2024, Vol. 45
2. 宁夏大学生态与环境学院, 银川 750021;
3. 西北土地退化与生态恢复国家重点实验室培育基地, 银川 750021
2. School of Ecology and Environment, Ningxia University, Yinchuan 750021, China;
3. Breeding Base for State Key Laboratory of Land Degradation and Ecological Restoration in Northwestern China, Yinchuan 750021, China
枸杞(Lycium barbarum)是茄科多年生落叶灌木, 具备较强的耐盐碱、耐寒和耐旱等特性[1].由于枸杞自身生长特性的限制, 枸杞连作障碍严重影响了枸杞的生产力.有研究表明, 连作10 a以上的枸杞产量和品质趋于下降, 对枸杞产业的可持续发展造成了严重的影响[2].长期连作导致的土壤退化是限制作物优质高产的重要因素, 而土壤退化与土壤理化性质、微生物群落结构的改变等密切相关[3].如大豆和番茄的连续种植会导致其土壤环境恶化, 主要表现在土壤酶活性和微生物群落多样性降低, 土壤次生盐渍化程度增加、土传病害富集以及毒性物质累积等, 进而降低了植株的产量和品质[4, 5].
枸杞作为长期连作的重要作物之一, 先前的研究也关注了连作对枸杞根区土壤微环境的影响.如有研究表明枸杞长期连作能够增加其根区土壤的总氮(TN)、速效磷(AK)和总有机碳等含量, 但以上元素的积累并不能维持枸杞的产量和品质[6].在枸杞根区土壤中也发现连作年限的增加会降低土壤pH, 引起土壤次生盐渍化的发生, 次生盐渍化又会进一步抑制枸杞根系的活性, 诱导根系细胞的氧化损伤, 进而对枸杞的生长造成负面的影响[7, 8].此外, 微生物不仅是枸杞根区土壤的重要组成部分, 也是土壤养分循环的主要参与者, 对枸杞的生长具有关键的调控作用[9].Na等[8]研究发现连作年限的增加能够降低枸杞根区土壤微生物群落的多样性, 破坏土壤微生物之间的潜在相互作用, 且增加了镰刀菌属(Fusarium spp.)等植物病原菌的积累.有研究也证实了根区土壤养分含量、微生物群落等因素通常能够影响植物根系的结构和其生理活动, 进而影响根系对养分的吸收和利用[10].郑玉冲等[11]对小麦根区的研究也表明了小麦能够通过调控根区微生物群落来影响其对养分的吸收和利用.枸杞根区土壤微环境的变化与枸杞的健康生长密切相关.目前研究人员、种植户和相关农技人员已充分认识到枸杞存在连作障碍的现象, 并对导致该现象发生的机制有一定的了解[12 ~ 14], 但对该过程中根区土壤微生物与土壤盐碱化、养分等环境因素的关系、微生物的功能以及如何应对连作障碍还缺乏更深入地了解.而且枸杞连作导致的土壤根区微环境的变化是一个极其复杂的过程, 又因土壤类型、管理措施和研究方法的不同而不同, 因此, 需要在多种条件下进行更深入地探索.
新烟碱类农药作为新型的广谱杀虫剂, 其销量额占全球杀虫剂市场的25%[15].但其使用后, 仅5%~10%能够作用于目标生物体中, 其余则残留在土壤中难以降解, 甚至能够产生毒性更持久、更强的化合物, 对生态环境造成了恶劣的影响[16].相关研究也证实了土壤农药残留能够改变土壤微生物组, 对农业土壤的功能具有潜在的负面影响[17].其中, 吡虫啉和啶虫脒作为我国枸杞田中使用最广泛的杀虫剂, 在枸杞干果中的检测率居高不下, 连作年限的增加, 同时也增加了枸杞根区土壤中两种农药残留的积累[18].但它们在枸杞根区土壤中的积累与微生物群落之间的关系尚未见报道, 而以上都有助于人们理解枸杞长期连作障碍的机制.
