2017, Vol. 38
2. 环境生物与控制教育部重点实验室(湖南大学), 长沙 410082;
3. 湖南城市学院市政与测绘工程学院, 益阳 413000;
4. 湖南省林业科学院生物环境工程研究所, 长沙 410004
, GOU Yu1,2 , LI Yuan-ping3 , WU Yan-xin1,2 , CHEN Yan-rong1,2 , LI Hui4 , LIU Yao1,2 , WANG Yuan-nan1,2 , ZHANG Dao-li1,2 , ZHU Fu-zao1,2 , ZENG Guang-ming1,2
2. Key Laboratory of Environmental Biology and Pollution Control(Hunan University), Changsha 410082, China;
3. College of Municipal and Mapping Engineering, Hunan City University, Yiyang 413000, China;
4. Institute of Biological and Environmental Engineering, Hunan Academy of Forestry, Changsha 410004, China
纤维素作为自然界中最丰富的可再生碳源, 年产量超过1500亿t, 广泛存在于农林等有机固体废物中, 如稻草、畜禽粪便、废弃木屑等, 尤其以农业废物为主[1].仅我国每年农作物秸秆的产量就高达7亿t左右, 其中又以稻草产量最大.虽然每年产生大量的生物质资源, 但大约仅有11%左右用于燃料、造纸、饲料及建筑等方面, 还有相当一部分被废置或直接焚烧, 造成了大量的资源浪费, 并且衍生出各种环境污染问题, 因此, 研究纤维素的降解与利用具有重要的意义[2, 3].
堆肥化是一种自然加热、好氧、无二次污染的生物降解技术, 适于将农业废物降解转化成稳定的可用资源.但由于纤维素分子之间通过大量氢键形成平行牢固的微晶束, 并与化学结构复杂多变的木质素紧密结合在一起, 阻碍了堆肥化过程中微生物对木质纤维素的利用, 使得纤维素降解成为了农业废物被微生物降解利用的前提与关键[4].糖苷水解酶(glycoside hydrolases, GH)可以作用于β-1, 4糖苷键, 从而将木质纤维素水解成微生物更容易利用的物质, 其中的GH6家族包含内切纤维素酶和外切纤维素酶, 广泛分布于真菌和细菌中, 是纤维素早期降解过程中重要的酶之一[5~7].因此, 含有GH6家族基因的微生物是堆肥化过程中参与纤维素前期降解利用的重要微生物, 对堆肥化的顺利实施利用具有重要意义, 然而关于堆肥化过程中GH6家族基因多样性及丰度变化的研究却鲜见报道.
堆肥化是一个复杂的动力学与生物化学工程, 不同理化参数对堆肥化进程及微生物群落组成变化具有不同的影响.赵晨阳等[8]研究显示堆肥化过程中通风时间和曝气量是影响氮素损失的重要因素. Chen等[9]发现pH和堆体温度是影响堆肥体系中参与反硝化和硝化过程的nirK和nirS基因变化的主要因素. Sundberg等[10]实验结果表明不同的初pH对堆肥化过程中微生物群落的影响有显著差别. Chen等[11]实验表明堆体温度对真菌群落的影响最为显著.赵晨阳等[12]通过猪粪堆肥化实验结果表明, 翻堆频率对堆肥化过程中氨气、N2O等温室气体的排放具有显著影响.这些研究大多局限于单一的或几个理化参数, 无法提供较为系统全面的参考, 系统研究堆肥化过程中理化参数对纤维素降解酶GH6家族基因的影响, 将有助于对农业废物堆肥化的深入理解和精细控制.
因此, 本文以农业废物稻草为主要原料进行堆肥化, 采用PCR-DGGE技术, 冗余分析和蒙特卡罗置换检验方法, 以及基于冗余分析的t-value分析, 研究堆肥化过程中理化参数对糖苷水解酶GH6家族基因变化的影响, 按影响程度从大到小排序, 筛选出显著影响因子, 以期为堆肥化过程中的纤维素生物降解及理化参数优化和控制的研究提供更为全面的参考.
