2020, Vol. 41 Issue (2): 952-961   PDF    
引用本文
陈乾, 刘洋, 肖丽君, 邹德玉, 刘海学, 吴惠惠. 超高效液相色谱串联质谱法同时测定叶菜中13种抗生素[J]. 环境科学, 2020, 41(2): 952-961.
CHEN Qian, LIU Yang, XIAO Li-jun, ZOU De-yu, LIU Hai-xue, WU Hui-hui. Simultaneous Quantitative Detection of Thirteen Common Antibiotics in Leafy Vegetables by Ultra-High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry[J]. Environmental Science, 2020, 41(2): 952-961.
超高效液相色谱串联质谱法同时测定叶菜中13种抗生素
陈乾1, 刘洋1, 肖丽君2, 邹德玉3, 刘海学2, 吴惠惠1     
1. 天津农学院园艺园林学院, 天津 300384;
2. 天津农学院农学与资源环境学院, 天津 300384;
3. 天津市植物保护研究所, 天津 300384
收稿日期: 2019-07-11; 修订日期: 2019-09-02
基金项目: 国家重点研发计划项目(2017YFD0201000);天津市自然科学基金项目(16JCZDJC33600)
作者简介: 陈乾(1994~), 男, 硕士, 主要研究方向为抗生素逆境胁迫对植物生理活动的影响, E-mail:chenqian916@126.com
通信作者: 刘海学, E-mail:hxliu1965@sina.com; 吴惠惠, E-mail:wuhuihui@tjau.edu.cn
摘要: 建立了超高效液相色谱串联三重四极杆质谱（UPLC-MS/MS）同时检测叶菜类蔬菜中磺胺类、喹诺酮类、大环内酯类13种抗生素的分析方法.优化蔬菜基质中抗生素的提取液种类、净化方式、洗脱液种类，以及探讨环境变化和实验条件对实验结果的影响后，确定最优方案为称取500 mg的蔬菜样品，加入20 mL甲醇-Mcllvaine-Na2EDTA溶液，超声和离心提取3次后，旋转蒸发至20 mL过HLB固相萃取柱.以6 mL甲醇洗脱，收集洗脱液，氮吹近干，用乙腈：水（体积比2：8）混合溶液复溶，离心、过滤后采用UPLC-MS/MS进行检测.流动相A相为1‰的甲酸水溶液，B相为乙腈，梯度洗脱.结果显示，小白菜在300 ng·g-1加标时，13种抗生素的加标回收率为38.05%~96.97%，150 ng·g-1时，加标回收率为34.52%~111.10%，50 ng·g-1时，加标回收率为41.75%~107.13%，相对偏差RSD值均小于8.68%.检出限为0.4~1 ng·g-1、定量限为1.5~3 ng·g-1，在不同种类的叶菜上也表现出较好的提取和回收效率，具有较好的分析应用效果.实际的样品检测发现，4种叶菜不同程度地检测出了抗生素的残留.总的含量范围（以干重计）为1.59~32.01ng·g-1.小白菜所含抗生素含量最高，其次为白菜、生菜和芫荽.磺胺二甲基嘧啶为叶菜中含量最高的抗生素种类.各抗生素检测出的含量虽很低，但仍不能忽略长期食用带来的潜在健康风险.
关键词: 超高效液相色谱      质谱      叶菜      抗生素      联合检测方法     
Simultaneous Quantitative Detection of Thirteen Common Antibiotics in Leafy Vegetables by Ultra-High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry
CHEN Qian1 , LIU Yang1 , XIAO Li-jun2 , ZOU De-yu3 , LIU Hai-xue2 , WU Hui-hui1     
1. College of Horticulture and Landscape, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China;
2. College of Agronomy&Resources and Environment, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China;
3. Tianjin Institute of Plant Protection, Tianjin 300384, China
Abstract: An analytical approach was developed to simultaneously determine 13 antibiotics in sulfonamides, quinolones, and macrolides in leafy vegetables by ultra-performance liquid chromatography coupled with triple quadrupole mass spectrometry (UPLC-MS/MS). After optimizing extracted solutions, purification methods, and eluents of antibiotics in vegetable substrates, and taking into account the influence of environmental changes and experimental conditions on the results, the optimal experimental scheme was determined. This involved ①weighing 500 mg of vegetable samples and adding 20 mL of methanol-Mcllvaine-Na2 EDTA solution; ② conducting ultrasonic and centrifugal extraction three times; ③ Allowing rotary evaporation to 20 mL to pass a HLB solid phase extraction column; ④ Eluting the extraction column using 6 mL of methanol, upon which the eluent was dried almost completely; ⑤ Re-dissolving the eluent with a mixed solution of acetonitrile:water (volume ratio of 2:8); ⑥ Detecting by UPLC-MS/MS after centrifugation and filtering. Phase A and B of UPLC-MS/MS used an aqueous solution of 1‰ formic acid and acetonitrile, respectively to conduct gradient elution. Results showed that when the pakchoi spiked at 300 ng·g-1, the spiked recoveries of 13 antibiotics were 38.05%-96.97%. At 150 ng·g-1, the spiked recoveries were 34.52%-111.10%. At 50 ng·g-1, the recoveries of standard addition were 41.75%-107.13%, and the relative deviation (RSD) values were all below 8.68%. The detection limit was 0.4-1 ng·g-1, and the limit of quantification was 1.5-3 ng·g-1. This demonstrated good extraction and recovery efficiency on different types of leafy vegetables, and presented a good analytical application effect. The antibiotic residues were detected in four kinds of leafy vegetables in found in markets. The total content ranged from 1.59 ng·g-1 to 32.01 ng·g-1, and the antibiotic content in samples was calculated by dry weight. The content of antibiotics in pakchoi was the highest, followed by Chinese cabbage, lettuce, and coriander. Among the antibiotics detected, sulfadimidine was the most abundant from the selected leafy vegetables. The content of antibiotics was very low, however the potential health risks caused by long-term consumption could not be ignored.
Key words: ultra-high performance liquid chromatography      mass spectrometry      leafy vegetables      antibiotics      detection methods     