因此, 本研究以不同连作年限的枸杞根区土壤为切入点, 进一步明确连作年限对土壤新烟碱类农药吡虫啉和啶虫脒的残留、土壤理化性质以及土壤微生物群落多样性、结构和功能的影响, 探究枸杞连作障碍的发生机制, 以期为枸杞的科学种植与管理及枸杞产业的可持续发展提供理论依据.
1 材料与方法 1.1 研究区概况研究区位于宁夏回族自治区中卫市中宁县(105°26'~106°07'E, 37°09'~37°50' N), 是宁夏枸杞种植面积最大、枸杞品质最好的产区之一.该区域海拔1 189.30 m~1 161.00 m, 年均降水量、蒸发量和温度分别是202.1 mm、1 200 mm和9.5℃, 土壤多为砂壤土, 少数土壤为壤土或黏壤土.枸杞园所用肥料, 主要以复合肥料和尿素为主, 每年施用两次, 平均施用量为6 327 kg·hm-2.杀虫剂主要是吡虫啉、啶虫脒和二苯醚, 每年喷洒约8~11次, 每次1 500 mL·hm-2.
1.2 样品采集2021年9月, 在研究区枸杞种植面积最大的舟塔乡, 选取连作2 a、9 a和15 a的枸杞园进行枸杞根区土壤样品的采集.采样时, 先将植株冠层地表的枯枝落叶清理后, 用土钻在距离枸杞主根10 cm~20 cm处采集0 cm~20 cm土层的土壤样品, 每个连作年限采集4个重复.将采集到的新鲜土壤样品分成2份, 一份低温冷藏带回实验室, 用于测定土壤含水率(SWC)、土壤微生物、铵态氮(NH4+-N)、硝态氮(NO3--N)、吡虫啉和啶虫脒的含量；另一份风干样则用于测定土壤的理化指标如: 土壤pH、全盐(TS)、TN、有机质(SOM)、碱解氮(AN)、速效磷(AP)和AK.
1.3 土壤理化性质的测定土壤基本理化性质的测定参照鲍士旦[19]的土壤农化分析.土壤pH、SWC和TS分别采用电位法、烘干法和称重法进行测定.土壤TN和SOM分别采用凯氏定氮法和外加热法测定. AN采用碱解扩散法, AP和AK分别采用Blay法和火焰光度法. NH4+-N和NO3--N使用全自动间断化学分析仪(Skalar Analytical, The Netherlands)进行测定.
1.4 土壤吡虫啉和咪虫啶残留量的测定使用超高效液相色谱-串联质谱法[20]测定枸杞根区土壤中吡虫啉和啶虫脒的残留量.样品处理流程如下: 首先将样品与乙腈混合、振荡、离心并收集上清液, 然后将上清液过柱、洗脱, 待其干燥后再用甲醇进行定容, 混匀后滤膜过滤, 最后由TSQ Vantage LC-MS/MS(Thermo Fisher公司)进行测定.
1.5 土壤微生物基因组总DNA的提取每个样品准确称取0.5 g的土壤, 采用FastDNA Spin Kit试剂盒(MP Biomedicals, USA), 按照说明书操作步骤对所有土壤样品进行微生物基因组DNA的提取.并用1%琼脂糖凝胶电泳和微量紫外分光光度计(Nanodrop ND2000, USA)分别检测DNA的纯度和浓度.
1.6 高通量测序与处理本研究目标基因为细菌16S rRNA的V3-V4区和真菌ITS的1-5F区.细菌所用引物为341F(CCTAYGGGRBGCASCAG)和806R(GGACTACNNGGGTATCTAAT).真菌所用引物为ITS5-1737F(GGAAGTAAAGTCGTAACAAGG)和ITS2-2043R(GCTGCGTTCTTCATCGATGC).PCR反应总体系为30 μL, 包括DNA聚合酶(New England Biolabs, USA)、1.0 mol·L-1的上下游引物、DNA模板和无菌超纯水.PCR扩增完成后, 用2%的琼脂糖凝胶检测扩增产物的大小, 并使用PCR产物纯化试剂盒(TIANGEN, China)对扩增产物进行纯化, 而后在北京诺禾致源科技股份有限公司的Illumina NovaSeq 6000平台上进行高通量测序.
