2025, Vol. 46
2. 中国海洋大学三亚海洋研究院，三亚 572000;
3. 寿光市海洋渔业发展中心，寿光 262700
, LI Min1 , LIU Yi-fan1 , ZHENG Hao1,2
, WEI Zi-han1 , WANG Xin-yi1 , HUA Jian1 , MOU Ming-jie3 , LUO Xian-xiang1,2 , LI Feng-min1,2
2. Sanya Oceanographic Institution, Ocean University of China, Sanya 572000, China;
3. Shouguang Marine Fishery Development Center, Shouguang 262700, China
新污染物抗生素抗性基因（antibiotic resistance genes，ARGs）的出现和全球广泛传播已成为“同一健康”框架下优先关注的环境和健康问题[1]. 随着有机农业的快速发展，畜禽粪便等有机肥的大量施用使得农业土壤成为ARGs污染和传播的热点区域[2，3]. 农业土壤中ARGs可通过根际或叶际转移到植物不同组织，加剧ARGs通过食物链向人体传播的风险[4~6]. 因此，明确有机肥施用下植物ARGs的赋存特征及其响应规律，对于准确评估有机农业生态系统中ARGs环境风险并建立有效阻控措施至关重要.
目前，对有机施肥作物，尤其是可生食蔬菜中ARGs污染的赋存特征和健康风险的研究仍十分有限. 部分研究初步证实了有机肥种植方式下植物ARGs的污染程度显著增加[7，8]. 然而，目前的研究大多关注了叶菜类作物，仅少数研究报道了胡萝卜（Daucus carota L.）和樱桃萝卜（Raphanus sativus L.）等根茎类蔬菜ARGs的污染水平，且研究结果并不一致. 例如，Mei等[8]研究发现猪粪施用增加了胡萝卜可食用部位内生细菌中ARGs的绝对丰度. 然而，Zhang等[9]研究发现施用家禽粪肥和牛粪显著增加了樱桃萝卜叶际和根际细菌中ARGs的丰度，但对其内生细菌中ARGs丰度无显著影响. 此外，有机肥施加下不同类型植物的ARGs赋存特征也存在显著差异，如与香菜（Coriandrum sativum L.）和菊苣（Cichorium endivia L.）相比，生菜（Lactuca sativa L.）和白菜（Brassica chinensis L.）叶内生细菌中的ARGs丰度更高[10]. 不同植物中ARGs种类和丰度的差异主要取决于土壤和植物微生物群落，这是决定ARGs从土壤到植物的传播的重要因素[1，10]. Wang等[11]发现生菜和菊苣（Cichorium intybus L.）根系内生细菌群落与其根际土壤细菌群落组成高度重叠，且植物细菌群落主要由变形菌门（Pseudomonadota）、放线菌门（Actinobacteriota）、拟杆菌门（Bacteroidetes）和厚壁菌门（Firmicutes）构成，以上细菌与ARGs密切相关. 这可能是植物通过选择性招募土壤细菌，改变植物抗生素抗性组的组成导致的[10]. 此外，以上被植物招募的细菌还可以通过可移动遗传元件（mobile genetic elements，MGEs）介导的水平基因转移（horizontal gene transfer，HGT）增加ARGs从土壤细菌向植物内生细菌转移的风险[4]. 综上，施用有机肥是否会增加根茎类蔬菜的ARGs富集风险尚不确定，其对人体摄入的潜在风险也仍需进一步研究.
基于此，本研究以青萝卜（Raphanus sativus L.）和香菜（Coriandrum sativum L.）为代表，采用实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）技术研究了传统种植和有机种植模式下蔬菜表面和内生细菌中ARGs和MGEs丰度，利用16S rRNA扩增子测序分析了两种种植模式下不同作物表面细菌群落和内生细菌群落结构上的差异，并通过网络分析揭示了ARGs和细菌群落之间的共现模式，识别了ARGs和MGEs的潜在宿主菌，最后评估了不同种植方式蔬菜ARGs的膳食暴露风险. 本研究结果通过填补有关施用有机肥对蔬菜ARGs膳食暴露风险影响的知识空白，以期为减少ARGs通过食物链传播的风险提供科学依据，更好地推动有机农业的健康持续发展.