抗生素是一类能够治疗人和动物多种疾病, 具有抗菌活性的物质, 多为微生物的次生代谢产物或人工合成的类似物.然而抗生素进入人或动物体内, 仅有10%~40%被直接利用, 其余部分以原药或代谢体的形式排泄到体外[1], 进入周边环境.一定浓度的抗生素不仅能够毒害水中生物[2]、破坏土壤微环境、降低土壤肥力[3]、催生耐药菌株, 造成抗性基因污染[4]、也能够通过食物链威胁到人体健康, 甚至致畸、致癌[5].前人已在河流[6~8]、湖泊[9]、土壤[10]及动植物体内[11, 12]检测到不同浓度的抗生素残留, 由此引发的抗生素污染问题日益引起人们的关注.

叶菜类蔬菜是人们常食用的一种蔬菜, 其能够从周围环境中富集抗生素, 对此, 前人已有一定的研究.金彩霞等[13]在养殖场周围的菜地蔬菜中检测出不同程度的磺胺类抗生素, 迟荪琳等[14]对比两种叶菜对四环素类抗生素的吸收效果后发现, 不同种类的蔬菜对抗生素的富集存在着明显的差异.尹倩等[15]的研究指出, 不同基因型的同种蔬菜对抗生素富集效果也不同.鉴于当前蔬菜抗生素的污染现状, 众多适用于蔬菜的抗生素联合检测方法已被开发.Boxall等[16]建立了适用于胡萝卜和生菜基质的一种可同时检测10种抗生素的液相色谱质谱联用的检测方法.Azanu等[17]建立了一种能同时检测阿莫西林和四环素的液相色谱方法.吴小莲等[18]利用固相萃取-高效液相色谱-串联质谱建立了蔬菜中8种磺胺类抗生素的联合检测方法, 吴淑秀[19]等建立了4种喹诺酮类抗生素在芽苗类蔬菜中的检测方法.刘畅[20]建立了适用于蔬菜基质的14种喹诺酮类抗生素的联合检测方法.当前, 检测方法多集中在一种或同类的几种抗生素上, 对于多种不同类的抗生素建立的方法较少.然而在实际生产中, 植物遇到的抗生素胁迫环境往往比较复杂, 多含有多种不同类型的抗生素.因此建立一种能够同时检测多类抗生素的联合检测方法尤为重要.

本文研究并建立了一种能够检测叶菜类蔬菜中3类13种抗生素的联合检测方法, 以期为叶菜类蔬菜中抗生素的检测及评估其带来的风险提供一个切实可行的方法, 并为未来研究多类抗生素的联合检测方法提供一定的借鉴.

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 药品与试剂

13种抗生素标准品购于摩贝(上海)生物科技有限公司, 品牌为坛墨质检.其中, 磺胺类抗生素5种, 纯度为磺胺嘧啶(sulfadiazine, SDZ)99.0%、磺胺甲基嘧啶(sulfamerazine, SMR)94.0%、磺胺二甲基嘧啶(sulfadimidine, SDMD)99.8%、磺胺二甲氧嘧啶(sulfadimethoxine, SDM)99.9%、磺胺噻唑(sulfathiazloe, STZ)99.9%.喹诺酮类抗生素7种, 纯度为西诺沙星(cinixacin, CIN)99.0%、氟甲喹(flumequine, FLU)99.0%、氧氟沙星(ofloxacin, OFL)98.3%、喹酸(Oxolinic, OXO)99.0%、司帕沙星(sparfloxacin, SPA)99.2%、恩诺沙星(enrofloxacin, ENR)99.0%、环丙沙星(ciprofloxacin, CIP)99.0%.大环内酯类抗生素1种, 纯度为替米考星(tilmicosin, TIL)99.0%.

