2024, Vol. 45
2. 中国科学院生态环境研究中心, 北京 100085;
3. 青海大学农牧学院, 西宁 810016;
4. 青海省草原改良试验站, 共和 813099
2. Research Center for Eco-Environmental Sciences, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100085, China;
3. College of Agriculture and Animal Husbandry, Qinghai University, Xining 810016, China;
4. Qinghai Grassland Improvement Experimental Station, Gonghe 813099, China
作为地球“第三极”, 青藏高原拥有世界上最大的高寒草地生态系统, 是我国重要的生态安全屏障、战略资源储备基地和高寒生物种质资源宝库, 也是亚洲乃至北半球气候变化的“调节器”[1~3]. 在气候变化和人类活动等自然和人为因素的作用下, 草地退化已经成为青藏高原地区面临的重要环境问题之一, 严重地影响了生态系统的正常运转以及功能的发挥[4, 5]. 高寒草地退化显著影响了植被群落多样性、地下土壤微生物群落和土壤理化特征[6~12], 导致土壤结构和养分状况受到物理性破坏, 从而进一步加速土壤退化[13].
退化草地生态恢复是一项系统性的复杂工程和长期的艰巨任务, 其中修复措施的选择至关重要[14, 15]. 轮牧、围栏封育、补播、施肥以及灌溉等[16]措施在青藏高原退化高寒草地恢复治理中取得了一定成效. 其中, 补播和施肥是恢复高寒退化草地较为常见的措施. 补播是在不破坏或少破坏原生植被的条件下, 播种优良牧草, 增加植被密度和盖度, 达到提高草地质量的目的[17, 18]. 高寒退化草地实施补播后, 土壤全磷、铵态氮、速效钾、速效磷和土壤蔗糖酶活性显著升高[19, 20]. 施肥对土壤有机碳活性组分提高有显著地促进作用, 施肥后土壤的氮矿化率提高, 植物生长加快, 土壤有机质增加, 从而导致微生物群落发生变化[21].
土壤微生物在分解土壤有机质、调节碳储量和养分循环以及影响植物生产力和健康方面发挥着重要作用. Wang等[22]对青藏高原高寒草地研究发现, 高寒草地退化显著改变了土壤微生物的多样性、群落组成和结构；王英成等[23]研究发现, 高寒草地退化显著降低了土壤细菌群落的α多样性；Dong等[24]研究发现高寒草地退化会导致青藏高原微生物多样性和微生物潜在功能变化. 目前, 尽管已经开展了大量的关于高寒草地土壤微生物群落的研究工作, 但针对高寒退化草地生态修复对土壤微生物群落影响的研究仍十分有限, 尤其是关于生态修复对根际土壤微生物群落影响的研究更为少见. 根际是土壤微生物与植物相互作用的重要场所, 其动态变化可作为监测高寒退化草地恢复过程的重要参考[25~28]. 因此, 研究不同生态恢复措施对根际微生物群落的影响对草地科学管理和健康评价具有重要意义.
本研究针对高寒退化草地选取不同的生态恢复方法（补播、施肥和施肥+补播）, 采用Illumina扩增子测序技术研究不同恢复方法处理后草地根际细菌群落, 揭示不同生态恢复方法对根际细菌多样性和群落组成的影响, 分析高寒退化草地指示细菌类群, 探究影响根际土壤细菌群落的主要环境因子, 阐明补播、施肥、施肥+补播处理对根际细菌群落网络的影响, 以期为草地生态恢复措施的制定提供科学依据, 并为草地健康评价提供新思路.
1 材料与方法 1.1 研究区自然状况研究区位于青海省海南藏族自治州共和县, 地理位置37°03′53″N, 99°33′16″E, 海拔3 270 m, 年均温为-0.7℃, 年降水量为1 495.3 mm, 试验地为天然退化草地, 是青藏高原高寒草地生态环境的代表. 草地植被以垂穗披碱草（Elymus nutans Griseb.）为主, 主要植物种类有狗尾草（Setaria viridis）、蓼属（Persicaria）、蕨麻（Potentilla anserina）、光叉叶委陵菜（Potentilla bifurca）、蓍（Achillea millefolium）、黄帚橐吾（Ligularia virgaurea）、黄芪（Astragalus membranaceus）、雪白委陵菜（Potentilla nivea）和西伯利亚离子芥（Chorispora sibirica）.
