相对于传统的生物脱氮过程，短程生物脱氮可节省约25%的曝气量，40%的碳源，同时减少50%的污泥生成量，缩短脱氮反应时间，因此受到了人们的广泛关注^{[1, 2, 3, 4]}. 将生物膜技术引入到短程硝化工艺中，一方面可以增大反应器内的生物量，保证世代较长的硝化细菌^{[5, 6, 7]}； 另一方面溶解氧(dissolved oxygen,DO)在生物膜上存在浓度梯度，导致好氧区、 缺氧区和厌氧区共存在一个反应系统，这又为直接脱氮提供了良好的环境. 聚氨酯填料是一种理想的多孔填料，其具有易于微生物的固定，机械强度高等优点，普遍应用于各种有机废水处理中^{[8, 9, 10]}. 因此本试验以聚氨酯填料作为微生物载体，研究其在短程脱氮工艺中的脱氮性能. 通过改变进水碳氮比(carbon nitrogen ratio,C/N)，掌握硝酸氮和亚硝酸氮的转化过程，并同时考察DO和pH作为该过程自动控制参数的可行性，以期为聚氨酯短程脱氮系统的设计及应用提供理论及技术依据. 1 材料与方法 1.1 反应装置及试验进水

本试验装置如图 1所示. 装置的主体为有机玻璃，内径20 cm，高150 cm，内装聚氨酯载体填料，填料层高度为100 cm，有效容积为31.4 L. 填料层底部安装φ 20 cm的塑料支撑板，其上有分布均匀的φ 3 mm的小孔. 反应器配用1套配气系统、 1套进水系统和1套保温装置. 聚氨酯填料为2 cm×2 cm×2 cm的立方体，密度350 kg ·m^-3，比表面积1821 m² ·m^-3，孔径1~1.5 mm.

图 1

Fig. 1

1.水箱; 2.蠕动泵; 3.取样口; 4.填料; 5.排水孔; 6.温度控制器; 7.气体流量计; 8.DO,pH检测仪; 9.曝气机 图 1 聚氨酯生物膜反应器示意 Fig. 1 Schematic diagram of the polyurethane biofilm reactor

试验进水为人工配制，以葡萄糖作为碳源，NH₄Cl作为氮源，KH₂PO₄作为磷源，及其他微量元 素，以满足微生物对各种微量元素的需求. 试验各阶段所配水样在进入反应器前的各项指标如表 1所示.

表 1(Table 1)

表 1 进水水质成分 /mg ·L-1 Table 1 Characteristics of synthetic wastewater/mg ·L-1 成分 C/N 15 10 5 1.8 COD 600 500 450 400 总氮 40 50 90 220 KH2PO4 8 10 10 10 MgSO4 5.0 NaOH ND1) NaHCO3 ND CaCl2·H2O 1.0 FeCl3·6H2O 0.2 1)根据实际情况确定添加量，控制进水pH值在7.5~8.5

表 1 进水水质成分 /mg ·L-1 Table 1 Characteristics of synthetic wastewater/mg ·L-1

1.2 检测与分析方法 1.2.1 常规水质分析及计算公式

COD、 氨氮、 总氮、 亚硝酸氮和硝酸氮均采用国家标准方法测定^[11]. pH值、 DO、 温度采用美国哈希HQ30d便携式多功能测定仪测定. 亚硝酸氮积累率(nitrite accumulation ratio,NAR)、 同时硝化反硝化(simultaneous nitrification and denitrification,SND)效率和游离氨浓度分别由以下方程式计算得到：

本试验采用的基因组DNAs试剂盒来自大连宝生物工程有限公司. 细菌16S rDNA V3片断扩增引物采用PCR通用引物. 其上下游引物分别为F₃₃₈GC(5′-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGG GGGCACGGGGGGACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和R₅₁₈(5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′). 其中“GC夹”是专为后续DGGE添加设计. PCR反应体系扩增条件及DGGE操作过程详见文献^[12]. 1.3 试验过程

根据进水C/N的变化情况，把反应器运行时段划分为4个阶段，总共历时100 d. 表 2为反应器在各阶段的运行参数.