1 材料与方法 1.1 样品采集青萝卜和香菜购买于青岛市大型农贸市场，样品分别来自6个不同的生产商，包括3个传统生产商（青萝卜CR、香菜CC）和3个有机生产商（青萝卜OR、香菜OC）. 所有的有机蔬菜生产商均具有国家有机农业认证，生产过程依据国家有机食品标准GB/T 19630.1-2011执行. 于2023年4月共采集了样本18份蔬菜样品. 采样过程中，随机抽取了3份包装好的产品，存放于密封袋中，干冰低温24 h内送达实验室后用于后续DNA提取.
1.2 DNA提取和目标基因的检测和定量蔬菜表面细菌和内生细菌DNA的提取均采用吸附柱法[7]. 蔬菜表面细菌的提取步骤如下，取15 g青萝卜表皮或香菜叶片，剪碎后分别浸泡于150 mL 0.01 mol·L-1的无菌磷酸盐缓冲溶液中，超声10 min，然后在室温下以180 r·min-1振荡2 h，使蔬菜表面细菌充分洗脱在PBS溶液中. 随后用灭菌纱布过滤出蔬菜组织，滤液过0.22 μm滤膜后，截留蔬菜表面细菌用于后续DNA的提取. 青萝卜去除表皮后，取内部组织0.20 g按照Mei等[8]方法进行内生细菌DNA提取. 取0.2 g经30% H2O2溶液消毒及无菌超纯水冲洗后的香菜叶片进行香菜内生细菌DNA的提取. 使用FastDNA® SPIN试剂盒（MP Biomedical，美国）进行蔬菜表面和内生细菌DNA的提取，并通过超微量分光光度计（Colibri，Titertek-Berthold，德国）检测提取的DNA的纯度和浓度. 本研究选取土壤中常见的四环素类（tetG和tetM）、磺胺类（sul1和sul2）、β-内酰胺类（blaTEM和blaL1）、氨基糖苷类（aadA和aadA5）和多耐药类（floR和qacH-01）基因为目标ARGs[12~14]，其中aadA为二级风险的ARG，tetM和floR为一级风险ARGs[15]. 同时，选择3种代表性的MGEs（intI1、Tn916/1545和tnpA-02）评估ARGs通过HGT传播扩散的潜力[11]. 采用qPCR仪（StepOnePlus，ABI，美国）定量目标基因的丰度[16]. 同时，测定16S rRNA基因拷贝数[13]，利用绝对丰度计算得到ARGs和MGEs的相对丰度[16].
1.3 16S rRNA基因扩增子测序利用Illumina NovaSeq 6000测序平台（PE250）进行16S rRNA高通量测序蔬菜样品中的细菌群落. 选用细菌通用引物515F（GTGCCAGCMGCCGCGGTAA）和907R（CCGTCAATTCCTTTGAGTTT）扩增16S rRNA基因的V4-V5可变区[17]. 测序得到的原始序列采用QIIME2平台的DADA2方法对序列进行质控、去噪和聚类，获得扩增子序列变体（amplicon sequence variants，ASVs）. 最终通过与SILVA数据库进行比对，使用RDP注释软件对物种进行注释，获得不同分类水平下的物种丰度信息.
1.4 青萝卜和香菜ARGs膳食暴露风险评估方法不同人群每日食用青萝卜和香菜的ARGs摄入量（estimated daily intake of ARGs，EDIARGs）使用方程（1）估算[8，18]：成人和儿童的蔬菜日摄入量分别约为276 g和228 g[19].
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式中，GCN（gene copy number）表示蔬菜内生细菌中ARGs的基因拷贝数（copies·g-1）；Wintake表示不同人群每日蔬菜摄入量（g）；R表示摄入的根茎类或叶菜类蔬菜占总蔬菜摄入量的比例（%），其中根茎类蔬菜和叶菜类蔬菜的比例分别为23%和34%[20].