乙腈(色谱纯, MERCK, 德国)、甲醇(色谱纯, MERCK, 德国)、甲酸(质谱纯, Thermo, 美国)、EDTA(分析纯)、磷酸氢二钠(分析纯)、磷酸(分析纯)、氢氧化钠(分析纯)、柠檬酸(分析纯)、乙酸(分析纯)、丙酮(分析纯)和超纯水(Milli-Q超纯水系统, Waters, 美国).

1.1.2 仪器设备

Waters TQD超高效液相色谱-串联三重四极杆质谱仪(美国).睿科Fotector-02HT高通量全自动固相萃取仪(中国).新芝SB-5200DTDN超声波清洗机(中国).Eppendorf Centrifuge 5920 R高速冷冻离心机(德国).睿科Reeko-Auto EVA全自动氮吹浓缩仪(中国).METTLER TOLEDO AL204电子天平(梅特勒, 瑞士).Waters Oasis HLB 200mg 6mL固相萃取柱(美国).Cleanert PEP固相萃取柱(艾杰尔, 美国).Cleanert C18固相萃取柱(艾杰尔, 美国).Cleanert PSA填料(艾杰尔, 美国).Millipore ZRQSVR 800超纯水机(Waters, 美国).FIVEEASY FE28 pH计(梅特勒, 瑞士).Lab Tech EV311旋转蒸发仪(莱伯泰科, 中国).VXMNAL涡旋振荡器(奥豪斯, 美国)

1.1.3 标准溶液与提取液的配制

标准溶液的配制：分别准确称取磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺噻唑、西诺沙星、氧氟沙星、氟甲喹、司帕沙星、喹酸、恩诺沙星、环丙沙星和替米考星的标准物质0.01 g, 各加入0.05 mol·L-1的NaOH 1 mL, 溶解后用体积比为1:4的乙腈超纯水溶液稀释制备200 μg·mL-1的标准储备液.从上述13种标准储备液中, 各吸取50 μL, 用体积比为1:4的乙腈:水溶液稀释, 定容至10 mL, 配置1 μg·mL-1的混合标准液, 放于4℃避光保存.

Mcllvaine缓冲盐溶液：称取5.25 g柠檬酸、17.90 g磷酸氢二钠定容至250 mL.

提取液的配制：提取液A：甲醇-Mcllvaine-Na2EDTA(0.01 mol·L-1)溶液(1:1:1, 体积比, 磷酸调pH为3)；提取液B由B1、B2两部分组成, B1：甲醇-盐酸(pH=1)溶液(1:1, 体积比).提取液B2为丙酮; 提取液C：含1%乙酸的酸化乙腈溶液; 提取液D：甲醇-乙腈-Mcllvaine-Na2EDTA(0.01 mol·L-1)(6:4:5:5, 体积比).

1.2 样品预处理

样品为市售有机小白菜, 使用蒸馏水冲洗, 除去表面杂质, 切碎后放入冷冻干燥机中冷冻干燥, 加入液氮研磨至粉末后装入自封袋中, 超低温冰箱(-80℃)保存备用.

称取500 mg的蔬菜样品(空白对照为超纯水), 加入300 ng·mL-1混合标准液0.5 mL, 放入50 mL离心管中, 加入20 mL提取液.超声30 min, 4 000 r·min-1离心20 min, 提取上清液, 残渣重复提取两次, 合并上清液(注：使用提取液A和提取液D提取, 3次均为该提取液；使用提取液B提取, 前两次提取使用B1, 第3次提取液为20 mL的B2；使用提取液C提取, 需在样品中预先加入100 mg的Na2EDTA和1 g无水硫酸钠), 旋转蒸发至20 mL待过柱.

依次使用6 mL甲醇、6 mL超纯水对HLB固相萃取柱进行活化, 并将样品进行过柱富集, 流速为1 mL·min-1.过柱完成后, 以6 mL超纯水润洗, 氮气保护下吹至近干.以6 mL洗脱液洗脱, 收集洗脱液, 氮吹至近干.用乙腈:水(体积比2:8)的混合溶液1 mL复溶, 涡旋振荡5 min后, 4 000 r·min-1离心20 min, 取上清液过0.22 μm有机针孔滤膜后装入棕色进样小瓶, 使用UPLC-MS/MS进行定量分析.结果使用SPSS 17.0进行统计分析.

