2024, Vol. 45
中国作为世界上最大抗生素生产国和消费国, 每年生产21万t抗生素[1], 其中大约50%被用到禽畜养殖业[2], 并且其滥用情况十分普遍. 抗生素在动物体内的吸收利用率很低, 大多数会随着动物粪便排出体外[3], 并通过粪肥和灌溉水等方式进入农田或直接排放未经处理的粪水进入环境[4, 5]. 尽管大多数抗生素的半衰期不长, 但抗生素广泛和频繁地使用及不间断地排放, 使得抗生素残留物可被视为“持久性”有机污染物[6, 7]. 抗生素在土壤中残留不仅会影响土壤动植物的生命活动、改变微生物的群落结构和功能[8], 并且抗生素在土壤中残留还能被作物吸收[9], 再通过食物链进入人体, 从而影响人类健康[10].
养殖场通常有占地面积大且异味大等特点, 因而多建立在监管较为薄弱的农村, 导致部分养殖场的制度管理较为松散, 抗生素的滥用状况更为严重[11]. 同时还有环境保护意识淡薄等问题, 导致含有抗生素的禽畜粪便随意倾倒或通过粪便、污水等形式向周围环境扩散, 造成环境污染, 其中四环素类、磺胺类和喹诺酮类药物是畜禽养殖中使用最广泛的抗生素类型[7]. 随着我国畜禽养殖业的蓬勃发展, 其对周边生态环境和人类健康所造成的潜在风险已成为现阶段多学科关注的热点[12].
目前有关养殖场对周边环境的造成的污染风险研究有限, 尤其是对养殖场周边土壤和水体污染共同分析的相关研究较少. 因此, 本文以重庆市璧山区某生态养殖场、养殖场周边长期定位试验田（施用来自养殖场的粪肥）、养殖场的周边土壤和水体以及试验田的排水沟水体为研究对象, 探讨了5种典型兽用抗生素（磺胺嘧啶, sulfadiazine, SDZ；强力霉素, doxycycline, DOX；土霉素, oxytetracycline, OTC；四环素, tetracycline, TC；金霉素, chlortetracycline, CTC）暴露的生态风险及其对环境介质群落微生物多样性的影响, 以期为畜禽粪便污染土壤的治理和修复以及生态环境的保护提供依据.
1 材料与方法 1.1 样品采集2021年10月24日起在重庆市璧山区八塘镇某生态养殖场及周边采集样品：①F：养鸡场新鲜鸡粪混合样品（29.82°N, 106.41°E）；②S1：养鸡场排水沟混合样品（29.85°N, 106.32°E）；③S2：养鸡场附近水库混合水体样品（29.85°N, 106.32°E）；④S3：璧山长期定位监测试验田排水沟水体样品（29.81°N, 106.41°E）；⑤R1：养鸡场内菜田混合土壤样品（29.82°N, 106.41°E）；⑥R2：养鸡场附近水库周边50 m内菜田混合土壤样品（29.85°N, 106.32°E）. 取样完成后立即放入装有干冰的泡沫箱中, 带回实验室后放入-20℃冰箱中保存, 用于后期抗生素和微生物多样性的分析. 每隔20 d采集一次样品, 共采集3次, 采集时间分别为2021年的10月24日、11月13日和12月3日, 共采集18个样品.
1.2 分析方法 1.2.1 样品前处理样品前处理参考Jacobsen等[13]的方法.
1.2.2 抗生素测定抗生素含量用超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/MS）测定[14]. SDZ、DOX、OTC、TC和CTC在土壤中的回收率在69.1%~84.3%之间, 回收率满足分析要求.
1.2.3 抗生素生态风险分析风险商（risk quotient, RQ）方法通常用于评估生态系统抗生素的潜在生态风险, 该风险商由测量环境浓度（MEC）除以预测无效应浓度（PNEC）计算得出. 风险等级分为低风险（0.01≤RQ < 0.1）、中风险（0.1≤RQ < 1）和高风险（RQ ≥ 1）[15]. 具体计算公式如下.
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式中, MEC为测试抗生素的含量（μg·kg-1）；PNECsoil为抗生素在土壤中预测的无效应含量（μg·kg-1）；PNECwater为抗生素在水中预测的无效应浓度（μg·L-1）；Kd为土壤-水分分配系数；AF为评价因子, 本研究中设定为1 000[16]；EC50为土壤的中位效应剂量（median effective concentration, EC50）, 5种抗生素的Kd和EC50值如表 1所示[17].
