2025, Vol. 46
抗生素被广泛用于预防由细菌感染引起的人类疾病以及促进养殖场畜禽的生长[1 ~ 3], 但随着抗生素的大量使用, 其在环境中的残留水平逐渐升高, 对细菌形成了选择压力, 进而促进了抗生素抗性菌（antibiotic resistant bacteria, ARB）和抗生素抗性基因（antibiotic resistance genes, ARGs）的产生[4 ~ 6], 同时, ARGs还可以通过水平转移等途径在不同细菌间传播, 引起的生态风险可能比抗生素更大[7]. ARB和ARGs作为新兴污染物, 在自然界中的持久存在对人类健康和生态环境造成了严重威胁, 已经成为一个重要的全球公共卫生问题[8, 9].
已有研究表明, 传统的污水处理工艺并不能有效去除ARB和ARGs[10 ~ 13]. 高级氧化技术（AOPs）可以原位产生各种活性氧（ROS）, 被广泛应用于污水中新兴污染物的控制[14 ~ 16]. 其中, 非均相金属基催化剂活化过一硫酸盐（PMS）技术就受到了广泛关注, 该系统可以通过产生羟基自由基（·OH）、硫酸根自由基（·SO4-）、超氧自由基（·O2-）和非自由基物种等各种活性氧（ROS）有效去除污水中的ARB和ARGs[17, 18]. 但是这项技术也面临氧化剂投加量过高、金属离子浸出、催化剂稳定性差等问题[19]. 研发绿色且高效稳定的PMS过渡金属催化剂是这一研究方向的核心[20, 21].
铁酸铜（CF）是一双金属尖晶石氧化物, 由于其具有化学和热稳定性, 显著的催化活性, 且易磁分离, 近年来被认为是一种很有潜力的非均相光催化剂[22 ~ 25]. 铜离子的引入有助于电荷重新分配, 从而产生利于电子转移的环境；同时, 由于Cu2+/Cu+和Fe3+/Fe2+的氧化还原循环, CF具有显著的活化PMS的能力[26, 27]. 在合成过渡金属氧化物作为催化剂的基础上, 有研究引入了不同的含碳或含氮材料来进一步提高材料的催化活性与稳定性. 例如, 同时含有过渡金属和氮配位位点的催化剂具有高原子利用率, 且能够活化过硫酸盐产生非自由基物种如单线态氧（1O2）和高价金属氧物种[28, 29]. g-C3N4（CN）因其具有优异的电子转移性质和物理化学性质, 常被用作金属原子和N原子键合的载体[30, 31]. 石墨烯（rGO）是一种二维碳材料, 具有高电导率、出色的电子跃迁率和高比表面积等, 可以高效地进行光吸收从而充当电子转移的介质, 同时其碳原子之间通过稳定的σ键连接, 形成了坚固的二维晶格, 因此还具有较高的稳定性[32, 33]. 引入石墨烯可以提升过渡金属催化剂的催化活性, 同时减少金属离子浸出, 避免二次污染[20 ~ 22].
本文制备了还原性氧化石墨烯包覆氮化碳掺杂铁酸铜材料（rGO-CNCF）, 以磺胺类抗性菌（SA-ARB）及其携带磺胺类抗性基因（SA-ARGs）为研究对象, 考察Vis-rGO-CNCF/PMS高级氧化体系对于SA-ARB灭活和SA-ARGs去除的性能及其影响因素, 探讨灭菌处理对胞内和胞外SA-ARGs去除以及水平转移的影响, 进一步考察Vis-rGO-CNCF/PMS对SMT和SA-ARB复合污染的同步去除阻控性能, 以期为控制污水中的ARB及ARGs污染提供思路与方法.
1 材料与方法 1.1 试剂与仪器过一硫酸盐购自Sigma-Aldrich公司, 磺胺二甲基嘧啶、硝酸铁硝酸铜、双氰胺、腐植酸、对苯醌、色氨酸、叔丁醇、乙醇、康淳、DMPO和TEMP购自阿拉丁生化科技股份有限公司, 硝酸、盐酸、硫酸、氯化钠、硝酸钠、碳酸氢钠、碘化钾和磷酸氢二钠购自国药集团. 所有化学品均为分析纯, 实验用水均为去离子水.
1.2 材料的制备称取3.02 g Cu（NO3）2·3H2O和10.1 g Fe（NO3）3·9H2O于烧杯中, 使Cu2+和Fe3+的比例为1∶2, 加入一定量去离子水搅拌溶解, 超声30 min至溶液均匀. 将装有混合液的烧杯转移至电热恒温水浴锅中, 温度达到90℃以后, 逐滴加入5 mmol·L-1 NaOH调节溶液pH为11, 随后持续搅拌2 h. 溶液冷却到室温之后, 使用抽滤法得到沉淀物, 并使用去离子水清洗3~5次, 转移至带盖的半封闭坩锅中, 70℃条件下烘12 h. 而后以固定比例（氮化碳和铁酸铜的质量比为2∶1）添加二氰二氨至半封闭坩埚, 继续烘干12 h. 烘干后将坩埚置于马弗炉中, 在真空条件下以5℃·min-1的升温速率升温至550℃并维持4 h, 得到氮化碳掺杂铁酸铜材料（CNCF）. 向石墨烯样品中加入抗坏血酸使两者质量比为6∶1, 加热到95℃后恒温搅拌1 h, 使用去离子水清洗3~5次, 冷冻干燥40 h, 得到还原性石墨烯样品, 后简称石墨烯（rGO）. 使用玛瑙研钵将氮化碳掺杂铁酸铜材料磨成粉状, 按照一定比例掺杂还原性石墨烯, 并转移至冷冻干燥箱, 在真空冷冻条件下干燥24 h, 得到本实验所需系列催化剂, 称为石墨烯包覆氮化碳掺杂铁酸铜（rGO-CNCF）.