1.3 液相色谱-质谱条件

基本质谱条件：ESI(+)源, 脱溶剂气温度500℃, 气体流速500 L·h-1, 毛细管电压(capillary voltage)3.5 kV, 锥孔电压25 V, 锥孔气体流速150 L·h-1.优化的色谱和质谱参数见表 1和表 2.优化后的离子流如图 1所示.

表 1 13种典型抗生素液相色谱参数 Table 1 LC parameters of the thirteen selected antibiotics

表 2 13种抗生素MRM监测质谱参数 Table 2 Parameters for mass spectrometry MRM analysis of the thirteen selected antibiotics

抗生素混标的浓度为300 ng·mL-1 图 1 13种抗生素标准品的离子流 Fig. 1 Ion flow curves of the thirteen antibiotic standards

2 结果与讨论 2.1 提取液的选择

取冷冻干燥后研磨样品500 mg, 分别加入4种提取液20 mL, 超声提取30 min, 取上清液, 残渣重复提取2次合并上清液, 旋转蒸发至20 mL后过HLB固相萃取柱, 检测结果如图 2所示.

图 2 4种提取液对目标抗生素提取效率 Fig. 2 Extraction efficacy of four solutions of certain antibiotics

提取液A效果最好, 对于13种抗生素的提取效率在38.05%~96.97%之间(其空白水样回收效率为40.17%~98.25%), 略优于提取液D的32.72%~80.45%(其空白水样的回收率为33.83%~82.97%)的提取效率, 也优于提取液B和提取液C.磺胺类抗生素虽不易溶于水, 但形成钠盐后则易溶于水及部分极性溶剂.提取液A和提取液D含有的高比例的水以及缓冲盐成分, 可能是磺胺类抗生素提取率高的原因.有研究表明, 酸化乙腈提取喹诺酮类抗生素的效率较高[19], 但与本实验研究结果不符, 原因可能是本实验样品为小白菜, 含有的成分较为复杂, 基质效应显著, 降低了其提取的效果.

2.2 样品净化方式的选择 2.2.1 固相萃取柱(方式)的选择

选择合适的净化方式, 能够降低杂质对最终检测结果的影响.当前, 主要使用的蔬菜样品净化方式有HLB固相萃取柱净化、PEP固相萃取柱净化、C18固相萃取柱及Cleanert PSA填料净化.使用HLB固相萃取柱、PEP固相萃取柱以及C18固相萃取柱进行净化, 需提前用6 mL甲醇活化, 6 mL水平衡, 再将样品进行过柱.使用Cleanert PSA填料净化, 需将提取液浓缩至1 mL, 加入30 mg填料, 充分振荡后, 4 000 r·min-1离心10 min后取上清液.

结果如图 3所示, HLB对13种目标抗生素的提取效果为38.95%~96.97%, RSD均小于8.64%, PEP固相萃取柱净化方式回收率为9.51%~290.91%, 使用Cleanert PSA填料净化, 回收率为77.34%~379.21%, 除STZ和SDZ外, 其余11种抗生素的回收率均超过100%, CIP、CIN、TIL、OXO这4种回收率超过200%, 表明填料净化的方式, 并不适合基质成分更为复杂的蔬菜基质的净化.而C18固相萃取柱净化, 则表现出回收效果的偏低, 仅为19.01%~69.05%.所以, 本实验采用HLB固相萃取柱作为样品的净化方式.

图 3 净化方式对目标抗生素回收率的影响 Fig. 3 Effect of purification on recovery rate of target antibiotics

2.2.2 固相萃取方式的选择

负压型手动固相萃取装置和自动固相萃取仪是当前实验室主要采用的固相萃取装置.固相萃取的整个过程中, 样品过柱的速度与洗脱的速度对目标抗生素的富集与洗脱效率有着很大的影响.负压型手动固相萃取装置在整个过程中流速主要靠重力和内外压强差控制, 流速不易稳定, 各平行处理上, 回收率易出现较大的差异.自动固相萃取仪能够实现流速的精确控制, 保证富集与洗脱的效率.两者回收率对比如图 4所示, 使用自动固相萃取仪, 各抗生素的回收率为38.05%~96.97%, 远高于负压型手动固相萃取装置7.30%~38.05%的效率.因此, 本实验采用自动固相萃取仪作为固相萃取的方式.