1.2 试验设计本试验样地位于青海省海南藏族自治州共和县青海省草原改良试验站, 试验共设置补播（R）、施肥（F）、施肥+补播（RF）和对照（CK）这4个处理, 每个处理设置5个小区, 共20个小区, 每个小区面积为3 m×5 m, 试验面积共300 m2. 本研究中施肥处理选用化肥（尿素：H2NCONH2）, 施加量27 g·m-2, 肥料的氮含量不低于46.4%. 在每个小区中, 将化肥溶于2.5 L水中进行喷洒, 并遵循农业施用标准. 在对照和补播处理中, 向土壤中喷洒等量的水（2.5 L）, 以避免干扰土壤湿度. 补播处理小区播种芒麦+苜蓿（北林201）, 补播方式为划破草皮免耕补播.
1.3 研究方法 1.3.1 土壤样品的采集在每个小区进行植物群落调查和土壤样品采集. 生物量测定采用刈割法, 将所有地上部分植被剪取后放入自封袋中, 用于称取鲜质量, 样品带回实验室后在65℃烘箱中烘干以获取干重, 作为地上生物量的指标. 为了收集根际土壤, 从上层土壤（0~20 cm）挖掘了完整的根系系统. 样品带回实验室后, 一份保存于4℃冰箱用于理化性质测定, 另一份保存在-80℃冰箱以便进行DNA提取.
1.3.2 土壤理化性质测定土壤理化性质, 包括土壤pH、土壤有机质（OM）、全磷（TP）、硝态氮（NO3--N）、铵态氮（NH4+-N）、有效磷（AP）和速效钾（AK）, 各指标均采用常用化学分析法进行测定, 由中国科学院南京土壤研究所完成, 具体测定方法参照Du等[29]的测定方法.
1.3.3 DNA提取、PCR扩增及测序根据Mobio试剂盒（MoBio DNeasy® PowerSoil® Kit）说明书从0.5g土壤中提取总DNA. 参照Gu等[30]的方法, 对所提取的土壤基因组总DNA, 针对细菌使用16S rRNA V4区的515F/806R（515F, 5′-GTGCCAG CMGCCGCGGTAA-3′和806R, 5′-GGACTACHVGGG TWTCTAAT-3′）进行PCR扩增, PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测观察, 将目标片段进行切胶纯化, 操作过程按照E.Z.N.A.TM Gel Extraction Kit（Omega Bio-tek, Norcross, GA, USA）说明书进行. 纯化后的扩增子用Nanodrop 2000计算浓度并建库, 建库完成后的混合样本冷冻运输至广东美格基因科技有限公司, 使用Illumina MiSeq 2000高通量测序平台进行测序.
1.4 数据处理与统计分析所有测序的原始数据均于中国科学院生态环境研究中心邓晔课题组构建的Galaxy分析平台（http://mem.rcees.ac.cn：8080）进行相关的分析[31]. 使用Trimmomatic对原始序列reads进行质量过滤和修剪, 去除低质量的reads和引物序列, 使用FLASH合并相同序列的正向和反向reads, 使用Btrim工具对reads进行过滤. 任何带有简并碱基的序列都被删除, 只保留16S长度在245~260bp之间的reads, 使用Greengene数据库作为嵌合体检测的参考, 使用UPARSE将序列聚类为可操作的分类单元（OTU）, 序列相似度阈值为97%. 本研究针对细菌群落的所有统计分析均使用R软件（版本4.2.3）进行分析. 使用的R包有：“Vegan”和“ggplot2”等.
2 结果与分析 2.1 施肥和补播对土壤理化性质和植被农艺性状的影响表 1数据显示, 施肥+补播与施肥处理样地显著增加了地上生物量（鲜重）, 而补播处理和对照处理地上生物量（鲜重）之间的差异不显著. 与对照组相比, 补播处理和施肥+补播处理显著增加了总磷的浓度. 此外, 施肥+补播处理样地中的总氮、铵态氮和硝态氮的含量均高于其他样地. 这些结果表明, 施肥+补播能有效地影响土壤理化性质, 增加地上生物量.
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表 1 土壤理化性质和植被参数1） Table 1 Soil properties and grass yield |
2.2 根际土壤细菌群落多样性、组成和结构分析
α多样性分析结果表明（图 1）, 根际土壤细菌群落Shannon指数在施肥处理后显著降低（P < 0.05）, 在补播和施肥+补播处理中并无显著变化. Simpson指数在施肥和补播处理后降低, 施肥处理后降低更为显著, 在施肥+补播处理中并无显著变化. 丰富度Richness在各处理样地之间并无显著变化.
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*表示P < 0.05, **表示P < 0.01 图 1 根际土壤细菌群落α多样性 Fig. 1 The α diversity indices of rhizosphere soil bacterial community |
基于Bray-Curtis距离的非度量多维尺度分析（NMDS）表明, 不同处理样地间根际土壤细菌群落结构存在较大差异（图 2）. 补播、施肥和施肥+补播样地样品明显分开, 对照与施肥样品点沿第一坐标轴分布, 对照与补播样品点沿第二坐标轴分布, 而施肥+补播与对照样品点则明显沿第一、二坐标轴分开. 这些结果表明, 补播、施肥以及施肥+补播处理均影响了根际土壤细菌群落结构, 其中施肥+补播处理对群落结构影响更为明显.