1.5 数据处理与分析利用Microsoft Excel 365、R（v4.3.2）和Origin 2023进行数据的整理和可视化分析. 采用IBM SPSS 26.0软件进行单因素方差分析和独立样本t检验，P < 0.05被认为数据间具有显著性差异. 使用QIIME 1.9.1计算样品的Chao1和Simpson多样性指数，利用R语言Vegan包（v2.5.3）在ASVs水平上进行主坐标分析（principal coordinates analysis，PCoA）以评估不同蔬菜细菌群落组成的差异. 基于Omicsmart云数据分析平台进行PICRUSt2和Tax4Fun基因功能预测，分析植物微生物组的人类疾病相关代谢通路的富集情况. 利用R语言Hmisc包（v5.1-2）计算细菌属、ARGs和MGEs的Spearman相关系数，并使用Gephi软件（v0.9.1）进行可视化分析.
2 结果与讨论 2.1 青萝卜和香菜抗生素抗性基因的赋存特征两种有机种植蔬菜ARGs的检出种类多于传统种植蔬菜（图 1）. 与传统种植蔬菜（CR和CC）相比，有机蔬菜（OR和OC）中均检测到了qacH-01，其中OR中还检测到了tetG. 所有蔬菜表面细菌中检测到的ARGs数量（7~8种）显著高于内生细菌（2~5种）. 这可能归因于宿主的过滤效应[21]. 此外，有机种植蔬菜的ARGs丰度显著高于传统种植蔬菜（图 1）. 有机蔬菜表面细菌中8种ARGs总绝对丰度为7.77×108~8.75×108 copies·g-1，是传统种植蔬菜的6.20~10.4倍[图 1（a）]. OR和OC内生细菌中检出的5种ARGs总绝对丰度分别为3.94×107 copies·g-1和4.08×107 copies·g-1，分别是CR（1.90×107 copies·g-1）和CC（3.01×107 copies·g-1）的2.08倍和1.36倍[图 1（b）]. 这与芦科堃等[22]的研究结果一致，其发现相比传统种植和野生种植，有机种植方式下鱼腥草（Houttuynia cordata）中ARGs的总绝对丰度更高. 与ARGs绝对丰度一致，有机蔬菜中ARGs的相对丰度也显著高于传统蔬菜[图 1（c）和图 1（d）]. 由此可见，与传统种植蔬菜相比，有机种植的蔬菜可能存在更高的ARGs健康风险.
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（a）表面细菌中ARGs的绝对丰度，（b）内生细菌中ARGs的绝对丰度，（c）表面细菌中ARGs的相对丰度，（d）内生细菌中ARGs的相对丰度；*、**和***分别代表P < 0.05、P < 0.01和P < 0.001水平下处理组间存在显著差异 图 1 青萝卜和香菜表面细菌和内生细菌中ARGs的绝对丰度和相对丰度 Fig. 1 Absolute and relative abundance of ARGs in the surface bacteria and endophytic bacteria of the vegetables |
值得注意的是，有机蔬菜（特别是OR）含有的aadA、tetM和floR等高风险ARGs丰度显著高于传统种植蔬菜（图 1）. 例如，有机蔬菜（OR和OC）表面和内生细菌中aadA的相对丰度为1.75×10-3~6.29×10-3和1.27×10-4~1.02×10-3，相比于传统蔬菜（CR和CC），分别显著增加了1.10~51.5倍和1.14~1.58倍. 而OC表面细菌中floR的相对丰度是CC的3.05倍. 更有甚者，OR表面细菌中tetM和floR的相对丰度分别达到了CR表面的126倍和101倍. 以上结果表明，有机种植方式大大增加了蔬菜中ARGs的“移动性”和“人类致病性”，从而提高了ARGs沿食物链传递的风险.