图 4 2种固相萃取方式对回收率的影响 Fig. 4 Effect of two solid phase extraction methods on recovery rate

2.2.3 洗脱液的选择

洗脱液的性质和抗生素的性质均对洗脱的效果有影响, 两者相互作用, 决定了最后的洗脱效果.一般来说, 对于HLB固相萃取柱, 极性越强越有利于抗生素的洗脱, 但同时也会将杂质淋洗出, 影响最终的回收率测定.本实验比较了甲醇和乙腈的洗脱效果, 结果如图 5所示, 除CIN外, 甲醇的洗脱效果均优于乙腈.因此, 本实验采用甲醇作为洗脱液.

图 5 2种洗脱液对于回收率的影响 Fig. 5 Effect of two eluents on recovery rate

2.3 实验外部环境及实验条件的影响

有研究表明, 抗生素受外界环境影响较大, Volmer[22]的研究指出, 喹诺酮类抗生素易在水中发生水解和光解, 且抗生素容易吸附于固体颗粒上[23], 因此在实验过程中, 控制外界环境及实验条件至关重要.梳理整个实验环节, 影响较大的因素为整个过程中样品是否受到强光源, 以及在氮吹时, 若完全吹干, 样品挂壁严重, 加入复溶液后, 振荡、涡旋均无法完全复溶, 采用超声能够迅速复溶, 但亦会将杂质溶解入复溶体系.分析两者对于回收率的影响, 具有一定的实际意义.

2.3.1 强光照对回收率的影响

部分抗生素对光照有着一定的敏感性, 因此, 对比全程光环境对实验结果的影响, 对研究非实验条件的控制有着一定的指导意义.

本实验结果如图 6所示, 强光条件下(光照度为3 100 lx), 磺胺类抗生素的回收率得到了一定的提高, 对于喹诺酮类抗生素的影响并不一致.其中CIN的回收率达到了145.78%, OXO和FLU的回收率均超过了110%.TIL回收率则下降明显, 仅为16.73%, 已经不符合实验要求.因此, 在实验中, 外界的光照环境, 对实验的结果有着较为明显的影响, 因此, 本实验在全部操作过程中, 避免样品接触强光源, 在旋转蒸发和固相萃取等环节, 采用遮光处理.

图 6 2种光环境下回收率的差异 Fig. 6 Difference of recovery in two levels of light intensity

2.3.2 超声助溶对于回收率的影响

涡旋振荡的处理方式为氮吹至近干, 加入1 mL复溶液, 涡旋振荡至混匀, 超声处理组为吹至完全干燥, 加入1 mL复溶液, 超声振荡2 min.实验结果如图 7所示, 超声助溶后, 磺胺类抗生素回收率为51.60%~85.76%, 回收率在正常范围内, 但是CIP、CIN和OXO这3种抗生素的回收率得到了显著地放大, 均超过了140%.TIL的回收率显著下降, 仅为3.50%, 不符合实验的要求.TIL检测如此低的原因可能是在复溶环境中, 超声破坏了TIL的结构, 或生成某种中间产物, 故检测率低下, 具体原因需要做进一步地探究.因此, 本实验氮吹时, 吹至近干, 加入复溶剂后, 采用涡旋振荡的方式复溶, 管壁虽有少量的残留, 不影响其回收率.

图 7 2种复溶方式对于回收率的影响 Fig. 7 Effect of two re-dissolution methods on recovery

2.4 方法学质量控制 2.4.1 标准曲线

绘制基质标准曲线, 能够降低基质背景对于抗生素检测的干扰.对空白执行与前处理相同的操作, 得到基质溶液, 使用基质标准溶液将标准溶液稀释至0.4、0.5、1、1.5、2、3、5、10、20、50、100和300 ng·mL-1的标准溶液, 并绘制标准曲线.

2.4.2 方法的检出限与定量限

在实验的浓度范围内, 方法表现出了较好的线性关系, 相关系数均大于0.99.以最低的出峰浓度取信噪比S:N=3为对应浓度的方法检出限(LOD), 以S:N=10为对应浓度的方法定量限(LOQ).具体数值如表 3所示.定量限均小于3 ng·g-1, 方法检出限均小于1 ng·g-1, 能够很好地满足实验分析需要.

表 3 13种抗生素的检出限和定量限 Table 3 Limit of detection and limit of quantitation of the thirteen antibiotics

2.5 方法的回收率及精密度

选用小白菜的空白基质, 添加300、150和50 ng·mL-1这3个浓度的混合标准液0.5 mL, 按照前处理的方式进行处理.获得3个浓度下的加标回收率(表 4).磺胺类抗生素的回收率略低于喹诺酮类抗生素的回收率, 50 ng·g-1和150 ng·g-1添加的回收率优于300 ng·g-1.各回收率的范围均在正常的回收范围内, RSD值均小于8.68%, 满足分析要求.