表 2(Table 2)

表 2 试验期间运行参数 1) Table 2 Operational conditions during the whole experiment 阶段 历时/d 充水比/% COD进水/mg·L-1 总氮进水/mg·L-1 C/N Ⅰ前期 20 连续进水 600(21.5) 40(3.5) 15 Ⅰ后期 11 75 600(21.5) 40(3.5) 15 Ⅱ 16 75 500(15.3) 50(5.3) 10 Ⅲ 25 75 450(12.3) 90(5.6) 5 Ⅳ 28 75 400(12.3) 220(9.5) 1.8 1)括号内为标准偏差，COD进水和总氮进水表示进水COD和总氮浓度

表 2 试验期间运行参数 1) Table 2 Operational conditions during the whole experiment

在进行本试验之前，该系统处于良好的硝化反硝化运行状态，DO控制在4~6 mg ·L^-1，温度25℃±1℃，进水氨氮40~60 mg ·L^-1，出水氨氮在5 mg ·L^-1以下，进水COD 350~450 mg ·L^-1，出水COD在60 mg ·L^-1以下^[12]. 在反应器短程硝化反硝化启动后，根据亚硝酸菌和硝酸菌对氧的饱和常数^[13]，将反应器内DO控制在0.5~1.5 mg ·L^-1、 温度20℃±1℃，水力停留时间为6~10 h. 试验用水采用第一阶段配制的人工废水，即进水C/N 15.

图 2为反应器在试验期间进出水氮的浓度变化曲线. 在第I阶段前期，反应器采用连续进水和连续曝气的方式运行. 反应器运行前5 d，出水氨氮浓度上升到28.1~31.4 mg ·L^-1. 原因可能是由于限制性供氧对硝化细菌产生抑制作用，即氨氮氧化为硝酸氮过程受阻，同时脱落的生物膜带走了大量的硝化细菌. 在第6 d开始，出水氨氮逐渐降低. 到第20 d，氨氮去除率达到89.8%，此时亚硝酸氮累积率达到72.5%，这标志着系统内完成了短程硝化反应. 此时将连续进水改为间歇进水，运行周期为8 h，进水0.2 h，连续曝气5 h，静沉2.5 h，排水0.3 h. 在第21~30 d，氨氮去除率稳定在87.5%~98.6%，总氮去除率稳定在81.8%~90.0%，亚硝酸氮累积率维持在62.8%~68.1%. 在第31 d，通过减少进水COD，增加进水氨氮，将进水C/N降低到10. 在第Ⅱ阶段，氨氮去除率仍维持在非常高的水平(大于95%). 在第47 d天将进水C/N继续降低到5，此时出水氨氮浓度上升到18.6 mg ·L^-1，去除率下降到74.3%，总氮去除率下降到59.1%，而亚硝酸氮累积率没有受到影响，达到68.2%. 在第48~62 d，出水氨氮浓度逐渐降低，最终稳定在7.6~9.6 mg ·L^-1，氨氮去除率维持在84.0%~88.1%，亚硝酸氮累积率在69.6%~75.9%. 在第72 d，将进水氨氮浓度增大到220 mg ·L^-1，COD减少至400 mg ·L^-1，即进水C/N 1.8，出水氨氮浓度上升到75.2 mg ·L^-1，去除率下降到58.5%. 在第73~91 d，出水氨氮逐渐降低至53.8 mg ·L^-1，氨氮去除率上升到70.6%. 在第92~99 d，氨氮去除率维持在67.8%~69.7%，总氮去除率在42.2%~49.7%，亚硝酸氮累积率在83.6%~90.3%. 在反应器运行的4个阶段里，硝酸氮都维持在较低水平，同时发现系统内无法得到完全是亚硝酸氮的硝化产物.

图 2

Fig. 2

图 2 聚氨酯生物膜反应器氮转化关系 Fig. 2 Conversion of nitrogen in the polyurethane biofilm reactor

图 3为每个阶段稳定运行期间系统内氨氮、 硝酸氮和亚硝酸氮浓度的变化曲线. 在每个周期的曝气阶段，伴随氨氮浓度的降低亚硝酸氮浓度和硝酸氮浓度逐渐增加. 在接下来的厌氧阶段，亚硝酸氮、 硝酸氮和氨氮均降低，但由于进水C/N的降低，亚硝酸氮、 硝酸氮和氨氮降低程度不同. 氨氮在进水C/N在15和10时，氨氮浓度在曝气阶段已降到0.5以下，因此在厌氧阶段基本没有发生变化，仍然维持在0.5以下. 氨氮在进水C/N 5和1.8时，氨氮浓度在厌氧阶段继续降低，但降解速率很低，分别为0.25×10^-3 kg ·(m³ ·h)^-1和1.92×10^-3kg ·(m³ ·h)^-1. 亚硝酸氮浓度和硝酸氮浓度在厌氧阶段均逐渐降低. 曝气开始时由于二氧化碳的溢出，pH值陡增. 在硝化反应阶段，由于消耗碱度，系统内pH值逐渐降低. 而在反硝化过程中，由于产生碱度，系统内pH值在厌氧段上升. pH值曲线的拐点划分了硝化与反硝化反应过程. 随着进水氮负荷的增加，氨氮的降解速率下降，而亚硝酸氮累积率上升.