植物微生物组中ARGs的丰度还受蔬菜类型的影响. 相比于香菜，青萝卜更容易富集ARGs（图 1）. 传统种植方式下，CR内生细菌中ARGs总相对丰度达到5.84×10-4，较CC增加了5.10倍. 这可能是由于青萝卜作为一种根茎类蔬菜与土壤直接接触，相对粗糙的表面为细菌定殖创造了有利的附着环境，为其向内生组织中的转移提供了可能[23]. 有机种植方式下，OR表面和内生细菌中的ARGs总相对丰度分别为3.82×10-2和1.28×10-3，分别是OC表面和内生细菌中的12.0倍和3.72倍. 这表明有机种植体系下，相比叶菜类，根茎类蔬菜更容易受到ARGs污染. 这与Zou等[24]的研究的结果不一致，其发现施加猪粪堆肥的土壤中生长的叶菜上海青（Brassica chinensis L.）比胡萝卜茎受到的ARGs污染程度更重. 造成这种ARGs富集差异的原因可能与土壤理化性质及植物生长状况相关[25].
以上结果共同证明有机种植方式能够影响ARGs在植物微生物组中的赋存特征，并且这种影响可能与植物类型有关. 即相较于香菜，有机种植方式对根茎类作物（青萝卜）表面和内生细菌中ARGs丰度的增加效果更为显著. 上述研究表明ARGs在有机蔬菜中的流行率更高，这与人们对有机蔬菜的微生物安全的广泛担忧相一致，强调了加强监测蔬菜ARGs污染程度的必要性，降低有机农业抗生素耐药性潜在风险势在必行.
2.2 青萝卜和香菜中MGEs丰度的变化土壤-植物系统中MGEs介导的HGT已被证明在细菌间ARGs的转移起关键作用[26]，因此本研究量化了intI1、Tn916/1545和tnpA-02的丰度以探究不同种植方式对蔬菜表面和内生细菌中ARGs丰度影响的水平转移潜力. 结果表明，intI1在传统和有机青萝卜和香菜中普遍存在，而Tn916/1545仅在有机种植蔬菜表面检测到，tnpA-02则未被检测到[图 2（a）]. 相比CR和CC，OR和OC表面检测到的MGEs相对丰度更高，达到1.47×10-4~5.60×10-3，是前者的3.03~401倍. 导致这种差异的原因可能是由于有机肥施用直接增加了农业土壤中MGEs的丰度[27]，为其从土壤向作物中的转移提供了可能[4]. 此外，在相同种植条件下，不同植物表面和内生细菌中MGEs的分布也存在较大差异. 例如，OR表面和内生细菌中MGEs（intI1和Tn916/1545）的总相对丰度分别为5.60×10-3和3.57×10-6，分别比OC表面和内生细菌中的相应丰度高出了37.2倍和2.90倍. 这可能是由于青萝卜属于根茎类作物，其表面与土壤或肥料直接接触，携带MGEs的细菌可穿过表皮进入内部组织，因此相比于香菜更容易携带MGEs[8，28].
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（a）蔬菜表面和内生细菌中MGEs的相对丰度，（b）蔬菜表面细菌中ARGs和MGEs的相关性分析，（c）蔬菜内生细菌中ARGs和MGEs的相关性分析；CR-S、OR-S、CC-S和OC-S分别表示CR、OR、CC和OC的表面细菌，CR-E、OR-E、CC-E和OC-E分别表示CR、OR、CC和OC的内生细菌，下同；**和***分别代表P < 0.01和P < 0.001水平下处理组间存在显著差异 图 2 蔬菜表面和内生细菌中MGEs丰度及其与ARGs的相关性分析 Fig. 2 Abundance of MGEs and their correlation with ARGs in vegetable surface and endophytic bacteria |
环境中ARGs丰度的升高往往借助于MGEs介导的HGT过程[26]. 相关性分析进一步探究了有机肥施用下MGEs对蔬菜中ARGs赋存特征的影响. 结果表明，无论是蔬菜表面还是内生细菌，MGEs的总丰度与ARGs总丰度显著正相关（表面细菌：R2=0.994，P < 0.05；内生细菌：R2=0.702，P < 0.05）[图 2（b）和图 2（c）]. 这证实MGEs在驱动植物表面和内生细菌ARGs增加中发挥着重要作用. 有机种植显著增加了植物表面和内生细菌中MGEs的丰度，促进了MGEs介导的HGT，加剧土壤-植物系统ARGs污染[27，29].