测序完成后, 通过Quantitative Insights Into Microbial Ecology(QIIME1)软件对测序所得到的原始序列进行拼接、过滤和去除嵌合体等得到有效数据, 然后通过Usearch算法对可操作分类单元(operational taxonomic units, OTUs)进行聚类, 并将细菌和真菌的所有样品统一抽平到相同条数.最后基于Silva数据库对细菌和真菌的OTUs进行物种的注释.
1.7 数据处理SPSS软件(version 22.0)和Origin软件(version 8.0)用于对数据进行基本的统计处理与分析.使用R软件(version 4.2.3)中的vegan包进行Alpha多样性(Shannon指数、Simpson指数、Chao1指数和ACE指数)分析、Beta多样性分析和冗余分析(RDA), 分别探究微生物群落的多样性、分布特征以及与环境因子之间的关系.使用pheatmap包对优势菌门和环境因子进行斯皮尔曼(Spearman)秩相关性分析.此外, 首先过滤掉平均相对丰度低于0.01%的OTU, 然后利用Spearman相关性分析筛选出P < 0.05和|r| > 0.6的数据, 通过Gephi软件(version 0.9.7)构建细菌和真菌群落的共生网络图, 并进一步在每个网络中随机移除50%的分类群后, 通过对剩余分类群的比例来评估细菌和真菌的网络稳定性.最后基于NovoMagic平台(https://magic.novogene.com)对细菌和真菌分别进行PICRUSt和FunGuild功能预测分析.
2 结果与分析 2.1 不同连作年限枸杞根区土壤理化性质、农药残留的分析连作年限对枸杞根区土壤理化因子和农药残留的影响各异(表 1).土壤理化性质方面, 不同连作年限的枸杞根区土壤均呈弱碱性, 其pH没有显著性变化.但随着连作年限的增加, 土壤SWC逐渐降低, TS含量则逐渐升高.土壤TN、AN、AP、AK、NH4+-N和NO3--N含量整体上呈现先增加后降低的趋势, 连作9 a的枸杞根区土壤中呈现最大值, 然而土壤SOM含量则出现了波动, 在连作15 a的枸杞根区土壤中含量最高.其中, 仅土壤TS、SOM、AN和AK含量在不同连作年限的枸杞根区土壤中存在显著性的差异(P < 0.05).枸杞根区土壤中农药的残留量, 整体上随着连作年限的增加而呈现增加的趋势, 吡虫啉和啶虫脒残留量在连作15 a的枸杞根区土壤中最高, 但吡虫啉的残留量仅在连作15 a的枸杞根区土壤中存在显著性差异(P < 0.05).
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表 1 不同连作年限枸杞根区土壤农药残留和理化性质1) Table 1 Soil pesticide residues and physicochemical properties in root soil of L. barbarumwith different continuous cropping years |
2.2 不同连作年限枸杞根区土壤微生物差异分析 2.2.1 细菌和真菌OTU数量的分析
对不同连作年限枸杞根区土壤中细菌和真菌的OTU数量进行了韦恩分析(图 1). 3个不同连作年限枸杞根区土壤中识别出的细菌的OTU总数目是8 177个, 共有的细菌OTU数目有3 578个.连作2 a、9 a和15 a的枸杞根区土壤中识别出的细菌特有的OTU数目分别是650、1 352和873个, 占比分别为7.95%、16.53%和10.68%. 3个连作年限枸杞根区土壤中识别出的真菌的OTU总数目是5 943个, 共有的真菌OTU数目有1 152个.连作2 a、9 a和15 a的枸杞根区土壤中识别出的真菌特有的OTU数目分别是1 003、1 672和640个, 占比分别为34.08%、28.13%和10.77%. 3个不同连作年限枸杞根区土壤中特有的细菌和真菌OTU数目均在连作9 a的枸杞根区土壤中最高.