图 3

Fig. 3

图 3 聚氨酯生物膜系统一个周期内氮的变化曲线 Fig. 3 Typical variations of nitrogen species in polyurethane biofilm system

图 4所示为不同进水碳、 氮负荷条件下生物膜样本的微生物群落DGGE分析结果. 从中可以看出，在聚氨酯生物膜反应器不同条件下生物膜的DGGE谱带中同样既有一些普遍存在的微生物种群，也有特异性的种属. 条带12、 13、 14、 20和24在各个谱带中均有出现，说明这些微生物群落具有很强的适应性和较为广泛的生态幅. 同时还可以发现，对于同一物种，它们在整个微生物种群中的功能和地位却不同，如条带14和24的亮度始终较强，在整个反应器运行过程中始终保持优势地位，条带13随着氮负荷的降低逐渐减弱，而条带5在进水C/N 5时最强. 从整体来看，在不同进水负荷条件下，各生物膜样本条带数量相差不大，这可能由于聚氨酯生物膜系统微生物量大，抗负荷冲击能力强.

图 4

Fig. 4

图 4 不同C/N进水脱氮系统生物膜样品DGGE测试结果 Fig. 4 Comparison of the DGGE patterns of biofilm samples taken from influents with different C/N ratio

不同进水C/N条件下样品的Shannon-wiener指数(H′)分布如表 3所示. 从整体来看，随着进水C/N的提高，3个样品中微生物的多样性出现较明显的变化. 但是这4个样品的均匀度指数(E)都较为接近，说明即使微生物群落多样性发生了较大的改变，但是微生物在这3种环境条件下的分布十分均匀. 聚氨酯生物膜反应器中微生物的多样性顺序为：进水C/N 15时的样品>进水C/N 10时的样品>进水C/N 5时的样品>进水C/N 1.8时的样品. 这说明随着进水C/N的降低，微生物的多样性是下降的. 具体表现为：当进水C/N变化时，微生物种群多样性变化明显，其中进水C/N 1.8时H′(2.09)最低，进水C/N提高到15时，H′增加到2.45. 本试验过程中聚氨酯生物膜系统始终处于低DO条件下，提高进水C/N有助于异养菌的生长，保证微生物的多样性.

表 3(Table 3)

表 3 不用C/N进水时微生物群落多样性分析 Table 3 Diversity analysis of bacteria community in influents with different C/N ratio C/N H′ E Var H′ 15 2.45 0.96 0.00478 10 2.40 0.95 0.00469 5 2.29 0.96 0.00316 1.8 2.09 0.97 0.00212

表 3 不用C/N进水时微生物群落多样性分析 Table 3 Diversity analysis of bacteria community in influents with different C/N ratio

2.4 微生物菌群多样性比较分析

对DGGE图谱上的条带进行分离、 克隆，并对测序结果进行比对分析. 在GenBank上寻找与克隆序列具有最高相似性的菌种或克隆，结果见表 4. 从反应器运行过程中的微生物种群演替看，总体上Uncultured γ-Proteobacterium(GQ249377.1)和Acinetobacter sp. Ld3 (HQ659186.1)始终为聚氨酯生物膜反应器中的优势细菌. Nitrosomonas sp.(AF363292.1)、 Nitrosospira sp.(GU097367.1)和Nitrospira sp.(HM131833.1)是系统内主要的硝化细菌. 从图 4中发现这3类微生物存在于不同的条带里，根据系统的运行效果看，当进水C/N从15下降到10，氨氮的去除效率基本没有发生变化； 在进水C/N由10依次下降到5和1.8时，氨氮的去除效率分别下降到90.6%和75.6%. 说明进水C/N对硝化作用的影响很大. 同时注意到每个条带都存在与硝酸菌相关的序列，但是系统内仍然发生了短程硝化. 说明低DO条件下硝酸菌生长受到抑制，虽然硝酸菌存在于系统中但不是主要的菌种. 在短程硝化过程中，由于硝酸菌对DO亲和力低于亚硝酸菌，硝酸菌的生长和活性容易受到低DO的影响. 在进水C/N 15时，Pseudomonas fluorescens(HQ123477.1) 是生物膜内主要反硝菌种. 当进水C/N降低到5和1.8时，系统内又增加了Pseudomonas butanovora(EU024130.1)反硝酸菌种，说明系统内反硝酸菌种优势增加. Pseudomonas sp.菌种广泛存在于市政污水处理厂和实验室反应器中，是重要的反硝酸菌种^[14].