2.3 青萝卜和香菜中细菌群落的变化植物微生物组是ARGs的广泛宿主，其在ARGs传播过程中发挥着至关重要的作用[4]. 通过16S rRNA基因扩增子测序获得了85 672条高质量序列，并通过序列校正获得779个序列. α多样性分析发现，有机种植方式下OR表面微生物的Chao1丰富度指数和Simpson多样性指数分别显著提高了16.6%和59.2%[图 3（a）和图 3（b），P < 0.05]. 这可能是由于有机肥中丰富的有机碳和营养元素为土壤细菌提供了充足的养分，导致土壤微生物多样性的增加[30]. 但与青萝卜不同，CC和OC表面细菌群落的α多样性无显著差异. 实际上，植物微生物群落组成主要受宿主效应和环境效应的影响，而植物宿主对其内生微生物群落的多样性和组成具有较强的选择作用[31，32]. 在本研究中，相较于传统种植方式，有机种植方式对蔬菜内生微生物多样性未造成显著影响，表明宿主植物对微生物组的影响大于环境因素.
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（a）多样性指数（Chao1），（b）多样性指数（Simpson），（c）蔬菜表面细菌群落PcoA分析，（d）蔬菜内生细菌群落PcoA分析，（e）蔬菜表面细菌种水平Upset图和Venn图，（f）蔬菜内生细菌种水平Upset图和Venn图 图 3 不同种植体系下两种典型蔬菜细菌群落结构的变化 Fig. 3 Profiles of microbial community in the two typical vegetables under different cropping systems |
利用PCoA分析进一步探究了青萝卜和香菜表面和内生细菌群落在门水平上的组成差异[图 3（c）和图 3（d）]. 结果表明，两种种植方式的青萝卜表面细菌群落显著分离，且相比于CC和OC，CR和OR相距较远. Adonis分析证实，有机种植对青萝卜表面微生物组有显著影响（R2=0.755，P=0.028）. 这可能是由于青萝卜比香菜更易受土壤条件的影响[33，34]，导致了不同种植方式下青萝卜表面细菌群落结构的差异显著大于香菜. 然而有机种植方式对蔬菜内生细菌群落的影响并不显著，同一品种的蔬菜（青萝卜及香菜）内生细菌的群落结构均存在重合关系（青萝卜为R2=0.263，P=0.300，香菜为R2=0.285，P=0.200），且不同品种间彼此分离（R2=0.924，P=0.003）. 这与以往的研究结果相似，即植物内生细菌群落结构受宿主及环境相关因素的影响，且相比环境效应，宿主效应的影响程度更大[32，35]. 有机青萝卜和传统青萝卜内生细菌群落的高度重叠，侧面证实宿主对微生物的筛选和富集. 然而二者未完全重叠，进一步证实环境效应对植物内生细菌的驱动效果[27]. 有机种植体系下，外源微生物的直接输入将不可避免地导致土壤-植物系统微生物群落结构的变化，这可能影响蔬菜内生细菌及其ARGs的深度选择.