1.3 材料的表征采用扫描电子显微镜耦合X射线能谱仪（SEM-EDS）观察样品表面形貌特征和元素分布情况；X射线粉末衍射仪（XRD）分析样品晶型结构；傅里叶红外光谱仪（FTIR）分析样品表面的特征官能团；X射线光电子能谱仪（XPS）分析样品表面元素化学形态及含量变化；透射电子显微镜（TEM）和高清透射电子显微镜（HRTEM）分析样品的形貌和晶格特征；并采用紫外-可见漫反射光谱（DRS）分析样品的光响应能力.
1.4 实验方法 1.4.1 制备反应所需菌液本实验使用的磺胺抗性菌是搭载有质粒Bio-133913的大肠杆菌E.coli DH5α, 菌液与甘油混合保存在-80℃冰箱中. 将甘油菌冻存管轻微解冻后, 将抗性菌接种到LB固体培养基上, 每次接2 ~ 3个平板, 上述平板在37℃条件下过夜培养18 h. 在1 000 mL锥形瓶中, 配制700 mL含有10 mg·L-1 SMT的LB液体培养基, 并使用高压蒸汽灭菌锅灭菌. 待平板上长出单菌落后, 从平板上挑取单菌落放入锥形瓶中, 在恒温摇床中以37℃和180 r·min-1的条件下培养18 h, 得到ARB母液, 置于4℃冰箱保存. 从母液中吸取0.3mL菌液, 加入到配置好的30mL LB培养基中培养. 菌种培养完成后, 通过离心将基质换为PBS缓冲溶液. 储备菌液准备完成后置于4℃冰箱保存.
1.4.2 细菌生长曲线绘制用储备菌液作为接种源, 以1∶100的体积比精确接种进13个液体培养基, 分别在培养0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12 h后使用紫外分光光度计测定D600值.
1.4.3 灭菌实验使用储备菌液作为反应溶液, 向其中加入材料和PMS, 反应0、2、5、10和30 min后取0.5 mL样品加入4.5 mL样品保存液（含50 mmol·L-1硫代硫酸钠和10 mg·L-1的SMT）, 用以终止反应. 将样品稀释至102、103、104、105和106倍, 分别取0.25 mL接种至营养琼脂选择培养基上, 培养18 h后计数.
1.4.4 细胞形貌分析在初始时刻和10 min、30 min时刻, 取3 mL菌液样品, 在4℃冷冻高速离心机中以800 r·min-1转速离心15 min, 弃去上清液后加入1 mL浓度为2.5%的戊二醛, 充分涡旋振荡, 在4℃冰箱中过夜固定. 随后使用磷酸缓冲液漂洗、锇酸固定和无水乙醇梯度脱水, 完成后将样品于临界点干燥. 喷金后进行生物电镜形貌观察.
1.4.5 钾离子泄漏实验使用无菌NaCl溶液作为漂洗液, 反应过程中在一定时间点取出2 mL菌液, 使用0.22 μm滤膜进行过滤, 随后向滤液中加入1 mL 70%浓度的硝酸, 于115℃条件下消解1 h. 等待自然冷却至室温后, 采用0.22 μm针孔过滤器进行过滤, 使用ICP-OES进行浓度测定.
1.4.6 水平转移实验为了测试灭菌前后抗性基因的水平转移能力的变化情况, 选择具有利福平抗性的大肠杆菌C600作为水平转移受体菌进行水平转移实验. 首先将大肠杆菌C600置于37℃恒温箱中培养18 h, 后转移到LB液体培养基中以温度37℃、转速180 r·min-1的条件恒温振荡培养14 h, 得到大肠杆菌C600菌液. 菌液使用超高速冷冻离心机离心, 替换基底液为PBS溶液, 得到初始受体菌菌液. 分别取0.5 mL灭菌反应前后的SA-ARB菌液, 1 mL大肠杆菌C600菌液, 接种至LB液体培养基中, 在恒温37℃和转速180 r·min-1的条件在培养14 h. 而后分别使用含有10 mg·L-1利福平的选择性培养基P1、同时含有10 mg·L-1利福平及10 mg·L-1磺胺二甲基嘧啶的选择性培养基P2进行平板计数. 即P1为受体菌总数量, P2为接合子总数量, 接合转移频率为两者之商（P2/P1）.