表 4(Table 4)

表 4 DGGE图谱中条带回收测序分析结果 Table 4 Sequence analysis of bands obtained from DGGE analysis 条带 最近似细菌16S rRNA序列 相似度/% 1 Arcobacter sp. HME6609(HM584709) 100 2 Uncultured bacterium(DQ673368.1) 98 3 Pseudomonas butanovora(EU024130.1) 96 4 Uncultured Actinomycete(AF467341.1) 94 5 Uncultured Desulfovibrio sp.(AB522153) 97 6 Uncultured Comamonas sp.(GU257809.1) 97 7 Uncultured Trichococcus sp.(HQ183758.1) 100 8 Uncultured β-Proteobacterium(FM211753.1) 97 9 Nitrosomonas sp. DYS317 (AF363292.1) 99 10 Ideonella sp. IMCC1722(DQ664241.1) 97 11 Uncultured β-Proteobacteria bacterium(CU926234.1) 99 12 Pseudomonas fluorescens(HQ123477.1) 100 13 Uncultured Proteobacterium(HM534369.1) 100 14 Uncultured γ-Proteobacterium(GQ249377.1) 100 15 Acidovorax sp.(FN794221.1) 98 16 Bacillus licheniformis(GU967444.1) 97 17 Uncultured Novosphingobium sp.(HM438567.1) 98 18 Uncultured β-Proteobacterium(EF562572) 96 19 uncultured Lachnospiraceae bacterium(EF707712) 99 20 Uncultured Nitrosospira sp. (GU097367.1) 98 21 Nitrospira sp.(HM131833.1) 95 22 Uncultured Firmicutes bacterium(GU957444.1) 98 23 Sphingomonas sp. R114(HQ219285.1) 100 24 Acinetobacter sp. Ld3 (HQ659186.1) 100

表 4 DGGE图谱中条带回收测序分析结果 Table 4 Sequence analysis of bands obtained from DGGE analysis

3 讨论 3.1 C/N对短程硝化反硝化的影响

C/N对聚氨酯生物膜系统脱氮作用的如表 5所示. 当进水C/N从15下降到10，氨氮的去除效率没有发生明显变化，但是，这两个阶段的出水氨氮都小于1 mg ·L^-1，表现出非常好的硝化效果. 当进水C/N由10依次下降到5和1.8时，氨氮的去除效率从99.1%下降到90.6%和75.6%，这与李锋民等^[15]的试验结果一致. 进水有机负荷高时有助于异养菌的增殖，在生物膜上形成优势，从而抑制硝化细菌的生长，影响硝化反应. 理论上在反硝化过程中去除1 g硝酸氮需要2.86 g有机碳源. 当进水C/N由15依次降到10、 5和1.8时，对应的总氮去除率分别为88.7%、 91.0%、 71.8%和55.9%. 即总氮的去除效率随着氮负荷的增加而减小，这与Chiu等的研究结果一致^[16]. 高C/N加速异养反硝化菌的生长，从而提高反硝化速率^{[17, 18]}. 反硝化过程需要有机碳源作为电子供体，缺乏有机碳源将会抑制反硝化反应，因此影响氮的转化^[19]. 当进水C/N由15依次降到10、 5和1.8时，对应的NAR分别为56.1%、 62.3%、 72.3%和83.2%，即NAR随着氮负荷的增加而增加，这与赵永贵等^[20]的研究结果一致. 原因可能是氮负荷过高导致游离氨浓度增加，从而抑制硝化细菌的代谢，影响硝化反应. Anthonisen等^[21]报道称亚硝酸菌和硝酸菌分别受到10~150 mg ·L^-1和0.1~1.0 mg ·L^-1的游离氨抑制. 而Furukawa等^[22]研究发现FA在0~100 mg ·L^-1时均对NOB产生抑制. Vadivelu等^[23]发现当FA的浓度达到6 mg ·L^-1时就可完全抑制NOB的生长. 本试验中系统在曝气结束后，进水C/N为15时，游离氨浓度为0.01 mg ·L^-1，进水C/N为10时，游离氨浓度为0.02 mg ·L^-1，而进水C/N 5时，游离氨浓度上升至0.26 mg ·L^-1，进水C/N 1.8时，游离氨浓度为1.35 mg ·L^-1. 当进水C/N为15和10时，游离氨浓度值远远小于硝酸菌和亚硝酸菌抑制限制. 当进水C/N为5和1.8时，理论上游离氨浓度不在亚硝酸菌的抑制范围内，而却在抑制亚硝酸氮氧化菌的范围内，因此进水C/N 1.8时，NAR最高. 然而进水C/N为10和15时，NAR也分别达到62.3%和56.1%. 说明控制短程硝化过程的关键因素不止氮负荷或游离氨.