表 4 13种抗生素的加标回收率及相对标准差(n=3) Table 4 Recovery and relative standard deviation(RSD) of 13 antibiotics

2.6 不同类型叶菜的回收率

采用本方法对4种常见的叶菜进行加标回收检测, 加标为添加300 ng·mL-1的混合标准液0.5 mL, 结果如表 5所示, 其对于叶菜类蔬菜具有很好检测效果.对小白菜的回收率为38.05%~96.97%, 生菜、芫荽和白菜的回收率分别为46.27%~101.87%、52.61%~107.30%和65.82%~115.65%, 相对偏差RSD值均小于10%, 能够满足叶菜类蔬菜的抗生素检测要求.

表 5 不同蔬菜的加标回收率1)/% Table 5 Recovery rate of different vegetables/%

2.7 实际样品的检测

利用本方法分析市售叶菜的抗生素残留现状, 结果如表 6所示.所购4种蔬菜中均有抗生素被检测出. 4种蔬菜中抗生素的含量及种类均有较大的差异, 其中小白菜中检测的抗生素种类及含量均最高, 检测出7种抗生素, 总含量为32.01ng·g-1.白菜、芫荽和生菜检测出的抗生素含量均低于小白菜.SDMD为4种蔬菜中检测的水平最高的抗生素种类, 但所测数值均低于金彩霞在河南做的同类研究[13].

表 6 蔬菜中13种抗生素的含量(以干重计)/ng·g-1 Table 6 Content of the thirteen antibiotics in vegetables(dry weight)/ng·g-1

不同蔬菜中抗生素检测量的不同, 可能与蔬菜栽培的方式、植物自身的吸附抗生素的特性、病虫害防治的方式, 以及土壤环境[24]等有关.小白菜多为露地或温室栽培, 较少有水培的栽培形式, 大量含有抗生素的有机肥拌入土壤可能是其抗生素检测量高的一个主要原因[25, 26].保护地中大量的病原菌造成的病害防治压力, 可能是其抗生素检测水平高的另一个主要原因.而以鲜食为主的生菜主要以有机栽培和水培为主, 其生长环境中抗生素的含量较少, 其生长环境相对可控, 病原菌防治压力较小, 喷药较少, 可能是其抗生素含量偏低的两个主要原因, 也有研究表明小白菜对抗生素的富集效应强于生菜[14], 这可能是小白菜抗生素检出水平远高于生菜的另一个原因.蔬菜中检测出的一定的抗生素残留, 并由此给人体带来的潜在风险, 需引起人们的重视.

3 结论

(1) 建立了能够同时检测3类13种抗生素的超高效液相色谱串联质谱(UPL C-MS/MS)的联合检测方法.方法以pH=3的甲醇-Mcllvaine-Na2EDTA溶液为提取溶液, HLB固相萃取柱为净化方式, 超高效液相色谱串联质谱作为检测方式, 可同时对叶菜中磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺噻唑、西诺沙星、氟甲喹、氧氟沙星、喹酸、司帕沙星、恩诺沙星、环丙沙星和替米考星等13种抗生素进行快速测定, 相对偏差RSD值均小于8.68%.检测限为0.4~1 ng·g-1, 定量限为1.5~3 ng·g-1, 除少数几种抗生素外, 其加标回收率均超过50%, 方法操作简单, 且具有很强的适用性.能够较好地满足当前对叶菜类蔬菜抗生素的检测需求.

(2) 外部条件对于实验的最终结果有着较大的影响, 超声助溶和接触强光源能够显著降低TIL的检出浓度, 造成检出的浓度显著低于实际浓度.因此, 在实验中控制外部的环境对确保实验结果的准确性有着重要的意义.

(3) 对实际的样品检测发现, 4种叶菜不同程度地检测出了抗生素的残留.总的含量范围(以干重计)为1.59~32.01ng·g-1.小白菜所含抗生素含量最高, 其次为白菜、生菜和芫荽.SDMD为叶菜中含量最高的抗生素种类.所测样品的抗生素含量虽很低, 但仍不能忽略长期食用带来的潜在健康风险.