1.4.7 胞内及胞外抗性基因提取测试胞内DNA的提取采用离心法, 将菌液在转速7 000 r·min-1条件下离心5 min, 取沉淀物使用Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒完成DNA提取. 对于胞外DNA, 取上清液过0.22 μm滤膜, 去除细胞和残留物质后的滤出液采用酒精沉淀法进行游离态DNA的收集. 将0.4 mL滤出液加入到-20℃预冷的0.88 mL无水乙醇中, 加入0.04 mL的3 mol·L-1乙酸钠溶液, 混合溶液置于-20℃冰箱冷藏过夜, 次日将混合液以10 000 r·min-1转速离心10 min, 收集到的沉淀物使用Ezip柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒完成DNA提取.
2 结果与讨论 2.1 材料表征使用XRD分析了复合材料的晶体结构, 谱图结果如图 1（a）所示. 复合材料的XRD谱图中显示出了多个特征峰, 分别位于17.70˚、29.91˚、32.53˚、32.82˚、35.86˚、57.82˚和59.60˚. 与JCPDS卡片（JCPDS 34-0425、JCPDS 44-0558和JCPDS 50-1250）相对照, 以上特征峰分别对应于3种物质的不同晶面. 其中29.91˚、35.86˚和57.82˚对应于CF的标准卡片JCPDS 34-0425, 晶面为（1 1 2）, （2 1 1）和（3 2 1）. 32.53˚和59.60˚对应于CN的标准卡片JCPDS 50-1250, 晶面为（2 0 0）和（3 1 0）. 17.70˚和32.82˚对应于rGO的标准卡片JCPDS 44-0558, 晶面为（2 2 0）和（5 1 1）. 以上结果表明, 铁酸铜和氮化碳成功合成, 石墨烯成功负载于复合材料中, 证明了复合催化剂的成功合成.
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（a）rGO-CNCF的XRD谱图和rGO、CN和CF的标准卡片；（b）GO-CNCF、CF、CN和rGO的FTIR谱图 图 1 复合材料的XRD和FTIR分析结果 Fig. 1 XRD and FTIR analysis results of composites |
图 1（b）展示了3种单体材料（CF、CN和rGO）和复合材料的FTIR测试结果. 从中可知, 每种材料都表现出了不同的吸收峰. 在复合材料rGO-CNCF的测试结果中, 出现了4个区域的特征吸收峰, 位于520~690 cm-1处的峰对应于铜-氧伸缩振动和O—Cu—O不对称振动, 以及铁氧体四面体FeO6中的Fe—O伸缩振动；位于892、1 000~1 700和3 400~3 500 cm-1的峰对应s-三嗪环、芳香族C—N杂环的拉伸以及仲胺或伯胺的拉伸振动. 3 180 cm-1宽峰对应于N—H伸缩振动. 虽然复合材料的吸收峰与纯的物质测试结果相比较缓, 但仍可观察到相似的吸收特征. 所以从FTIR结果可以看出, 复合材料包含了铁酸铜、氮化碳和石墨烯这3种物质, XRD和FTIR结果综合说明了复合材料的成功合成[26, 34].
使用SEM-EDS方法对系列材料的表面进行了扫描. 图 2展示了铁酸铜材料的SEM-EDS扫描结果, 可以看出铁酸铜晶体呈现表面光滑的球状, 且颗粒之间紧密地结合在一起, 铁元素和铜元素均匀分布于材料中. 图 3（a）~3（c）展示了氮化碳的表面形貌和元素分布情况, 可以看出氮化碳材料是褶皱粗糙的片状, 这种形貌在比表面积上具有较大的优势, 可用于吸附和分离分子、催化反应等方面, 且氮元素和碳元素均匀分布在材料表面. 图 3（d）~（f）展示了石墨烯的SEM-EDS图像, 从中可以看出, 石墨烯呈现出不规则的丝绸褶皱状, 碳元素和氧元素均匀分布在材料的表面. 该种简单卷曲型的石墨烯具有一些不规则的皱褶或卷曲结构. 以上皱褶或卷曲结构通常是由于纳米结构和孔洞的形成导致的. 这种卷曲结构的石墨烯更容易与其他材料形成复合材料, 包覆于其他材料的表面. 图 3（g）~3（l）展示了复合催化材料rGO-CNCF的SEM-EDS图像. 从中可以看出, 复合材料的表面是粗糙的、不平整的和不规律的. 从元素分布上分析, Fe、Cu、C和N在材料表面上的分布是较为均匀的, 证明氮化碳均匀的掺杂于铁酸铜基底中, 石墨烯均匀的包覆于材料的表面, 且分布均匀.
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（a）铁酸铜的SEM图像；（b）~（d）铁酸铜的EDS图像 图 2 铁酸铜的SEM-EDS图像 Fig. 2 SEM-EDS images of CF |
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（a）CN的SEM图像；（b）~（c）CN的EDS图像；（d）rGO的SEM图像；（e）~（f）rGO的EDS图像；（g）rGO-CNCF的SEM图像；（h）~（l）rGO-CNCF的EDS图像 图 3 CN、rGO和rGO-CNCF的SEM-EDS图像 Fig. 3 SEM-EDS images of CN, rGO, and rGO-CNCF |
为了更加精确地确定rGO-CNCF的形貌特征和晶格特征, 对rGO-CNCF材料测试了透射电子显微镜（TEM）和高清透射电子显微镜（HRTEM）. 从图 4（a）~4（c）中可以看出, 外围包覆的石墨烯呈现薄丝绸状, 在不破坏氮化碳掺杂铁酸铜结构的同时实现了较好的包覆, 证明了rGO-CNCF材料的顺利合成. 从高清透射电子显微镜的拍摄结果来看[图 4（d）~4（f）], 铁酸铜材料形成了很清晰的晶格条纹, 图像中显示除了间距为0.292 nm和0.250 nm的晶格条纹, 对应于CuFe2O4的（2 0 0）和（2 1 1）晶面, CN成功掺杂到铜铁氧体结构中, 石墨烯层层叠叠地笼罩在外侧, 形成了很好的层状结构.