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表 1 5种抗生素的无效应浓度预测值 Table 1 Predicted values of no-effect concentrations of five antibiotics |
1.2.4 微生物群落多样性分析
使用Fast DNA Spin Kit for Soil（MP Biomedicials, LLC）试剂盒对菜田土壤微生物群落总DNA进行提取, 使用NEXTFLEX Rapid DNA-Seq Kit进行建库, 利用Illumina公司的MiSeq PE300平台进行测序（上海美吉生物医药科技有限公司）.
1.3 数据统计与分析采用Excel（2016）和R（version 3.3.1）软件进行数据统计与绘图, SPSS 23.0（SPSS Inc.USA）软件进行数据处理和方差分析. 试验数据均采用one-way ANOVA进行分析, 平均数之间的差异采用Duncan方法进行多重比较. 微生物群落多样性测序数据使用Fastp（https://github.com/OpenGene/fastp, Version 0.19.6）软件对原始测序序列进行质控, 使用FLASH（https://ccb.jhu.edu/software/FLASH/index.shtml, version 1.2.11）软件进行拼接. 使用Uparse软件（http://drive5.com/uparse/, version 7.0.1090）, 根据97%的相似度对序列进行OTU聚类. 利用RDP classifier（http://rdp.cme.msu.edu/, version 2.11）对每条序列进行物种分类注释, 比对Silva细菌16S数据库（Release138http://www.arb-silva.de）, 设置比对阈值为70%.
2 结果与分析 2.1 抗生素残留量如图 1所示, 水体和鸡粪中的5种抗生素检出量均显著高于土壤, 鸡粪中的SDZ和DOX检出量均高于水体, TC和CTC检出量均低于水体. 检测的两类土壤样本中均为DOX和OTC检出量较高, 分别为2.00~2.55 μg·kg-1和1.99~2.13 μg·kg-1；TC检出量最低（0.76~0.89 μg·kg-1）. 水体样本中CTC检出量最高（13.77~21.10 μg·L-1）, SDZ检出量最低（3.78~6.82 μg·L-1）. 鸡粪中OTC检出量最高（17.75~18.80 μg·kg-1）, TC最低（6.61~7.51 μg·kg-1）.
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图 1 不同采样日期参试5种典型抗生素检出量 Fig. 1 Detection amount of five typical antibiotics at different sampling dates |
土壤、养鸡场排水沟和附近水库的抗生素含量总体呈下降趋势, 但鸡粪抗生素含量有小幅度升高, 试验田排水沟抗生素含量几乎不变. 此外, 养鸡场排水沟水体抗生素含量检出值间差异显著, 尤其是OTC检出量存在极显著差异.
2.2 抗生素风险评价为评价养殖场带来的周边土壤和水体生态影响, 采用生态风险指数法对其造成的生态风险进行评价. 结果发现, 供试土壤中的DOX、OTC、TC和CTC无生态风险, 而土壤中的SDZ和水体中的SDZ、DOX、OTC、TC和CTC均具有高风险. 其中土壤中的SDZ高于预测危害含量7.59~8.95倍. 而水体中的SDZ、DOX、OTC、TC和CTC均不同程度地高于其预测危害浓度5.50~130.97倍, 表明土壤中SDZ的生态风险较大, 而相比于土壤, 水体中的抗生素生态污染风险更严重. 其中养鸡场排水沟中的抗生素生态风险整体较试验田排水沟和周边水库水体高, 以水体TC生态污染风险最严重, RQ值高达121.49~130.97（表 2）；OTC的生态污染风险相对其他抗生素较低, 是预测无效浓度的5.50~24.32倍, 但仍具有高生态风险.
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表 2 不同环境介质中抗生素生态风险RQ值 Table 2 Ecological risk RQ values of antibiotics in different environmental media |
2.3 微生物群落多样性
根据OTU聚类和α多样性分析, 试验田排水沟混合水体样品的Sobs、Chao和Ace指数均显著高于其它样品, 即试验田排水沟水体微生物数量与OTU数目均为最大（图 2）. 土壤样品Shannon指数高于其它样品, Simpson指数最低, 即土壤样品中微生物多样性最高. 总体来看, 试验田排水沟微生物数量与多样性均处于较高水平, 养鸡场及其周边水体微生物群落数量与多样性较低.