1 材料与方法 1.1 实验设置与取样堆肥化过程采用的原料包括稻草、易腐烂蔬菜、麸皮和土壤, 除土壤外, 原料均采集于长沙郊区.稻草和菜叶经风干后切成1 cm~2 cm的片段.土壤采集于岳麓山林间表层10 cm~15 cm的腐殖质层土壤, 在室内自然阴干后过40目筛, 用于增加堆体的微生物种类和部分微量营养元素.易腐烂蔬菜收集自本地市场, 为微生物的生长代谢提供易降解的有机质.稻草、土壤、蔬菜和麸皮经过处理后, 按照11:8:3:2[13]的质量比混合均匀, 将原料松散地装入实验室具有良好保温性能的装置中, 并通过添加灭菌去离子水, 调节原料的初始有机质质量分数约为60%, C/N约为30, 含水率约为60%, 堆体质量湿重(除去装置质量)约为20 kg.实验周期为50 d, 在第0、2、4、8、10、12、15、20、30、50 d取样.取样时, 从堆体上、中、下这3个部位各取一份样品, 将3份样品混合均匀后分为两部分, 一份用于理化参数的测定, 另一份保存于-20℃用于PCR-DGGE实验分析.为维持堆体好氧环境, 在前12 d每天进行翻堆, 之后每3 d翻堆一次.每次取样后, 采用恒重法测定堆体含水率, 通过添加灭菌去离子水调节堆体含水率, 维持在50%~60%左右.
1.2 理化参数测定本实验共测定8个理化参数：堆体温度、环境温度、pH、WSC、含水率、TOM、TN、C/N.各参数的测定方法参照Chen等[11]实验中描述的方法.每次测定均设置3次平行实验, 取平均值, 最大实验误差限＜5%.
1.3 DNA提取及PCR-DGGE实验样品DNA提取采用Power Soil® DNA Isolation Kit (Mo Bio, USA), 提取步骤按照试剂盒提供的说明书进行.粗提DNA采用纯化试剂盒(BioTeke, Beijing)进行纯化.采用1%的琼脂糖凝胶电泳检测粗提和纯化后的DNA提取效果, 并采用核酸蛋白测定仪(Eppendorf, Germany)检测纯化产物浓度.结果显示, 纯化后DNA的D260/D280在1.6~1.8之间, 质量和浓度较为理想.纯化后的DNA保存于-20℃, 用于后续实验分析.
PCR采用引物cell2F和cell2R[5]在MyCycler (Bio-Rad, USA)上进行目的片段扩增, 该引物可以扩增大部分微生物的GH6家族基因, 包括真菌和细菌的, 引物详细信息见表 1.反应体系为1 μL DNA模板, 25 μL 2×Power Taq PCR Master Mix (Tiangen, Beijing), cell2F和cell2R引物各1 μL (20 μmol), 无菌Mili-Q水补足50 μL.扩增条件为：95℃预变性3 min, 95℃变性45 s, 64℃退火45 s, 72℃延伸30 s, 35个循环, 72℃ 5 min. PCR结束后, 使用2%的琼脂糖凝胶电泳检测目的片段扩增效果.每个样品设置两组平行实验.
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表 1 GH6家族基因PCR引物cell2F和cell2R Table 1 Characteristics of PCR primers, cell2F and cell2R, used in GH6 family genes |
DGGE采用DcodeTM基因突变检测系统(Bio-Rad, USA)进行电泳.取40 μL PCR产物, 采用1 mm质量与体积比为8%的PACE(聚丙烯酰胺胶), 变性梯度35%~70% (100%变性剂为7 mol·L-1的尿素和40%的去离子甲酰胺的混合物).电泳条件为：1×TAE缓冲液, 120 V电压, 60℃恒温、恒压12 h.电泳结束后, 使用SYBR Green I (Molecular Probes, Carlsbad, CA, USA)核酸染料进行染色.采用Doc2000凝胶成像系统(Bio-Rad, USA)进行拍照, 使用Quantity One 2.0软件(version 4.5, Bio-Rad, USA)进行图像处理分析.