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（a）~（c）rGO-CNCF的TEM图像；（d）~（f）rGO-CNCF的HRTEM图像 图 4 rGO-CNC的TEM和HRTEM图像 Fig. 4 TEM and HRTEM images of rGO-CNC |
采用紫外-可见漫反射光谱（DRS）和X射线光电子能谱（VB-XPS）测试了催化剂的光响应能力. 结果如图 5（a）所示, 复合催化剂表现出更广的光响应范围. 对比氮化碳而言, 其光响应能力在可见光范围内（> 400 nm段）具有明显的下降. 而复合材料明显克服了这一缺点, 在可见光的波段也表现出了较好的光响应能力. 带隙通过Kubelka-Munk函数计算得到, g-C3N4、CuFe2O4 和rGO-CNCF的带隙分别为2.53、1.38和2.81 eV[图 5（b）]. 带隙越窄, 产生的光生电子-空穴对复合的概率就越高, 这不利于光催化效率的提高, 而较宽带隙会使材料具有更宽的光响应范围, 从而通过提高电荷载流子转移率来增强光催化性能. 为了进一步验证光生载流子的迁移速度, 对铁酸铜、氮化碳、石墨烯和石墨烯包覆氮化碳掺杂铁酸铜这4种材料分别做了奎斯特阻抗图, 结果如图 5（c）所示. 在EIS奎斯特图中, 电弧越小表示电荷转移电阻越小. 从图 5（c）中可以看出, rGO-CNCF表现出最小的电弧, 这表明复合材料具有比纯的氮化碳、铁酸铜和石墨烯材料更小的圆弧半径, 意味着复合材料的光生载流子迁移速度最大, 最有利于光催化氧化反应的发生.
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（a）CN、CF和rGO-CNCF的DRS图像；（b）CN、CF和rGO-CNCF的带隙计算结果；（c）CN、CF和rGO-CNCF的EIS图像 图 5 CN、CF和rGO-CNCF的DRS、带隙计算和EIS结果 Fig. 5 DRS, the Kubelka-Munk function curve spectra, and EIS Nyquist plots of CN, CF, and rGO-CNCF |
为了探究rGO-CNCF的元素构成和价态分布情况, 采用X射线光电子能谱（XPS）进行测定, 总谱如图 6（a）所示. 从测试结果可以看出, 复合材料包含的元素有碳、氮、氧、铁和铜, 与EDS测试结果保持一致. 在碳元素的谱图中[图 6（b）], 在284.80、286.40、287.99和288.50 eV两处拟合出4个特征峰, 分别对应于石墨相C—C键、C—O基团、含N杂环的sp2杂化碳（N—C=N）和碳氧双键（C=O）[35], 4种成分的比例分别为43.02%、4.36%、52.14%和0.48%. 在氮元素谱图中[图 6（c）], 解卷积后形成了3个特征峰, 分别位于398.10、399.96和403.87 eV. 位于398.10 eV的特征峰归因于与碳原子键合而形成的sp2杂化氮（C—N=C）, 位于399.96 eV的特征峰归因于叔氮（N—C3/C—NH—C）, 位于403.87 eV的特征峰归因于堆积层间π—π*激发[36]. 从图 6（c）中可以直观地看出, 材料中的氮元素分布以sp2杂化氮和叔氮为主, 分别占到了86.74%和10.22%, 而π—π*激发只占3.04%[23]. 在与金属发生键合时, sp2杂化氮的结合能是最低的, 而且在本材料中sp2杂化氮所占比例最高（86.74%）, 表明sp2杂化碳具备与金属键合的最有利条件. 对于Cu 2p的谱图[图 6（d）], 解卷积后形成了6个特征峰, 其中位于931.90 eV的特征峰对应于二价铜, 位于932.50 eV的特征峰对应于一价铜, 比例分别为73.00%和27.00%. 材料中出现了低价态的铜, 证明材料中是有不饱和成分的, 可能存在氧空位和氮空位等特殊的活性位点. 同时, 不饱和态的金属在反应过程中表现出与饱和态金属不同的性质, 比如提高电子转移速度、促进了金属价态之间的转化等[37]. 对于Fe 2p的谱图[图 6（e）], 解卷积后形成了6个特征峰, 其中位于709.61 eV的特征峰对应于二价铁、位于712.75 eV的特征峰对应于三价铁, 比例分别为42.58%和57.42%. 材料中出现了不饱和态的铁（二价铁）, 表明材料中存在不饱和成分, 即氧空位和氮空位等, 可能为催化氧化反应提供了新的反应活性位点和新的反应机制[38 ~ 40].