通过种水平上的Venn和Upset图分析发现，青萝卜和香菜表面细菌种类明显高于内生细菌[图 3（e）和图 3（f）]. 所有蔬菜表面细菌共检出555个细菌种数，而内生细菌仅检出299个种数，这也与Zhu等[7]分析发现生菜表面细菌群落相比其内生细菌群落拥有更高的多样性的结果一致. 另外，OC表面细菌种数和特有种数最多，明显高于CC，而OR表面细菌种数和特有种数也明显高于CR. 这也进一步证实了有机种植方式可增加蔬菜表面细菌多样性. 此外，OR内生细菌种数和特有种数明显高于CR，但CC和OC内生细菌种数和特有种数却没有明显差异. 这也意味着香菜内生细菌群落组装过程受到自身的宿主特异性影响更大[31]. 基于上述结果，进一步分析了青萝卜和香菜相关微生物在门和属水平的物种组成差异（图 4）. 结果证实两种蔬菜表面和内生细菌均以蓝细菌（Cyanobacteria）、变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteriota）、拟杆菌门（Bacteroidota）以及厚壁菌门（Firmicutes）为主[图 4（a）]. 然而，尽管有机种植方式没有改变青萝卜和香菜门水平下的优势群落组成，但是却影响了以上细菌的丰富度. 与传统种植相比，有机种植显著增加了青萝卜及香菜表面和内生细菌中放线菌门、拟杆菌门和厚壁菌门的丰度，促进程度高达73.2%~359.1%. 这3类细菌门已被多项研究证实为ARGs的潜在宿主菌[36，37]. 值得注意的是，拟杆菌门和厚壁菌门可作为有机肥处理下的主要驱动菌群，尤其厚壁菌门，已被报道可作为过量施肥的标志性微生物[38]. 本研究中，有机种植方式下，土壤-植物系统中ARGs潜在宿主菌的丰度显著增加，促进了ARGs在根表及叶际的定殖及其向植物中的迁移，这可能是导致有机蔬菜表面细菌及内生细菌中ARGs丰度增加的重要原因.
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（a）门水平群落组成，（b）门水平指示物种分析，（c）属水平群落组成，（d）致病性功能预测；1表示CR-S，2表示OR-S，3表示CC-S，4表示OC-S，5表示CR-E，6表示OR-E，7表示CC-E，8表示OC-E；d1表示传染病，d2表示癌症，d3表示神经退行性疾病，d4表示内分泌和代谢疾病，d5表示免疫疾病，d6表示药物依赖，d7表示心血管疾病；在（c）和（d）中，红色表示丰度高，蓝色表示丰度低；MM和ANPR分别表示Methylobacterium Methylorubrum和Allorhizobium-Neorhizobium-Pararhizobium-Rhizobium 图 4 不同种植体系下两种典型蔬菜细菌群落组成和致病性功能预测 Fig. 4 Bacterial community composition and pathogenic function of two typical vegetables under different cropping systems |
不同蔬菜细菌群落组成在属水平上也存在显著差异[图 4（c）]. 诺卡迪奥德斯菌（Nocardioides）和马西利亚菌（Massilia）分别是CR表面和内生细菌的优势菌属，而微小嗜冷菌（Exiguobacterium）和拟关节芽孢杆菌（Paenarthrobacter）是OR表面和内生细菌的优势菌属. 其中，拟关节芽孢杆菌已被研究证实对于磺胺类抗生素具有良好的降解能力[39]. CC表面和内生细菌普遍检测到的优势属均属于变形菌门，包括长单胞菌（Sphingomonas）、甲基杆菌（Methylobacterium Methylorubru，MM）、异根瘤菌（Allorhizobium-Neorhizobium-Pararhizobium-Rhizobium，ANPR）和短波单胞菌（Brevundimonas）. 区别于CC，OC表面和内部的优势菌属分别是马西利亚菌（Massilia）和诺卡迪奥德斯菌（Nocardioides），分别属于变形菌门和放线菌门.
进一步利用Tax4Fun分析软件预测了有机种植方式对青萝卜和香菜中致病性功能微生物群落的影响[图 4（d）]. 相比于传统种植，有机种植方式下青萝卜和香菜的表面和内生细菌中与疾病相关功能基因丰度有一定程度地增加. 相比于CR，OR表面和内生细菌中的传染病、神经退行性疾病以及心血管疾病的基因功能显著富集. 值得注意的是，CC表面内分泌和代谢疾病基因功能丰度显著富集. 不同于蔬菜表面细菌，蔬菜内生细菌中与疾病相关的基因功能丰度富集程度并不明显. 这主要是因为内生细菌可以增强寄主植物对环境胁迫的抗性[40]. 这进一步证实了种植方式在调节微生物群落组成中起着重要作用. 可见，未来的研究需要更深入地研究有机种植方式对蔬菜微生物群落及其功能的影响，并基于以上结果制定相应的农业实践和管理策略，以确保蔬菜的安全性和健康价值.