1.4 数据处理采用SPSS 11.5软件对所有理化参数进行显著性差异分析(one-way analysis of variance, ANOVA)以检验不同理化因子在不同时间是否具有显著性差异, 并采用Z-score标准化去除理化参数之间的量纲差异, 从而构建环境因子矩阵. DGGE图谱使用Quantity One软件处理和分析, 消除PACE胶和泳道背景干扰后, 以GH6家族基因在不同条带中亮度峰值的相对百分比构建生物信息矩阵.利用处理得到的数据计算堆肥化过程中GH6家族基因的丰富度(S)、均匀度(Eh)和香农-威纳(H′)指数[14].使用Canoco 4.5软件对获得的生物信息矩阵进行除趋势对应分析(detrended correspondence analysis, DCA), 以确定选择线性模型(linear model)或单峰模型(unimodal model)进行后续分析.结果表明, 第一排序轴长度为2.885, 因此, 选用基于线性模型的冗余分析进行后续分析[15].采用蒙特卡罗置换检验[16]计算每个理化参数的显著性及其对GH6家族基因变化解释率百分比.利用t-value分析不同GH6家族基因所代表的物种与筛选得到的显著因子之间的相关关系[17].理化参数变化图采用OriginPro 8软件绘制, 冗余分析和t-value分析结果采用Canodraw 4.5软件作图.
2 结果与讨论 2.1 理化参数变化堆肥化过程中理化参数的变化情况如图 1所示.在堆肥化过程前4 d, 堆体pH迅速上升, 在第4 d达到最大值8.96, 这是由于堆体中微生物大量生长代谢, 有机氮通过氨化作用和矿化作用产生大量的水溶性氨, 使得堆体pH快速上升.随后由于水溶性氨的挥发[18]和微生物活动释放出H+, 导致pH下降并维持在8.20左右.微生物的新陈代谢使得大量的有机碳被分解利用, 导致C/N由最初的30.19逐渐下降到17.72, 通常认为当堆体的C/N降低到15~20[19]时, 可视为堆肥产品达到腐熟[图 1(a)].堆肥化过程中, 温度是影响微生物活性的重要因素之一[20, 21].本次实验中堆体温度呈现出明显的4个时期, 包括升温期(0~1 d)、高温期(2~7 d, 温度高于50℃)、降温期(8~30 d)和腐熟期(31~50 d).满足了堆肥的卫生学指标和腐熟条件[图 1(b)].堆体含水率维持在50%~60%左右. WSC在最初4 d内迅速下降, 并在4~8 d内上升, 然后逐渐下降至1.48 g·kg-1[图 1(c)].微生物的大量生长代谢, 迅速分解消耗体系内的TOM, 使得堆体TOM含量迅速下降, 从初始的447.75 g·kg-1逐渐下降到308.60 g·kg-1并趋于稳定[图 1(d)].在TOM含量迅速下降的背景下, 微生物对N营养物质的消耗速度小于堆体中原料质量下降速度, 因而堆体中TN含量在前12 d呈现出“相对浓缩效应”[22], 堆体TN含量呈现出明显上升趋势, 到后期上升趋势趋于平缓, 这与文献[23~25]的研究结果相似.
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图 1 堆肥化过程中理化参数变化 Fig. 1 Changes of physico-chemical parameters during composting process |
GH6家族基因PCR结果如图 2所示, 各样品扩增产物条带明亮清晰、目标位置正确, 扩增产物大小在150~250 bp之间, 为目标片段长度, 无明显非特性扩增.扩增产物质量可满足后续DGGE实验分析.