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图 6 rGO-CNCF的高分辨XPS谱图 Fig. 6 High-resolution XPS of the rGO-CNCF |
图 7为磺胺类抗性菌E.coli DH5α的生长曲线, 可以看出, 在培养的前2 h内, D600值没有明显增加, 表明此时的细菌没有大量繁殖, 处于迟缓期. 而在2~10 h时间段内, 生长曲线有了较为显著地攀升, 表明该时间段处于细菌的生长期, 该阶段物质基础充足, 代谢旺盛且生长速率最快. 在10 h之后生长曲线变化放缓, 表明该阶段进入了稳定期, 此时菌液中的营养物质被消耗殆尽, 细菌数量保持在了较为稳定的水平, 总细菌数达到峰值, D600值为1.377. 结合细菌生长繁殖规律和细菌灭活实验所需, 选取在对数生长期相对后段的时间点（培养8 h）的细菌进行灭活实验.
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图 7 磺胺类抗性菌E.coli DH5α（Bio-133913）生长曲线 Fig. 7 Growth curve of ARB E.coli DH5α(Bio-133913) |
为了探究不同反应条件下磺胺类抗性菌灭活的效果, 在单一PMS、单一rGO-CNCF、单一CF、复合rGO-CNCF/PMS、复合Vis-CF/PMS和复合Vis-rGO-CNCF/PMS这6种工艺条件下进行灭菌实验, 结果如图 8（a）所示. 总体来说, 6种工艺对抗性细的灭活趋势都是先迅速下降而后逐渐平缓. 在体系中只有催化剂CF或rGO-CNCF（0.2 g·L-1）时, 杀菌的效果非常不理想, 只有少部分的细菌被灭活了, 表明材料自身对磺胺类抗性菌几乎没有毒性, 单独使用该材料也无法通过吸附等物理作用实现对ARB的去除, 30 min内细菌数量仅削减了0.19 log. 单独使用氧化剂PMS（0.3 g·L-1）时, 细菌数量得到了一定的削减, 30 min内4.97 log的磺胺类抗性菌被有效灭活. 这表明在没有催化活化的情况下, 单一的PMS具有一定的灭活ARB的能力, 但是不能将该体系中的ARB完全灭活. 当rGO-CNCF和PMS共同作用于灭菌系统时, ARB的去除效率取得了显著提升, 并且30 min后的细菌浓度下降到了2.11 log, 表明催化剂的加入可以对PMS产生一定的活化作用, 提升ARB的灭活率. 在可见光照射下, 催化剂rGO-CNCF（0.2 g·L-1）和氧化剂PMS（0.3 g·L-1）共同作用于杀菌系统时, 该体系10 min内即完成了8.01 log ARB的完全灭活, 表明催化剂对于氧化剂是具有活化效果的, 且可见光的照射可以提高PMS活化的速率, 使得该体系在较短时间内达到了较好的灭菌效果.
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图 8 不同反应体系、材料投加量和PMS投加量对磺胺类抗性菌灭活的影响 Fig. 8 Bacterial inactivation efficiency under different conditions, rGO-CNCF concentration, and PMS concentration |
为了探究最优的催化剂投加量, 设计了梯度实验, 使Vis-rGO-CNCF/PMS杀菌系统中的催化剂浓度分别为0.1、0.2和0.3 g·L-1, 实验结果如图 8（b）所示. 从中可以看出, 3组不同催化剂用量的实验组均有一定的抑菌效果. 催化剂浓度为0.1 g·L-1时, 在30 min内菌液中的细菌数量持续下降, 最终在30 min时仍有超过25%的细菌没有被灭活. 当催化剂浓度从0.1 g·L-1提升至0.2 g·L-1时, 细菌被破坏的速度明显加快, 并且在10 min内就达到了接近100%的灭菌率. 而当催化剂浓度提升至0.3 g·L-1时, 杀菌速度不但没有继续提升, 反而显著下降, 这表明该体系中的催化剂是过量的, 体系中的PMS已经被完全活化, 过量的催化剂可能导致了一定程度上的内耗, 而且体系中催化剂粉末过多对于搅拌来说构成一定的压力, 因此选择催化剂浓度为0.2 g·L-1为最佳的催化剂投加量.
为了探究活化过硫酸盐杀菌体系中PMS的最佳投加量, 设计了梯度实验, 使Vis-rGO-CNCF/PMS杀菌系统中的PMS浓度分别为0.1、0.3和0.5 g·L-1, 图 8（c）为在不同PMS浓度下的大肠杆菌DH5α的灭活情况. 从中可以看出, PMS投加量从0.1 g·L-1增加到0.5 g·L-1, ARB的灭活效率逐渐提高, 在30 min内, PMS浓度为0.1 g·L-1的体系可以杀灭超过90%的细菌. 而当PMS投加量提高到0.3 g·L-1, 在10 min内就可以将体系内的ARB 100%灭活. 当PMS的浓度提高到0.5 g·L-1, ARB全部灭活的时间仅需要5 min. 综合ARB灭活效率和PMS的使用效率, 选取PMS浓度为0.3 g·L-1作为最佳投加量.