2.4 青萝卜和香菜潜在耐药宿主菌分析为进一步探究细菌群落对ARGs在植物中传播的驱动作用，利用普氏分析法对优势细菌属与ARGs进行可视化分析. 传统种植方式下，不同蔬菜样品中ARGs的丰度与细菌群落具有良好的一致性[图 5（a），M2=0.564，P < 0.01]. 这表明细菌群落结构是影响传统种植蔬菜中ARGs赋存的重要因素. 与传统种植蔬菜相比，有机种植蔬菜中ARGs的分布与细菌群落结构之间的相关性更强[图 5（b），M2=0.423，P < 0.01]. 这表明有机种植方式下，细菌群落驱动ARGs在植物表面和内部分布的作用可能更显著.
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（a）传统种植蔬菜表面和内生细菌中ARGs和细菌属的PcoA分析，（b）有机种植蔬菜表面和内生细菌中ARGs和细菌属的PcoA分析，（c）传统种植蔬菜表面和内生细菌中ARGs和MGEs的潜在宿主菌分析，（d）有机种植蔬菜表面和内生细菌中ARGs和MGEs的潜在宿主菌分析；（a）和（b）中两条黑色实线为三维的数据投影到二维空间中的两条正交轴 图 5 不同种植方式下蔬菜表面及内生细菌ARGs的潜在宿主菌分析 Fig. 5 Potential host bacteria analysis of ARGs in surface and endophytic bacteria of vegetables under different planting methods |
利用共现网络分析方法，进一步探究了两种种植方式下ARGs、MGEs和细菌之间的关系，分析中包括相对丰度高于0.1%的属、8个ARGs以及两个MGEs [图 5（c）和图 5（d）]. 结果表明，在传统种植方式下，ARGs、MGEs和细菌属之间呈现出相对松散的网络结构，包含35个节点和40条边. 相比之下，在有机种植方式下，尽管节点数（40）没有明显增加，但网络结构更为复杂，达到284条边. 这表明在有机种植方式下ARG和细菌宿主之间可能存在更紧密的供体-宿主关系，这与Wang等[41]在传统农业与有机农业土壤抗性对比研究中的结果一致. 这也进一步证实了细菌群落结构对不同植物ARGs赋存特征的影响. 具体而言，传统和有机种植蔬菜的ARGs宿主菌分别有27和30个属，来自放线菌门、变形菌门、拟杆菌门和厚壁菌门这4个细菌门[图 5（c）]. 传统种植蔬菜，放线菌门的Rhodococcus和Salana被认为是2种ARGs（aadA5和floR）和intI1共有的潜在宿主菌. 其中，Rhodococcus作为一种与呼吸道和非呼吸道感染、动物和人类疾病相关的病原体，已被证明与多种ARGs具有强相关关系[6]. 因此，在传统种植方式下，Rhodococcus和Salana可能会通过MGEs介导的HGT作用增加ARGs在植物组织中的存在风险. 相比之下，有机种植方式下共有14个细菌属与高风险ARGs（aadA、tetM、floR）均存在显著相关性[图 5（d），P < 0.05]. 值得注意的是，Devosia和Staphylococcus被识别为OR和OC相关细菌群落中检出的8种ARGs和2种MGEs的共同潜在宿主菌. 另外，Devosia已被报道在粪肥施用的土壤中显著富集，在土壤细菌中的占比高达8.50%[42]. 因此，在有机种植系统中，携带较多的ARGs的Devosia可随着粪肥施用的过程从土壤传播至作物体内. 另外，Staphylococcus作为一种能够逃避抗生素杀菌作用的ESKAPE病原菌，具有一系列致病机制，能够在宿主和环境中存活，并增强ARGs在环境中的传播[43]. 食用以上含有病原菌的蔬菜作物，可能会增加消费者感染的可能性. 总体而言，两种种植方式蔬菜的潜在耐药宿主菌均主要来自于放线菌门，其中有机种植蔬菜中检测到更多的ARGs潜在宿主菌和病原菌，这也导致了有机蔬菜中ARGs（特别是高风险ARGs）污染更重. 因此，未来需要适当优化农业实践，以最大限度地减少ARGs从有机肥料到农业土壤、食品的传播，并最终传播到消费者.