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编号1~10分别对应第0、2、4、8、10、12、15、20、30、50 d样品, 11为空白对照, M为Marker Ⅲ 图 2 GH6家族基因PCR结果 Fig. 2 PCR results for GH6 family genes |
DGGE图谱[图 3(a)]可以直观地反映含有GH6家族基因的微生物种群动态变化. DGGE图谱中同一水平位置的条带代表了具有相似解链特性的GH6家族基因[26].泳道对比分析结果图谱[图 3(b)]中条带位置及条带相对亮度直观地反映了含有GH6家族基因种群丰度和多样性的动态变化. 图 3每个泳道中条带的相对亮度能反映出该条带所指示的菌群相对生物量的多少, 并且不同泳道中的同一位置条带相对亮度的变化, 能够反映该基因所指示的菌群的相对丰度变化[15, 27, 28].其中泳道3、5~8中编号为24的条带相对亮度最高, 泳道2、9和10中为条带25, 这表明条带24和条带25所指示的菌群分别为降温期和腐熟期的优势菌种, 且在高温期二者均有出现.大量研究表明, 堆肥化过程中木质纤维素的降解主要发生在高温期和腐熟期[29~31], 高温期中嗜热细菌、真菌和放线菌是降解木质纤维素的主要微生物, 这与本研究中纤维素降解优势菌种主要集中在高温期和腐熟期的结果相吻合.
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编号1~10分别对应第0、2、4、8、10、12、15、20、30、50 d样品; (b)中横坐标%表示各样品条带与第0 d样品条带的相似度 图 3 GH6家族基因扩增片段DGGE分析结果及泳道对比分析结果 Fig. 3 DGGE profile of GH6 family genes fragments and land compare |
堆肥化过程中GH6家族基因多样性变化如表 2所示, 各样品中GH6家族基因丰富度(S)、均匀度(Eh)和香农-威纳指数(H′)均有差异.在堆肥化初期, 堆体温度迅速上升, 从第0~4 d, GH6家族基因丰富度由28迅速下降到最小值8, 随后在第8 d上升到最大值29.香农-威纳指数H′在第0 d最高为3.28, 第4 d降到最小值2.05.均匀度(Eh)整体差异不大.
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表 2 堆肥化过程中GH6家族基因多样性 Table 2 Diversity indices of GH6 family genes during composting |
2.4 冗余分析和蒙特卡罗置换检验结果
对环境因子矩阵和生物信息矩阵进行冗余分析结果如表 3所示.所有排序轴均显著(P=0.002), 排序结果理想[13].其中前两个排序轴的特征值分别是0.432和0.252, 与8个环境因子的相关系数分别为0.992和0.976, 排序轴1和排序轴2分别解释了43.2%和25.2%的GH6家族基因变化, 4个排序轴总共解释了83.1%的GH6家族基因变化和89.0%的种群与环境因子相关关系.实验中检测的8个理化参数总共解释了93.1%的总特征值, 说明实验所测量的8个理化参数是影响堆肥过程中GH6家族基因变化的重要因素.
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表 3 GH6家族基因DGGE图谱与环境因子冗余分析结果 Table 3 Redundancy analysis results for GH6 family genes, DGGE profiles, and environmental parameters |
通过蒙特卡罗置换检验可以检验每个环境因子对GH6家族基因变化的解释率, 从而将选取的环境因子按对GH6家族基因变化的影响大小进行排序, 可以更直观地理解不同环境因子对GH6家族基因变化的影响[32].蒙特卡罗置换检验结果如表 4所示.其中pH、堆体温度和TN对GH6家族基因变化的解释率分别是24.92%、15.57%和15.04%, 且三者的P值均小于0.05, 表示三者是影响GH6家族基因变化的显著因子.
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表 4 蒙特卡罗置换检验分析每个环境因子对GH6家族基因变化的解释率结果 Table 4 Monte Carlo permutation test between GH6 family genes and each environmental parameter |
pH是影响微生物降解纤维素的重要因素之一.贾辉等[33]发现pH过高或过低都会影响纤维素降解菌的生长代谢, 从而降低纤维素的降解速率.堆体温度是堆肥系统中微生物活动的反映和重要影响因素.梁东丽等[34]的研究发现, 当堆体温度低于或等于60℃时, 堆体中的纤维素酶活与堆体温度呈显著正效应关系.堆肥化过程中氮素是微生物生长代谢的主要营养元素之一, 这使得堆体TN含量成为影响含有GH6家族基因的微生物活性的重要因素之一[13].