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图 1 不同连作年限枸杞根区土壤中细菌和真菌的OTUs数目 Fig. 1 Number of bacterial and fungal OTUs in root soil of L. barbarum with different continuous cropping years |
细菌和真菌的Shannon指数、Simpson指数、Chao1指数和ACE指数在连作9 a的枸杞根区土壤中呈现最大值, 但连作年限对细菌和真菌Alpha多样性的影响各不相同(图 2).连作15 a的枸杞根区土壤中细菌的多样性显著降低, 连作9 a的枸杞根区土壤中细菌的丰富度显著增加, 而真菌的丰富度仅在连作9 a和15 a的枸杞根区土壤中存在显著性差异.此外, 不同连作年限枸杞根区土壤中细菌群落的Shannon指数、Simpson指数、Chao1指数和ACE指数均高于真菌.
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*为P<0. 05 图 2 不同连作年限枸杞根区土壤中细菌和真菌的Alpha多样性指数 Fig. 2 Alpha diversity indices of bacteria and fungi in root soil of L. barbarumwith different continuous cropping years |
为研究不同连作年限枸杞根区土壤中细菌和真菌群落的组成情况, 对排名前10的优势菌门进行了比较(图 3).在不同连作年限的枸杞根区土壤细菌优势门的组成中, 变形菌门(Proteobacteria)的相对丰度是最高的, 占28.29%~31.89%, 其次是未被注释到的细菌(unidentified_Bacteria)和酸杆菌门(Acidobacteriota), 分别占17.87%~20.06%和11.23%~14.65%, 这3种门的相对丰度之和占到了优势门总和的55%以上.随着连作年限的增加, 变形菌门和放线菌门(Actinobacteriota)的相对丰度呈现增加的趋势, 酸杆菌门的相对丰度则呈现降低的趋势, 而绿弯菌门(Chloroflexi)和芽单胞菌门(Gemmatimonadota)整体上呈现先增加后降低的趋势, 在连作9 a的枸杞根区土壤中含量最高.在真菌优势门的组成中, 子囊菌门(Ascomycota)的相对丰度占绝对优势(46.10%~56.49%).此外, 壶菌门(Chytridiomycota)显著富集在连作2 a的枸杞根区土壤中, 而担子菌门(Basidiomycota)和毛霉菌门(Mortierellomycota)则主要富集在连作9 a的枸杞根区土壤中.
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图 3 不同连作年限枸杞根区土壤中细菌和真菌优势门的相对丰度 Fig. 3 Relative abundance of dominant phyla of bacteria and fungi in root soil of L. barbarumwith different continuous cropping years |
对不同连作年限枸杞根区土壤优势细菌属和真菌属进行了进一步的比较(图 4).不同连作年限枸杞根区土壤中优势细菌属和真菌属的分布是不同的.在细菌属水平上, 芽单胞菌属(Gemmatimonas)和苔藓杆菌属(Bryobacter)等在连作2 a的枸杞根区土壤中富集, 而在连作15 a的枸杞根区土壤中富集的菌属包括有链霉菌属(Streptomyces)、假单胞菌属(Pseudomonas)、栖大理石菌属(Marmoricola)、节杆菌属(Arthrobacter)和放线菌属(Gaiella).在真菌属水平中, 乳菇属(Lactifluus)和内生真菌枝孢属(Cladorrhinum)等在连作9 a的枸杞根区土壤中富集, 放射毛霉属(Actinomucor)和木霉属(Trichoderma)等在连作15 a的枸杞根区土壤中富集.
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图 4 不同连作年限枸杞根区土壤中细菌和真菌优势属的组成 Fig. 4 Composition of dominant genera of bacteria and fungi in root soil of L. barbarumwith different continuous cropping years |
基于细菌和真菌的OTUs水平以及Bray-Curtis距离, 通过主坐标分析(PCoA)进一步分析了不同连作年限枸杞根区土壤细菌和真菌群落的差异.如图 5, 细菌PCoA分析的第1主成分和第2主成分分别解释了28%和22%的群落变异, 不同连作年限枸杞根区土壤细菌群落之间的组成是不同的, 在不同连作年限枸杞根区土壤中已产生了种群-连作年限的梯度.真菌PCoA分析的第1主成分和第2主成分分别解释了25%和20%的群落变异, 但其在不同连作年限枸杞根区土壤中的聚集出现了小部分的重叠, 说明连作年限虽然影响了真菌群落的组成, 但连作年限对枸杞根区土壤中真菌群落(R2=0.325, P=0.005)的影响程度要小于细菌群落(R2=0.477, P=0.001).