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图 2 基于Bray-Curtis距离矩阵的根际土壤细菌群落非度量多维尺度分析（NMDS） Fig. 2 Non-metric multidimensional scaling (NMDS) with a Bray-curtis distance matrix of rhizosphere soil bacterial community |
为了研究根际土壤细菌群落组成, 分别在门水平和属水平对群落组成进行分析. 放线菌门（Actinomycetota, 25.24%~35.10%, 相对丰度, 下同）、变形菌门（Pseudomonadota, 33.92%~43.88%、酸杆菌门（Acidobacteriota, 6.25%~7.91%）和芽孢杆菌门（Bacillota, 4.03%~11.77%）为优势菌门（相对丰度 > 1%）[图 3（a）]. 绿脓杆菌属（Pseudomonas, 4.38%~10.77%）、泛菌属（Pantoea, 2.46%~10.12%）和Gp16属（2.68%~4.42%）为主要优势菌属（相对丰度 > 1%）[图 3（b）].
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（a）细菌门水平, （b）细菌属水平 图 3 根际土壤细菌群落组成 Fig. 3 Composition of rhizosphere soil bacterial community |
利用分子生态网络（MENs）探究了施肥、补播和施肥+补播处理后根际土壤细菌群落之间相互关系（图 4）. 表 2数据显示, 补播、施肥、施肥+补播和对照处理节点数分别为1 555、1 578、1 428和1 669个, 边数分别为37 870、38 583、39 109和48 016条. 结果显示, 补播、施肥和施肥+补播处理降低了网络规模（节点数和边数）, 表明网络复杂程度降低. 补播、施肥、施肥+补播和对照处理模块数分别为27、8、19和4. 结果表明, 补播、施肥和施肥+补播处理增加了网络稳定性. 施肥、补播和施肥+补播处理网络中的正相关大于负相关. 观察不同网络的模块内核心物种发现, 细菌生物网络中的关键类群为假单胞菌门（Pseudomonadota）、放线菌门（Actinomycetota）和酸杆菌门（Acidobacteriota）.
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（a）根际土壤细菌群落的网络分析, （b）不同细菌类群在网络中所占比例, （c）网络中正负关系的比例 图 4 根际土壤细菌网络分析 Fig. 4 Analysis of bacterial network in rhizosphere soil |
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表 2 分子生态网络拓扑指标 Table 2 Topological index of MENs |
2.4 指示细菌类群分析
本研究采用LEfSe分析施肥、补播和施肥+补播处理草地根际土壤指示细菌, 选取2为LEfSe的阈值（图 5）. 施肥处理的指示细菌类群是新鞘酯属（Novosphingobium）, 补播处理的指示细菌类群是类诺卡氏菌科（Nocardioidaceae）和热放线菌科（Thermoactinomycetaceae）, 施肥+补播处理的指示细菌类群是丹毒丝菌纲（Erysipelotrichia）、丹毒丝菌目（Erysipelotrichales）和苏黎世杆菌科（Turicibacteraceae）.
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图 5 根际土壤细菌群落LEfSe分析 Fig. 5 LEfSe analysis of rhizosphere soil bacterial community |
采用Mantel test分析细菌群落组成及优势菌门的丰度与每个环境因子的相关性（图 6）, 结果发现, 细菌群落与土壤TN、TP和AK显著相关（P < 0.01）, 细菌群落和土壤NO3--N显著相关（P < 0.05）, 细菌群落和其他环境因子间并无显著相关关系. 假单胞菌门（Pseudomonadota）细菌与AP呈显著相关关系（P < 0.05）, 其它菌门与环境因子间并无显著相关关系. 这些结果表明TN、TP、AK和NO3--N是驱动根际土壤细菌群落变化的重要环境因子.
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*表示P < 0.05, **表示P < 0.01, ***表示P < 0.001, 没有星号表示P＞0.05 图 6 基于Mantel检验的环境因子与根际土壤细菌群落结构显著相关性 Fig. 6 Significant correlations between environmental factors and rhizosphere soil bacterial community structure based on Mantel test |
Shannon指数和Simpson指数是表征微生物群落多样性的指标. 本研究中施肥处理后退化草地根际细菌群落Shannon指数和Simpson指数显著降低. 周学丽等[25]研究发现在对青海湖地区退化草地施肥后土壤细菌群落Simpson指数出现下降趋势, 景美玲等[32]研究发现祁连县高寒退化草地施加氮肥后细菌的多样性指数也会显著降低. 这可能是由于单一化肥的施用导致一些适应性较强的细菌类群显现出特定的优势, 而其它细菌类群生长代谢受到影响, 导致整体细菌代谢功能下降[33, 34]. 补播、施肥以及施肥+补播处理均能影响根际土壤细菌群落结构, 这是因为补播影响了地表植物多样性与结构进而影响土壤细菌群落结构, 而施肥是通过改变土壤理化性质来影响土壤细菌群落结构. 施肥+补播处理后的根际细菌群落受植物及土壤理化性质两方面影响, 结构发生了较大改变.