表 5(Table 5)

表 5 聚氨酯生物膜反应器各个阶段的脱氮效能 Table 5 Nitrogen removal of the polyurethane biofilm reactor at different stages 指标 C/N 15 C/N 10 C/N 5 C/N 1.8 氨氮去除率/% 99.0 99.1 90.6 75.6 总氮去除率/% 88.7 91.0 71.8 55.9 NAR/% 56.1 62.3 72.3 83.2 SND效率/% 55.1 52.3 43.8 40.7 氮容积负荷/kg·(m3·d)-1 0.086 0.108 0.153 0.274

表 5 聚氨酯生物膜反应器各个阶段的脱氮效能 Table 5 Nitrogen removal of the polyurethane biofilm reactor at different stages

3.2 C/N对系统SND的影响

当脱氮系统内DO浓度高于0.3 mg ·L^-1时，阻止硝酸氮还原酶的形成，抑制反硝化反应. 然而在试验中发现反应器在好氧段降解的氨氮与生成的亚硝酸氮和硝酸氮不等量，说明系统内发生了SND反应. 本研究认为SND更符合微环境理论，Tan等^[12]在对聚氨酯生物膜研究中发现，聚氨酯的多孔结构易于形成DO梯度，有助于SND反应. 当进水C/N由15依次降到10、 5和1.8时，对应的SND效率分别为55.1%、 52.3%、 43.8%和40.7%. 说明SND在本试验脱氮过程中扮演重要角色. 同时可以发现进水C/N直接影响SND反应. 降低进水有机物浓度，有机物扩散进入兼性环境的速率减慢，不能保证足够用于反硝化的碳源，同时由于低有机物浓度减少了好氧区异养细菌的氧气消耗速率，增强了氧气穿透进入兼性环境的能力，减弱了兼性环境的稳定性，仅少量有机物扩散进入生物膜的缺氧区，无法满足反硝化菌对有机碳源的要求，从而不利于反硝化的进行，这与贾艳萍的试验结果一致^[24]. 高景峰等^[25]对实际生活污水的SND处理表明：随着C/N的升高，好氧总氮去除率逐渐上升，但是当C/N超过8.43(总氮去除率为93.6%)后，总氮去除率提高并不明显. 因此，在SND体系中，需要维持恰当的C/N. 本试验研究中发现亚硝酸氮随着氨氮的氧化逐渐增加，而硝酸氮浓度基本可以忽略. 说明由硝化作用产生的亚硝酸氮可能在原位直接参与反硝化反应.

4 结论

(1)聚氨酯生物膜系统DO控制在0.5~1.5 mg ·L^-1、 温度20℃±1℃、 pH值7.5~8.5和HRT为6~10 h的运行条件下，成功实现了亚硝化过程的启动. 降低进水C/N，有助于亚硝酸氮的累积，进水C/N由15依次降到10、 5和1.8，系统内亚硝酸氮的累积率由56.1%逐次上升到62.3%、 72.3%和83.2%.

(2)系统在进水C/N为10时取得最佳的去除效果，氨氮和总氮的去除率分别为99.1%和91.0%. 聚氨酯生物膜反应器在不同运行阶段均发生了SND反应，随着进水C/N的降低，系统的SND效率也逐渐降低.

(3)生物膜的功能微生物分析表明，在C/N 15时，生物膜的微生物多样性要显著高于其他工况. 生物膜上的优势亚硝酸菌和硝酸菌分别以亚硝化单胞菌(Nitrosospira sp.)和硝化螺旋菌(Nitrospira sp.)为主，而反硝化细菌则以假单胞菌(Pseudomonas sp.)占据优势.

致谢: 感谢哈尔滨商业大学左金龙教授对本工作提供的帮助.