2.4 灭活SA-ARB机制分析为了观察Vis-rGO-CNCF/PMS系统灭菌过程中ARB的形貌变化, 采用SEM生物电镜对反应前、反应中和反应后的大肠杆菌DH5α进行了测试. 图 9（a）为反应前的ARB, 该状态下的细菌呈现出完整的细胞结构和正常的形态, 表面圆润光滑、呈现出圆棒状. 图 9（b）为反应进行10 min时大肠杆菌DH5α的状态, 相比于初始状态, 细菌的形态已经发生了变化, 细菌表面开始收缩, 出现褶皱和塌陷[41]. 观察反应30 min后的细胞, 发现ARB的细胞膜已经遭到了严重的破坏, 细胞结构已不完整, 甚至出现了孔洞. 大肠杆菌的细胞膜和细胞壁的主要成分为肽聚糖、脂多糖和磷脂, 该部分层状结构是高级氧化体系中最先攻击的目标物质. 有文献指出, 类芬顿反应中所产生的含氧活性物质可能直接攻击细菌的细胞膜结构[42], 使得细胞膜表面相关蛋白失活, 引发脂质过氧化, 从而使得细胞内容物泄漏, 细胞失去活性, 进一步使得细胞溶解[43].
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（a）0 min；（b）10 min；（c）30 min 图 9 不同时刻Vis-rGO-CNCF/PMS系统中磺胺类抗性菌表面SEM图 Fig. 9 SEM images of SA-ARB in the Vis-rGO-CNCF/PMS system at different times |
有研究表明, 当细菌的细胞膜遭到破坏时, 细胞内和细胞外的溶液会联通, 从而造成细胞内的物质流出到溶液中[44], 其中钾离子是细胞内细胞质的代表成分, 因此测试了反应过程中溶液钾离子浓度的变化, 以此来表征细胞膜的破坏程度和灭菌的效果, 测试结果如图 10（a）所示. 该组实验的条件为催化剂投加量0.2 g·L-1, PMS投加量0.3 g·L-1, 初始pH值为7.0. 在只有催化剂存在的实验组中发现, 随着时间的延长, 没有在溶液中检出K+, 这表明催化剂单独存在时可能无法破坏细胞膜. 只有氧化剂PMS存在的实验组中, 反应进行2 min时即在溶液中检出了钾离子, 证明PMS具有一定的破坏细胞完整结构的能力, 30 min时溶液中ρ（K+）为0.49 mg·L-1, 该结果解释了图 8（a）中单一PMS存在的情况下可以削减一部分ARB的情况. 在PMS和rGO-CNCF催化剂共同作用的系统中, 2 min时溶液中钾离子浓度就已经有了较高检出, 为1.09 mg·L-1, 该结果已经超过了单一PMS作用30 min的成果. 在Vis-rGO-CNCF/PMS系统中, 钾离子溶出速度更快, 且浓度更高, 在30 min时达到了1.42 mg·L-1. 该结果表明, rGO-CNCF催化剂可以活化PMS破坏细胞膜结构, 可见光照射对于PMS的活化具有促进作用, 提高了灭活细菌的效率.
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图 10 不同条件下SA-ARB灭活过程中溶液K+浓度变化曲线和不同淬灭剂对Vis-rGO-CNCF/PMS系统灭活磺胺类抗性菌的影响 Fig. 10 Concentration curve of K+ in the SA-ARB inactivation process under different conditions and effect of different quenchers on the inactivation of SA-ARB by Vis-rGO-CNCF/PMS system |
先前的研究结果表明, Vis-rGO-CNCF/PMS具有灭活磺胺类抗性菌的能力, 为了探究在灭菌过程中的主要活性物质, 采用3种淬灭剂（分别为10 mmol·L-1的无水乙醇EtOH、叔丁醇TBA和色氨酸L-trp）对该体系进行了淬灭实验, 结果如图 10（b）所示. 从中可以看出, 在L-trp存在的情况下, rGO-CNCF/PMS体系对ARB的灭活能力大大下降, 30 min内仅能灭活1.98 log的大肠杆菌DH5α, 灭活率降低至24.4%, 该结果表明体系中的单线态氧1O2是起最主要作用的含氧活性物质, 在灭活细菌过程中具有举足轻重的贡献. 无水乙醇和叔丁醇共存的实验组中, 两条曲线基本保持一致, 表明过程中硫酸根自由基·SO4-的影响可以忽略不计. 相较于参考实验组, 无水乙醇和叔丁醇共存实验组的灭菌速率有了一定的下降, 对照组在10 min可以完成100%的ARB灭活, 而共存组在10 min的灭活率仅为了85.2%, 完全灭活ARB的时间延长至了30 min, 表明体系中的羟基自由基·OH发挥了一定的作用, 但是不是起决定性作用的活性物质. 综上所述, rGO-CNCF/PMS体系中产生的1O2是最重要的灭菌活性物质, 过程中还有部分·OH的产生.