放线菌门（Actinomycetota）、变形菌门（Pseudomonadota）、酸杆菌门（Acidobacteriota）和芽孢杆菌门（Bacillota）为根际细菌群落的主要优势菌门, 这与Li等[35]和李海云等[36]对青藏高原高寒草地的研究结果基本一致. 有研究表明, 酸杆菌门（Acidobacteriota）是典型的贫营养类群, 主要参与土壤中碳、氮和磷循环过程和有机物的分解[37]. 芽孢杆菌门（Bacillota）属富营养类群, 对土壤养分循环和生物质分解有着积极的促进作用, 在草地退化过程中可能起到一定的缓解作用[38]. 施肥处理的指示细菌类群是新鞘磷脂菌属（Novosphingobium）, 该类细菌具有一定的降解和分解性能, 该性能有助于土壤有机质的分解和循环[39]. 补播处理的指示细菌类群是热放线菌科（Thermoactinomycetaceae）, 该类细菌在土壤中起着分解有机物和生物质降解的作用[40], 有助于加速碳、氮、磷等元素的生物地球化学循环.
网络分析可以用于分析微生物群落中不同微生物之间的相互作用关系及其对群落结构和功能的影响[41]. 本研究中, 施肥、补播和施肥+补播处理后网络以正相关关系为主, 表明共存微生物之间是互惠互利、互营互利、交互共生和共栖等合作关系, 有利于植物获得更多的养分. Wan等[42]和Wu等[43]研究发现细菌群落稳定性与平均聚类系数和模块数量呈正相关. 补播、施肥和施肥+补播处理后网络中模块数增加, 表明根际土壤的细菌网络具有更多的功能相似的细菌类群, 可提高根际土壤细菌群落的稳定性, 以应对外界压力, 进而有助于增加细菌群落抵抗不良环境冲击的能力[44, 45]. 微生物关键类群在驱动微生物群落结构和功能, 改善土壤条件和作物生产方面发挥着重要作用[46~48].
Mantel test分析结果表明根际土壤细菌群落与土壤总氮、总磷和速效钾呈显著相关关系（P < 0.01）. 土壤总氮、总磷和速效钾是根际土壤细菌群落生长和代谢所需的重要营养元素[49, 50], 罗正明等[51]在五台山亚高山草甸研究中也发现总氮能够显著影响土壤细菌群落结构. 总磷可以影响土壤细菌的生长, 进而影响细菌群落的组成和结构[52], Li等[53]在青藏高原退化高寒草地研究中也发现土壤总磷能够显著影响土壤细菌群落结构. 这些结果表明, 环境因子的变化会对土壤细菌群落产生一定的影响, 直接或间接影响土壤细菌群落多样性、组成或结构的改变.
4 结论（1）施肥处理后Shannon指数和Simpson指数显著降低. 施肥+补播处理对群落结构影响较为明显. 补播、施肥和施肥+补播处理后高寒退化草地土壤细菌群落中放线菌门（Actinomycetota）、变形菌门（Pseudomonadota）和酸杆菌门（Acidobacteriota）为主要优势菌门；新鞘酯属（Novosphingobium）为施肥处理的指示细菌类群, 类诺卡氏菌科（Nocardioidaceae）和热放线菌科（Thermoactinomycetaceae）为补播处理的指示细菌类群, 丹毒丝菌纲（Erysipelotrichia）、丹毒丝菌目（Erysipelotrichales）和苏黎世杆菌科（Turicibacteraceae）为施肥+补播处理的指示细菌类群.
（2）补播、施肥和施肥+补播处理后网络复杂程度下降、网络稳定性增加. 施肥、补播和施肥+补播处理后网络以正相关关系为主. 假单胞菌门（Pseudomonadota）、放线菌门（Actinomycetota）和酸杆菌门（Acidobacteriota）是高寒退化草地根际细菌群落的关键物种.
（3）细菌群落与土壤总氮（TN）、总磷（TP）和速效钾（AK）显著相关（P < 0.01）, 它们是驱动高寒退化草地根际细菌群落的关键因子.
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