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图 5 不同连作年限枸杞根区土壤中细菌和真菌群落PCoA分析 Fig. 5 PCoA analysis of bacteria and fungi in root soil of L. barbarum with different continuous cropping years |
基于冗余分析进一步探究了驱动枸杞根区土壤微生物群落和土壤农药残留、理化因子的关系(图 6). RDA1和RDA2轴共同解释了细菌和真菌群落结构总变化的27.39%和35.15%.在细菌群落中, 土壤TS、SOM、AN和AK是影响枸杞根区土壤细菌群落分布的主要环境因子(P < 0.05).在真菌群落中, 土壤AN、AP和NH4+-N是影响枸杞根区土壤真菌群落分布的主要环境因子(P < 0.05).连作9a的枸杞根区土壤细菌和真菌与TN、NH4+-N、AN、AP、AK和NO3--N呈现正相关关系, 连作15 a的枸杞根区土壤细菌和真菌还与SOM、TS和吡虫啉呈现正相关关系, 连作9 a的枸杞根区土壤真菌群落还与啶虫脒显示出了正相关关系.
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图 6 不同连作年限枸杞根区土壤微生物群落和农药、理化性质的冗余分析 Fig. 6 Redundancy analysis of microbial communities, pesticides and physicochemical properties in root soil of L. barbarumwith different continuous cropping years |
进一步对土壤吡虫啉、啶虫脒和土壤理化性质与排名前10的优势细菌门和真菌门进行相关性分析(图 7).在优势细菌门中, 吡虫啉与未被注释到的细菌和酸杆菌门之间均存在显著性的负相关关系, 与变形菌门之间存在显著性正相关关系；土壤理化性质中TS与酸杆菌门、芽单胞菌门和粘细菌门(Myxococcota)均存在显著性负相关关系, 与放线菌门和厚壁菌门(Firmicute)间存在显著性正相关关系；此外, 土壤理化性质中的pH、SWC、SOM、AN和NH4+-N与某一种或几种细菌优势门之间均存在显著性相关关系.在优势真菌门中, 吡虫啉与新美鞭菌门(Aphelidiomycota)和罗兹菌门(Rozellomycota)之间存在显著性负相关关系；土壤理化性质中的pH、TS、SOM、AN和NH4+-N与某一种或几种真菌优势门之间均存在显著性相关关系.整体上, 农药残留和理化性质与细菌优势门之间的相关关系要多于真菌优势门之间的显著性相关关系.
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a1. Proteobacteria, a2. unidentified_Bacteria, a3. Acidobacteriota, a4. Bacteroidota, a5. Chloroflexi, a6. Actinobacteria, a7. Firmicutes, a8. Gemmatimonadota, a9. Actinobacteriota, a10. Myxococcota；b1. Ascomycota, b2. Chytridiomycota, b3. Basidiomycota, b4. Mortierellomycota, b5. Mucoromycota, b6. Blastocladiomycota, b7. Rozellomycota, b8. Aphelidiomycota, b9. Monoblepharomycota, b10. Zoopagomycota；*为0.01≤P < 0.05, **为0.001≤P < 0.01, ***为P < 0.001；横坐标表示优势菌门, 纵坐标表示环境因子；红色表示正相关, 蓝色表示负相关 图 7 土壤农药、理化性质以及微生物优势菌门的相关性分析 Fig. 7 Correlation analysis of soil pesticides, physicochemical properties and dominant microbial phyla |
通过OTUs水平构建共生网络, 以评估枸杞根区土壤细菌和真菌群落的不同共生模式(图 8).细菌和真菌网络的拓扑性质存在差异(表 2).简言之, 细菌网络图中形成了956个节点和3 060条连接, 而真菌网络中则包含400个节点和3 699条连接.虽然细菌网络图中形成的节点数要大于真菌, 但细菌网络图中的连线数量却低于真菌.与细菌相比, 真菌网络中具有更高的平均度、更低的平均路径距离和更高的正相关比例.此外, 随机移除网络中50%的节点后, 真菌的鲁棒性要高于细菌.