参考文献
[1] Halling-Sørensen B, Nielsen S N, Lanzky P F, et al. Occurrence, fate and effects of pharmaceutical substances in the environment-a review[J]. Chemosphere, 1998, 36(2): 357-393. DOI:10.1016/S0045-6535(97)00354-8
[2] 赵业, 唐永政, 李秉钧, 等. 四种典型抗生素对刺参幼参的急性毒性研究[J]. 海洋湖沼通报, 2019(2): 132-138.
Zhao Y, Tang Y Z, Li B J, et al. Acute toxic effects of four typical antibiotics on juvenile of sea cucumber[J]. Transactions of Oceanology and Limnology, 2019(2): 132-138.
[3] Richardson B J, Lam P K S, Martin M. Emerging chemicals of concern: Pharmaceuticals and personal care products (PPCPs) in Asia, with particular reference to Southern China[J]. Marine Pollution Bulletin, 2005, 50(9): 913-920. DOI:10.1016/j.marpolbul.2005.06.034
[4] Wu N, Qiao M, Zhan B, et al. Abundance and diversity of tetracycline resistance genes in soils adjacent to representative swine feedlots in China[J]. Environmental Science & Technology, 2010, 44(18): 6933-6939.
[5] 关晶, 高立. 3种抗肿瘤抗生素对体外培养淋巴细胞染色体的致畸研究[J]. 现代预防医学, 2011, 38(6): 1093-1095.
Guan J, Gao L. Study on the chromosome damage of ex vivo cultured lymphocytes by three anticancerbioties[J]. Modern Preventive Medicine, 2011, 38(6): 1093-1095.
[6] 刘晓晖, 卢少勇. 大通湖表层水体中抗生素赋存特征与风险[J]. 中国环境科学, 2018, 38(1): 320-329.
Liu X H, Lu S Y. Occurrence and ecological risk of typical antibiotics in surface water of the Datong Lake, China[J]. China Environmental Science, 2018, 38(1): 320-329. DOI:10.3969/j.issn.1000-6923.2018.01.036
[7] 张晓娇, 柏杨巍, 张远, 等. 辽河流域地表水中典型抗生素污染特征及生态风险评估[J]. 环境科学, 2017, 38(11): 4553-4561.
Zhang X J, Bo Y W, Zhang Y, et al. Occurrence, distribution, and ecological risk of antibiotics in surface water in the Liaohe River basin, China[J]. Environmental Science, 2017, 38(11): 4553-4561.
[8] 周志洪, 赵建亮, 魏晓东, 等. 珠江广州段水体抗生素的复合污染特征及其生态风险[J]. 生态环境学报, 2017, 26(6): 1034-1041.
Zhou Z H, Zhao J L, Wei X D, et al. Co-occurrence and ecological risk of antibiotics in surface water of Guangzhou section of Pearl River[J]. Ecology and Environmental Sciences, 2017, 26(6): 1034-1041.
[9] 武旭跃, 邹华, 朱荣, 等. 太湖贡湖湾水域抗生素污染特征分析与生态风险评价[J]. 环境科学, 2016, 37(12): 4596-4604.
Wu X Y, Zou H, Zhu R, et al. Occurrence, distribution and ecological risk of aantibiotics in surface water of the Gonghu Bay, Taihu Lake[J]. Environmental Science, 2016, 37(12): 4596-4604.
[10] 赵方凯, 陈利顶, 杨磊, 等. 长三角典型城郊不同土地利用土壤抗生素组成及分布特征[J]. 环境科学, 2017, 38(12): 5237-5246.
Zhao F K, Chen L D, Yang L, et al. Composition and distribution of antibiotics in soils with different land use types in a typical peri-urban area of the Yangtze River delta[J]. Environmental Science, 2017, 38(12): 5237-5246.
[11] 成玉婷, 吴小莲, 向垒, 等. 广州市典型有机蔬菜基地土壤中磺胺类抗生素污染特征及风险评价[J]. 中国环境科学, 2017, 37(3): 1154-1161.
Cheng Y T, Wu X L, Xiang L, et al. Distribution and risk assessment of sulfonamide antibiotics in soil from organic vegetable farms in Guangzhou[J]. China Environmental Science, 2017, 37(3): 1154-1161.
[12] 郝勤伟, 徐向荣, 陈辉, 等. 广州市南沙水产养殖区抗生素的残留特性[J]. 热带海洋学报, 2017, 36(1): 106-113.
Hao Q W, Xu X R, Chen H, et al. Residual antibiotics in the Nansha aquaculture area of Guangzhou[J]. Journal of Tropical Oceanography, 2017, 36(1): 106-113.
[13] 金彩霞, 司晓薇, 王子英, 等. 养殖场周边土壤-蔬菜系统磺胺类药物残留及风险评价[J]. 环境科学, 2016, 37(4): 1562-1567.
Jin C X, Si X W, Wang Z Y, et al. Distribution and risk assessment of sulfonamides antibiotics in soil and vegetables from Feedlot livestock[J]. Environmental Science, 2016, 37(4): 1562-1567.
[14] 迟荪琳, 王卫中, 徐卫红, 等. 四环素类抗生素对不同蔬菜生长的影响及其富集转运特征[J]. 环境科学, 2018, 39(2): 935-943.