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图 2 样品α多样性指数 Fig. 2 The α-diversity index of samples |
如图 3所示, 在门水平上, 共检测到12个相对丰度超过1%的细菌门. 水体中优势菌门包括变形菌门（Proteobacteria, 45.32%~56.91%, 相对丰度, 下同）、拟杆菌门（Bacteroidota, 10.93%~24.46%）、蓝藻门（Cyanobacteria, 7.34%~23.77%）和放线菌门（Actinobacteriota, 3.91%~11.45%）等. 土壤中优势菌门包括变形菌门（Proteobacteria, 29.77%~29.93%）、放线菌门（Actinobacteriota, 18.32%~26.73%）、酸杆菌门（Acidobacteriota, 11.37%~14.48%）、绿弯菌门（Chloroflexi, 7.48%~9.28%）、浮霉菌门（Planctomycetota, 5.09%~6.24%）和拟杆菌门（Bacteroidota, 2.86%~3.44%）等. 水体与土壤中共有优势菌门有变形菌门、放线菌门和拟杆菌门, 其中变形菌门在试验田排水沟相对丰度最高（56.91%）, 在养鸡场内菜田与水库周边菜田相对丰度较低（29.76%和29.93%）；放线菌门在养鸡场排水沟与水库水体相对丰度最高（24.00%和24.46%）.
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（a）门水平，（b）属水平，（c）占比（门水平）；1. Proteobacteria，2. Bacteroidota，3. Actinobacteriota，4. Cyanobacteria，5. Acidobacteriota，6. Firmicutes，7. Chloroflexi，8. Planctomycetota，9. others，10. Gemmatimonadota，11. Myxococcota，12. unclassified_k_norank_d_Bacteria，13. Nitrospirota，14. Latescibacterota，15. Methylomirabilota. 图 3 微生物群落的物种组成 Fig. 3 Species composition of microbial communities |
在属水平上, 共检测到70个相对丰度超过1%的细菌属, 其中有29个属相对丰度超过2%. 水体中以norank_ f_norank_o_Chloroplast（5.99%~23.72%, 相对丰度, 下同）、黄杆菌属（Flavobacterium, 2.41%~20.54%）和Limnohabitans（3.62%~11.24%）为主要优势属. 不动杆菌、C39、多核杆菌、unclassifiled_ f_Sporichthyaceae、甲基单胞菌属（Methylomonas）、hgcI_clade、噬氢菌属（Hydrogenophaga）、Fluviicola和norank_ f_Methylophilaceae为水体样品特有菌属. 土壤则以norank_ f_norank_o_Gaiellales（相对丰度为2.07%~6.47%）和norank_ f_norank_o_Vicinamibacterales（相对丰度为2.54%~4.96%）为主要优势属. norank_ f_norank_o_Acidobacteriales为土壤样品特有菌属.
基于binary_jaccard算法对各样本微生物群落进行主坐标分析, 发现5种环境介质微生物群落组成存在显著性差异（R2 = 0.977, P = 0.001）. 土壤样品分布在左下方, 与水体样品在PC1轴和PC2轴上均分开[图 4（a）]；3个水体样品分布也较远, 各样本在群落组成上均存在较大差异. 对各样品群落进行Kruskal-Wallis秩和检验, 群落中相对丰度top15优势门的群落差异性如图 4（b）所示, 变形菌门、拟杆菌门、放线菌门和酸杆菌门等水体和土壤优势菌群在5种环境介质间均存在显著差异, 其中, 粘球菌门在5种环境介质间差异最为显著（P=0.009）. 如Venn图所示, 共检测到20种相同的门和192个相同的属, 各样品在门水平上微生物群落组成无显著差异. 在属水平上, 5种环境介质微生物群落组成间差异显著, 试验田排水沟样品拥有最多的特有属（146）, 2个土壤样品共有属最多（69）, 群落组成有一定相似性[图 4（d）].