2.5 系统对抗性基因水平转移的阻控前文的研究表明, Vis-rGO-CNCF/PMS系统可以通过破坏抗性菌细胞膜结构从而使得细胞失活. 该过程会造成细胞质结构从胞内流出, 从而可能导致抗性基因随之进入溶液中, 造成ARGs的水平转移. 为了探究流出的抗性基因可能产生的环境影响, 采用携带利福平抗性基因的大肠杆菌C600作为受体菌, 对Vis-rGO-CNCF/PMS系统处理前后的SA-ARB中SA-ARGs的水平转移能力进行评估, 结果如图 11所示. 该组实验的条件为rGO-CNCF投加量0.2 g·L-1, PMS投加量0.3 g·L-1, 初始pH值为7.0. 没有进行灭活处理的原始SA-ARB菌液与大肠杆菌C600共同培养14 h, 而后在含有10 mg·L-1利福平的选择性培养基中进行计数, 得到受体菌的总浓度约为5.61×108 CFU·mL-1. 同时在含有10 mg·L-1利福平和10 mg·L-1磺胺二甲基嘧啶的双重选择培养基中进行计数, 得到SA-ARGs的受体菌（即接合子）的浓度约为4.11×106 CFU·mL-1. 通过计算可以得到, SA-ARGs的水平转移频率为7.32×10-3. 在Vis-rGO-CNCF/PMS系统作用10 min时, 计算得接合转移频率为1.92×10-6, 相较于初始状态已有较大的削减. 当反应时间到达30 min时, 接合子的数量为0, 表明经过Vis-rGO-CNCF/PMS系统30 min的处理, SA-ARGs不再发生水平转移. 出现该结果的原因主要包含两个方面, 首先是被破坏了细胞膜的灭活细菌中的SA-ARGs被体系中的含氧活性物质攻击, 从而使受体菌无法获得完整的SA-ARGs片段；另一方面是少量未被破坏细胞结构的细菌对于胞内的抗性基因片段具有完全包裹作用, 使得SA-ARGs没有流入环境中进而没有发生水平转移[45]. 其他3组实验组具有类似削减ARGs水平转移的趋势, 但是削减程度均较为有限, 相较而言Vis-rGO-CNCF/PMS体系具有最强的削减ARGs水平转移的能力.
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图 11 不同反应条件下ARGs的水平转移频率变化 Fig. 11 Curve of frequency of horizontal transfer under different conditions |
为了进一步探究ARGs水平转移频率降低的原因, 使用qPCR技术对灭活过程中的SA-ARB细胞的胞内抗性基因（i-ARGs）和胞外抗性基因（e-ARGs）的丰度变化进行了测定, 结果如图 12（a）所示. 该组实验的条件为rGO-CNCF投加量为0.2 g·L-1, PMS投加量为0.3 g·L-1, 初始pH值为7.0. 可以看出, 随着时间的推移, 胞内抗性基因浓度逐渐降低, 从9.01×108 copies·mL-1下降到了9.77×107 copies·mL-1. 胞外抗性基因的浓度整体也呈现下降趋势, 且下降速度较快, 10 min内从6.92×107 copies·mL-1下降到了3.14×105 copies·mL-1, 这表明Vis-rGO-CNCF/PMS体系能够有效的去除胞外抗性基因. 然而随着反应的进行, 胞外抗性基因浓度表现出先下降后上升的趋势, 该现象可能是因为抗性菌的细胞结构不断地被破坏, 流入溶液中的ARGs数量随时间增加, 因此残留在胞外的抗性基因数量也随之增加, 该部分i-ARGs转变为了e-ARGs[46].
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图 12 Vis-rGO-CNCF/PMS系统灭活SA-ARB过程中胞内及胞外ARGs绝对丰度和不同反应条件下溶液中游离ARGs的去除情况 Fig. 12 Abundance of i-ARGs and e-ARGs in Vis-rGO-CNCF/PMS system and the removal of ARGs by rGO-CNCF under different conditions |
还测试了Vis-rGO-CNCF/PMS系统对于溶液中游离态的磺胺类抗性基因的破坏能力, 使用携带sul1的质粒bio-133913配置了浓度约为8.22×108 copies·mL-1的游离态ARGs反应溶液, 考察了在不同反应条件下溶液中ARGs的去除情况, 测试结果如图 12（b）所示. 该组实验的条件：rGO-CNCF浓度为0.2 g·L-1, PMS浓度为0.3 g·L-1, 初始pH值为7.0. 从中以看出, 单一催化剂存在时对SA-ARGs的削减能力十分有限, 30 min后溶液中的ARGs浓度仍有2.01×108 copies·mL-1, 去除率仅为0.61 log. 单一PMS对ARGs的破坏能力稍有提升, 但仍然无法达到较为理想的去除效果. 催化剂和氧化剂共同存在时, 质粒破坏速度有了较大的提升, 在5 min时的去除率已经与PMS作用30 min处于相同数量级. 在可见光照射下, Vis-rGO-CNCF/PMS系统取得了较好的去除效率, 经过30 min的处理, ARGs浓度已经下降到1.33×106 copies·mL-1, 去除率为2.79 log. 由此可以看出, 光助rGO-CNCF活化PMS系统对于溶液中游离态的磺胺类抗性基因具有较好的破坏能力, 经过30 min处理后, ARGs得到了很大程度的削减.