Chi S L, Wang W Z, Xu W H, et al. Effects of tetracycline antibiotics on growth and characteristics of enrichment and transformation in two vegetables[J]. Environmental Science, 2018, 39(2): 935-943.
[15] 尹倩, 黄献培, 李彦文, 等. 不同基因型空心菜对环丙沙星及恩诺沙星的吸收累积特征[J]. 农业环境科学学报, 2013, 32(2): 407-408.
Yin Q, Huang X P, Li Y W, et al. Accumulation features of ciprofloxacin and enrofloxacin by different genotypes of water spinach[J]. Journal of Agro-Environment Science, 2013, 32(2): 407-408.
[16] Boxall A B A, Johnson P, Smith E J, et al. Uptake of veterinary medicines from soils into plants[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2006, 54(6): 2288-2297. DOI:10.1021/jf053041t
[17] Azanu D, Mortey C, Darko G, et al. Uptake of antibiotics from irrigation water by plants[J]. Chemosphere, 2016, 157: 107-114. DOI:10.1016/j.chemosphere.2016.05.035
[18] 吴小莲, 包艳萍, 向垒, 等. 固相萃取-高效液相色谱-串联质谱法同时测定蔬菜中8种磺胺类抗生素[J]. 环境化学, 2013, 32(6): 1038-1044.
Wu X L, Bao Y P, Xiang L, et al. Simultaneous determination of eight sulfonamide antibiotics in vegetables using solid phase extraction and high performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry[J]. Environmental Chemistry, 2013, 32(6): 1038-1044.
[19] 吴淑秀, 公茂金, 刘玉芳, 等. 芽苗类蔬菜中喹诺酮类药物的高效液相色谱-质谱测定法[J]. 环境与健康杂志, 2012, 29(5): 457-459.
Wu S X, Gong M J, Liu Y F, et al. Determination of quinolones residues in shoots by high performance liquid chromatography-tandem Mass spectrometry[J]. Journal of Environment and Health, 2012, 29(5): 457-459.
[20] 刘畅. 改良QuEChERS/超高效液相色谱-串联质谱法同时检测蔬菜中14种喹诺酮类抗生素残留[J]. 分析科学学报, 2019, 35(1): 124-128.
Liu C. Determination of quinolones in vegetables by improved QuEChERS/ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Journal of Analytical Science, 2019, 35(1): 124-128.
[21] 吴小莲, 向垒, 莫测辉, 等. 超高效液相色谱-电喷雾串联质谱测定蔬菜中喹诺酮类抗生素[J]. 分析化学, 2013, 41(6): 876-881.
Wu X L, Xiang L, Mo C H, et al. Determination of quinolones in vegetables using ultra performance liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry[J]. Chinese Journal of Analytical Chemistry, 2013, 41(6): 876-881.
[22] Volmer D A, Hui J P. Study of erythromycin A decomposition products in aqueous solution by solid-phase microextraction/liquid chromatography/tandem mass spectrometry[J]. Rapid Communications in Mass Spectrometry, 2015, 12(3): 123-129.
[23] 张哲, 朱齐齐, 赵鹏, 等. 饮用水源中不同粒径颗粒物吸附抗生素特征研究[J]. 环境科学学报, 2015, 35(7): 2090-2098.
Zhang Z, Zhu Q Q, Zhao P, et al. Characteristics of antibiotics adsorption on particles with different diameters in natural waters[J]. Acta Scientiae Circumstantiae, 2015, 35(7): 2090-2098.
[24] 朱秀辉, 曾巧云, 解启来, 等. 广州市北郊蔬菜基地土壤四环素类抗生素的残留及风险评估[J]. 农业环境科学学报, 2017, 36(11): 2257-2266.
Zhu X H, Zeng Q Y, Xie Q L, et al. Residues and risk assessment of tetracycline antibiotics in vegetable-growing soils from suburban areas of northern Guangzhou[J]. Journal of Agro-Environment Science, 2017, 36(11): 2257-2266. DOI:10.11654/jaes.2017-0549
[25] 潘兰佳, 唐晓达, 汪印. 畜禽粪便堆肥降解残留抗生素的研究进展[J]. 环境科学与技术, 2015, 38(12Q): 191-198.
Pan L J, Tang X D, Wang Y. Research progress of residual antibiotics degradation in livestock and poultry feces composting[J]. Environmental Science & Technology, 2015, 38(12Q): 191-198.
[26] 孔晨晨, 张世文, 聂超甲, 等. 农用地土壤抗生素组成特征与积累规律[J]. 环境科学, 2019, 40(4): 1981-1989.
Sun C C, Zhang S W, Nie C J, et al. Composition, characteristics, and accumulation of antibiotics in the soil in agricultural land[J]. Environmental Science, 2019, 40(4): 1981-1989.