2.5 基于冗余分析的t-value分析结果为了进一步揭示堆肥过程中3个显著因子与含有GH6家族基因物种演替之间的相关关系, 在冗余分析的基础上, 采用CanoDraw分析得到3个显著因子的t-value双序图(图 4). 图 4中黑色虚线代表DGGE图谱中不同GH6家族基因条带分析得到的不同物种, 黑色实线代表 3个显著因子, 实线圆部分表示正相关, 虚线圆部分表示负相关, 面积越大, 该理化参数对GH6家族基因变化的影响越大.当某物种箭头完全在实线(与实线圆对称的虚线圆)圆内时, 表明该物种的动态变化与该环境因子显著正相关(负相关); 当某物种箭头穿过实线(与实线圆对称的虚线圆)圆时, 表明该物种的动态变化与该环境因子正相关(负相关)但不显著[17].如图 4中, 编号20~23所代表的物种变化与pH显著正相关, 编号11~19所代表的物种变化与pH正相关但不显著.从图 4中可以看出, pH、堆体温度和TN三者圆面积代表的影响程度相对大小分别是pH>堆体温度>TN, 这与蒙特卡罗置换检验结果(表 4)得到的变量单独解释量相吻合.并且按照含有GH6家族基因的物种变化与环境因子之间的正负相关性, 可将DGGE图谱中分析得到的不同物种大致分为5类, 其中编号4~10所代表的物种为一类, 编号11~14为一类, 编号15~17为一类, 编号20~23为一类, 编号24~27为一类.郭香麟等[35]的研究表明, 温度是影响餐厨垃圾和秸秆混合厌氧消化过程中细菌和放线菌降解木质纤维素的重要因素.冯红梅等[36]从高温期堆肥样品中筛选得到6株纤维素降解菌, 发现混合菌群在45℃条件下培养时, 具有最大酶活.张桂山等[37]通过分离筛选得到不同的纤维素降解细菌表明, pH对不同菌株的纤维素降解酶活影响不同.黄玉梓等[38]的研究发现, 土壤中纤维素降解微生物在不同N含量环境下具有不同的响应机制, 当以60、120和240 kg·(hm2·a)-1的N沉降量处理人工杉木林, 其中60与120 kg·(hm2·a)-1的N处理后, 土壤呼吸速率与土壤纤维素酶活性呈正相关性, 而240 kg·(hm2·a)-1的N处理则不显著.在下一步的研究中, 通过构建堆肥化体系中GH6家族基因系统发育树、优势菌群落演替等分析, 系统揭示这些不同种类微生物的功能和生长特征, 从而深入完善堆肥化体系中GH6家族基因的研究, 将有望通过对理化因子的调控实现对农业废物堆肥化中参与纤维素降解微生物群落的精细控制.
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图 4 3个显著因子与GH6家族基因变化的RDA t-value双序图 Fig. 4 The t-value biplot base on a redundancy analysis of three significant factors and the GH6 family genes changes |
(1) 在农业废物稻草好氧堆肥化过程中, 糖苷水解酶GH6家族基因多样性和丰度随着堆肥化进程整体呈现出波动趋势.含GH6家族基因的优势菌种在堆体不同时期有所不同.
(2) 对构建的生物信息矩阵和环境因子矩阵进行冗余分析表明, 堆肥化过程中测量的8个理化参数共解释了83.1%的GH6家族基因变化, 对GH6家族基因变化有重要影响.蒙特卡罗置换检验表明, 8个理化参数对GH6家族基因变化影响的大小为：pH＞堆体温度＞TN＞TOM＞C/N＞含水率＞环境温度＞WSC.其中pH、堆体温度和TN是影响GH6家族基因变化的显著因子(P＜0.05), 三者分别解释了24.92%、15.57%和15.04%的GH6家族基因变化.
(3) 采用基于冗余分析的t-value分析方法分析GH6家族基因所代表的物种与3个显著因子的正负相关性表明, 实验中所检测到的含GH6家族基因的微生物, 按与不同环境因子的正负相关性, 大体可分为5类, 其中编号4~10的微生物群落变化与堆体温度显著正相关, 与pH和TN显著负相关, 编号20~23的微生物群落变化与pH和TN都呈显著正相关关系.这些具有显著性相关的因子是影响GH6家族基因变化的主要因子, 这与蒙特卡罗置换检验结果相吻合.
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