2.7 系统对磺胺类抗生素及磺胺类抗性基因混合污染的控制为了考察在抗生素SMT与抗性菌SA-ARB共存时, Vis-rGO-CNCF/PMS系统对于抗生素及其耐药性的协同控制能力, 构建了SMT初始浓度为10 mg·L-1、SA-ARB初始浓度为1.02×108 CFU·mL-1的混合污染体系, 控制效果如图 13（a）所示. 该组实验的条件为rGO-CNCF投加量为0.4 g·L-1, PMS投加量为0.6 g·L-1, 初始pH值为7.0. 从图 13（a）中可以看出, 反应30 min后SMT的去除率达到了99.98%, 实现了对SMT的高效去除. 对于ARB来说, 在混合污染中削减速度稍有放缓, 可能是因为反应过程中SMT与SA-ARB对活性物质构成竞争关系. 然而, 即使是在削减速率轻微下降的情况下, 5 min内Vis-rGO-CNCF/PMS系统已经实现了对SA-ARB超过99.99%的去除. 综上所述, SMT与SA-ARB共存时, 可见光助rGO-CNCF活化PMS体系对于两种污染物都实现了较高效率的去除.
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图 13 Vis-rGO-CNCF/PMS系统对SMT和SA-ARB混合污染的控制情况及胞内及胞外ARGs绝对丰度的变化 Fig. 13 SMT degradation curve and bacterial inactivation efficiency in Vis-rGO-CNCF/PMS system and changes in abundance of i-ARGs and e-ARGs |
为了探究SMT与SA-ARB共存时, 该系统对ARGs流出及控制的效果, 测试了反应过程中的胞内抗性基因和胞外抗性基因的绝对丰度, 结果如图 13（b）所示. 随着反应的进行, i-ARGs和e-ARGs均表现出了下降趋势, 且相较于单一灭菌实验, 由于提高了PMS投加量, 混合污染中的胞内胞外抗性基因的去除效率均有小幅增加, 这可能是因为含氧活性物质对于抗性基因片段的破坏能力更强, 先于SMT和SA-ARB进行了破碎. 该结果表明抗生素和抗性菌混合污染体系中抗性基因得到了较好地控制.
2.8 材料的稳定性和重复利用性材料能否被回收利用及其在使用过程中的稳定性, 是评价其能否投入实际应用的一项重要指标. 因此, 对Vis-rGO-CNCF/PMS体系中参与了SMT降解及ARB灭活的材料进行了2次、3次和4次回收, 每次回收采用过滤-冷冻干燥的方式, 4次回收中, 复合材料的平均质量回收率为86.31%, 回收再生的材料循环应用于SMT降解及ARB灭活. 如图 14（a）所示, 2次回收的材料使得SMT的降解率降到了87.12%, 在3次和4次回收中SMT的降解率较为稳定, 降解率最终回落到84.10%. 从图 14（b）可以看出, 4次循环实验中, 系统均保持了较高的磺胺类抗性菌灭活率, 在第4次回收中, 灭活率依旧达到了99.04%. 实验结果表明, 材料具有可重复利用性. 催化剂金属离子溶出容易造成对环境的二次污染, 因此通过ICP测试了本体系的金属离子溶出情况. ICP结果表明, 光催化氧化反应后, 溶液中铜离子和铁离子浓度均低于仪器检出限（< 0.1 mg·L-1）. 这可能是由于, 复合材料中引入的rGO与CF成键, 同时rGO还包覆在复合材料的表面, 使得材料的结构较为稳定, 不易破碎.
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（a）循环实验中SMT的降解效率；（b）循环实验中SA-ARB的降解效率 图 14 Vis-rGO-CNCF/PMS体系中循环实验条件下的SMT降解效率和SA-ARB的灭活情况 Fig. 14 Degradation efficiencies of SMT and bacterial inactivation efficiency in the Vis-rGO-CNCF/PMS system under cycle conditions |
（1）通过冷冻干燥法成功制备了还原性氧化石墨烯包覆的氮化碳掺杂铁酸铜催化材料（rGO-CNCF）, 石墨烯均匀包覆于氮化碳掺杂铁酸铜材料表面, rGO-CNCF具有优异的可见光响应活化PMS性能.
（2）在催化剂投加量为0.2 g·L-1, PMS投加量为0.3 g·L-1, 溶液初始pH值为7.0时, 30 min内Vis-rGO-CNCF/PMS高级氧化系统可实现对8.01 log SA-ARB的完全灭活.
（3）钾离子泄漏测试和SEM生物电镜测试结果表明, Vis-rGO-CNCF/PMS体系可以破坏抗性菌的细胞膜结构, 使其细胞结构不完整从而破碎失活；淬灭实验结果表明, 其中起到主要灭菌作用的活性物质是单线态氧1O2.
（4）Vis-rGO-CNCF/PMS高级氧化系统能够有效地降低SA-ARGs的水平转移能力, 该系统对于胞内和胞外游离态的SA-ARGs具有良好的破坏能力.
（5）对于抗生素和抗性菌复合污染情况, Vis-rGO-CNCF/PMS高级氧化系统对于SMT和SA-ARB两种污染物的破坏能力保持了较高的水平, 同时对于SA-ARGs的削减也未受到干扰, 该高级氧化体系可以实现对水体中磺胺类抗生素及其抗性菌和抗性基因的协同处理.
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