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（a）PCoa（门水平）, （b）Venn图（门水平）, （c）各样品物种差异（门水平）, （d）Venn图（属水平）, （b）的纵坐标数值：1.Proteobacteria, 2.Bacteroidota, 3.Actinobacteriota, 4.Cyanobacteria, 5.Acidobacteriota, 6.Firmicutes, 7.Chloroflexi, 8.Planctomycetota, 9.Gemmatimonadota, 10.Myxococcota, 11.unclassified_k_norank_d_Bacteria, 12.Bdellovibrionota, 13.Nitrospirota, 14.Verrucomicrobiota, 15.Latescibacterota 图 4 微生物群落组成差异 Fig. 4 Differences in microbial community composition |
通过VIF方差膨胀系数筛选去除具有多重共线性的环境因子, 与群落微生物显著相关的抗生素（VIF < 10）为OTC和TC. 抗生素与样品微生物群落的冗余分析（RDA/CCA）如图 5所示, 在门水平上, TC和OTC对水体的影响均远大于土壤, 其中, OTC对养殖场排水沟与附近水库样本的影响大于试验田排水沟样本；属水平上, TC和OTC对水体的影响也大于土壤. 将不同抗生素检出量与微生物群落优势菌群作Pearson相关性分析, 发现OTC和TC在门水平、属水平上与微生物群落均存在显著相关性. 在门水平上, OTC和TC与变形菌门、拟杆菌门存在显著的正相关, TC与放线菌门存在显著负相关. 在属水平上, OTC和TC与norank_ f_norank_o_Chloroplast、黄杆菌属、Limnohabitans呈显著正相关, 与norank_ f_norank_o_Gaiellales和norank_ f_norank_o_Vicinamibacterales呈显著负相关. 水体特有菌属中, OTC与unclassifiled_ f_Sporichthyaceae、hgcI_clade和Fluviicola呈显著正相关；TC与多核杆菌属、噬氢菌属存在显著正相关.
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（a）RDA（冗余分析）（门水平）, （b）CCA（典范对应分析）（属水平）, （c）群落与抗生素相关性（门水平）, （d）群落与抗生素相关性（属水平）；c1. unclassified_k__norank_d__Bacteria, c2. Nitrospirota, c3. Myxococcota, c4. Acidobacteriota, c5. Planctomycetota, c6. Chloroflexi, c7. Gemmatimonadota, c8. Actinobacteriota, c9. Armatimonadota, c10. Bdellovibrionota, c11. Desulfobacterota, c12. Latescibacterota, c13. Methylomirabilota, c14. Proteobacteria, c15. Bacteroidota, c16. Cyanobacteria, c17. Verrucomicrobiota, c18. Spirochaetota, c19. Firmicutes, c20. Patescibacteria, d1. Acinetobacter, d2. Novosphingobium, d3. Fluviicola, d4. Methylomonas, d5. Arenimonas, d6. unclassified_ f__Sporichthyaceae, d7. Limnohabitans, d8. norank_ f__norank_o__Chloroplast, d9. norank_ f__Rhizobiales_Incertae_Sedis, d10. Flavobacterium, d11. hgcI_clade, d12. unclassified_ f__Comamonadaceae, d13. Polynucleobacter, d14. Hydrogenophaga, d15. norank_ f__norank_o__Gaiellales, d16. norank_ f__norank_o__Vicinamibacterales, d17. Gaiella, d18. norank_ f__SC-I-84, d19. Bacillus, d20. C39；图（c）和（d）中不同星号表示相关性, * 0.01 ≤ P < 0.05, ** 0.001 ≤ P < 0.01, *** P < 0.001 图 5 抗生素与微生物群落的相关性分析 Fig. 5 Correlation analysis between antibiotics and microbial community |
抗生素可以通过有机肥、粪肥和粪水施用等方式进入土壤环境, 随即通过吸附、解析、转化和固定等环境过程, 从而长期存在于土壤中[18]. 动物粪便作为抗生素进入环境的介质, 其抗生素残留量往往高于其它介质. 而由于废水的直接排入, 水体中抗生素浓度也处于较高水平. 环境介质中抗生素的稳定性存在着巨大的差异[8]. 本研究中, 土壤抗生素残留量3次采样之间差异较小, 表明土壤中抗生素较为稳定, 不易降解；养鸡场排水沟和附近水库水体抗生素含量差异较大, 可能是由于水体内多为养殖场废水直接排入, 很大程度上影响了水体内抗生素含量变化. 抗生素在土壤中具有高吸附性, 使其能够在相当长的时间内持续存在, 而水体中抗生素在紫外光下会分解, 这可能是水环境中抗生素变化较大的一个重要因素[19 ~ 21]. 其中, 四环素和金霉素在水体中残留量高于鸡粪, 可能是由于水体对抗生素的积累；此外, 由于水体中沉积物的存在, 抗生素可能会通过沉积物二次释放进入水体中, 造成水体中抗生素浓度短暂升高[22]. 试验田排水沟混合水体样品抗生素含量在3次取样时基本无显著变化, 可能是因为试验田当季仅在种植作物前进行一次粪肥施入, 并未多次补施, 该试验田也无其它抗生素来源, 由于生物降解、光降解和其他过程, 抗生素含量基本稳定或逐渐降低[23].