2.5 青萝卜和香菜ARGs膳食暴露风险评估为进一步评估有机蔬菜中ARGs的食用风险，采用暴露评估方法[8]，以植物内生细菌为研究对象，估算了成人和儿童每日食用根茎类蔬菜（如青萝卜）和叶菜类蔬菜（如香菜）时摄入的ARGs量. 结果表明，成人和儿童每日食用蔬菜获得的ARGs摄入量分别为1.20×109~3.83×109 copies和9.95×108~3.16×109 copies. 这远高于以往研究报道的关于食用猪粪施用土壤中生长的胡萝卜的每日ARGs暴露剂量（107~108 copies）[8]，这可能与实际种植条件有关. 此外食用有机蔬菜可能会导致更高的ARGs暴露剂量（图 6）. 与CR相比，成人和儿童食用OR导致的ARGs摄入量分别高达2.50×109 copies和2.07×109 copies，暴露风险增加了1.08倍. 此外，尽管在不同种植方式下，成人和儿童食用香菜所导致的ARGs摄入风险没有显著差异，但食用OC导致的ARGs摄入量呈现增加的趋势. 因此，可以推断，食用有机蔬菜可能会增加人体抗生素耐药性的风险.
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*和**分别表示P < 0.05和P < 0.01水平下处理组间存在显著差异 图 6 不同人群食用典型蔬菜的ARGs日摄入量 Fig. 6 Estimated daily intake of ARGs by eating the typical vegetables among different groups of people |
除了种植条件，食用青萝卜和香菜导致的人体ARGs暴露剂量也并不相同. 在传统种植方式下，成人和儿童食用香菜导致的ARGs暴露剂量均显著高于青萝卜（图 6），这表明食用叶菜类蔬菜可能比根茎类蔬菜含有更高的ARGs膳食暴露风险. 值得注意的是，有机种植方式下，人体摄入青萝卜和香菜所导致的ARGs摄入量没有显著差异，这与OR和OC内生细菌中ARGs的绝对丰度以及这两种蔬菜在饮食中所占的消费比例不同有关. 总体而言，通过食用有机蔬菜，特别是可生食有机蔬菜导致的ARGs摄入风险应该慎重考虑，清洗及加热等操作或可有效减少食源性ARGs的丰度和人体暴露风险[6]. 此外，在后续的研究中，应结合实际情况，进一步探究清洗和削皮等过程对有机蔬菜表面细菌和内生细菌中ARGs丰度的影响，更准确地评估ARGs的膳食暴露风险.
3 结论（1）与传统种植方式相比，有机种植方式显著提升了两种蔬菜内生细菌中ARGs的丰度，且与香菜相比，青萝卜中ARGs的富集程度更高.
（2）与ARGs相似，有机种植的两种蔬菜内生细菌中MGEs的相对丰度显著高于传统种植的蔬菜，且MGEs的丰度与ARGs的丰度显著正相关，表明有机种植方式通过促进HGT过程增加了ARGs在青萝卜和香菜内生微生物组中的富集.
（3）网络分析显示有机种植方式下ARGs与细菌间的相互作用更复杂，富集了潜在宿主菌的30个细菌属，其中14个细菌属（如Microbacterium、Aeromicrobium、Glutamicibacter）与高风险ARGs（aadA、tetM、floR）显著相关.
（4）相比传统种植蔬菜，食用有机蔬菜会增加人体的ARGs膳食暴露风险，且相同种植条件下叶菜类蔬菜的ARGs暴露风险比根茎类蔬菜更高.
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