本研究中, 四环素类抗生素平均检出量高于磺胺嘧啶, 这与此前的研究结果一致[24 ~ 26]. 四环素价格低廉、效率高且毒性小, 被广泛应用于农业、水产养殖和畜牧业中作为抗菌剂和生长促进剂, 是我国畜禽养殖中使用量最大的抗生素[27]. 有研究发现, 四环素类抗生素的固-液吸附分配系数Kd值较高, 比其他抗生素更容易吸附在土壤中[28 ~ 30], 且四环素类抗生素在土壤中的行为复杂, 受多种因素的影响（如生物降解、土壤性质和抗生素分子结构）；磺胺类抗生素吸附能力较弱, 在土壤中具有很高的迁移性倾向, 也更容易生物降解, 这可能是土壤样品中磺胺嘧啶水平低的原因[24, 31]. 不同抗生素在鸡粪中的残留量也有很大差异, 与养殖场对动物用药种类有关, 也与粪肥对不同种类抗生素吸收差异有关, 相对于四环素和金霉素, 土霉素更容易被粪肥吸附[32]. 由于不同兽用抗生素可能产生的相互作用效应, 应注意各化合物存在的联合生态毒性[33].
环境介质中大量抗生素残留会显著影响微生物群落结构的变化, 降低微生物的群落多样性, 产生各种毒性效应[34]. 残留的抗生素不仅会对微生物的生存方式、微生物群落功能产生影响, 同时也会降低特殊菌群微生物固定和降解污染物的能力[35]. 土壤优势菌门为变形菌门和放线菌门, 水体优势菌门为变形菌门、拟杆菌门, 与此前的研究结果一致[36 ~ 42], 作为水体中两大优势类群, 变形菌门和拟杆菌门可能参与了包括抗生素在内的众多物质的生物化学循环过程[43]. 变形菌门和放线菌门在自然水环境中普遍存在, 而拟杆菌门则常存在于富营养的水环境中[44]. 有研究发现, 变形菌门和拟杆菌门的丰度可以反映水生生态系统受抗生素等污染物的影响[45].
已有研究表明抗生素对群落微生物的影响与其在环境介质中的含量或浓度密切相关, 在高浓度下, 抗生素对细菌有抑制作用, 而低浓度会在细菌中诱导反向生物反应[46]. 土霉素高含量（200 mg·kg-1）抑制土壤微生物丰度；而恩诺沙星在低质量摩尔浓度0.025 mmol·kg-1时就会表现出抑制作用[47]. 但也有相反报道, 蔡婷等[48]研究发现, 四环素降低了黄豆芽生长过程中根际微生物群落丰度和多样性, 且随浓度和时间的增加其抑制作用增强；也有研究发现, 暴露在磺胺嘧啶中4 d的细菌/真菌值从70%减少到57%[7]. 本研究中, 土壤中抗生素残留量显著低于水体, 而微生物多样性高于水体, 表明抗生素对群落微生物存在明显的负面效应. 5种环境介质中土霉素、四环素与群落微生物存在显著相关性, 且抗生素增加了5种环境介质微生物丰度, 这与之前的研究结果一致[47], 表明抗生素可以作为某些土壤微生物的营养物质刺激其活性和生长.
4 结论养殖场周边水体抗生素生态污染风险大于土壤. 养鸡场排水沟中的抗生素生态风险整体较试验田排水沟和周边水库水体高, 5种典型兽用抗生素以TC生态污染风险最严重. 抗生素残留影响环境介质中微生物多样性, 土霉素、四环素与环境介质群落微生物存在显著相关性. 土壤优势菌门为变形菌门和放线菌门, 水体优势菌门为变形菌门和拟杆菌门. 在属水平上, OTC和TC与norank_ f_norank_o_Chloroplast、黄杆菌属和Limnohabitans呈显著正相关, 与norank_ f_norank_o_Gaiellales和norank_ f_norank_o_Vicinamibacterales呈显著负相关.
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