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不同的点表示不同的OTU, 不同的颜色表示OTU形成了不同的模块化 图 8 不同连作年限枸杞根区土壤细菌和真菌的共生网络图 Fig. 8 Co-occurrence networks of bacterial and fungal communities in root soil of L. barbarumwith different continuous cropping years |
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表 2 细菌和真菌的共生网络拓扑参数 Table 2 Topological parameters of the co-occurrence networks of bacteria and fungi |
2.6 细菌和真菌的功能预测
基于KEGG数据库, 通过PICRUSt对高通量测序数据进行分析来预测细菌群落的功能多样性(图 9).结果表明, 在第1层级中, 大多数途径与代谢(metabolism)有关, 占到了50.73%~50.99%.其次是遗传信息处理(genetic information processing)、环境信息处理(environmental information processing)和细胞过程(cellular processes), 分别占16.32%~16.52%、12.47%~13.04%和4.19%~4.31%, 而人类疾病(human diseases)和有机体系统(organismal systems)则占1%以下.在所属第1层级分类下的第2层级的子功能中, 与微生物生长代谢相关的氨基酸代谢(amino acid metabolism)、能量代谢(energy metabolism)和核苷酸代谢(nucleotide metabolism)在9a枸杞根区土壤中最为丰富, 而在15 a枸杞根区土壤中膜转运(membrance transport)相关的功能丰度要高于其他树龄.在第3层级的注释结果表明, 隶属于膜转运中的ABC转运体(ABC transporters)和转运体(transporters)基因丰度随着连作年限的增加而增加.
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图 9 不同连作年限枸杞根区土壤细菌群落的代谢功能 Fig. 9 Metabolic function prediction of bacterial communities in root soil of L. barbarumwith different continuous cropping years |
基于FunGuild对不同连作年限枸杞根区土壤真菌群落的功能进行预测(图 10).结果显示, 枸杞根区土壤真菌可以分为3种营养型, 分别为腐生营养型(saprotroph)、病理营养型(pathotroph)和共生营养型(symbiotroph), 以及6种互有交叉营养型, 分别为: 病理-腐生营养型(pathotroph-saprotroph)、病理-共生营养型(pathotroph-symbiotroph)、病理-腐生-共生营养型(pathotroph-saprotroph-symbiotroph)、腐生-共生营养型(saprotroph-symbiotroph)、病理-腐生-共生营养型(pathogen-saprotroph-symbiotroph)和腐生-病理-共生营养型(saprotroph-pathotroph-symbiotroph).其中, 以腐生营养型、病理-共生营养型、病理-腐生营养型和病理营养型为主要类型, 占到了48.78%~54.97%.进一步比较发现, 在不同连作年限的枸杞根区土壤中腐生营养型占绝对优势.此外, 连作9 a的枸杞根区土壤随着病理-共生营养型丰度的降低, 病理营养型和病理-腐生营养型丰度增加.
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图 10 不同连作年限枸杞根区土壤真菌群落的代谢功能预测 Fig. 10 Metabolic function prediction of fungal communities in root soil of L. barbarumwith different continuous cropping years |
枸杞通常生长在盐碱土壤中, pH值呈弱碱性[13].长期农药和肥料的施用、灌溉以及连续种植枸杞无法对土壤进行深翻等措施而易造成根区土壤水分含量下降, 土壤盐分增加[21].本研究结果中与土壤养分相关的AN和AK在连作9 a的枸杞根区土壤中含量显著更高, 这可能是由于连作9 a的枸杞处于旺盛生长期, 对养分的消耗量大, 但由于产量高, 为保证其高产量, 对连作9 a的枸杞田施用的化肥量也大, 丰富的营养成分也有利于微生物群落的繁殖[22].而在连作15 a的枸杞根区土壤中被检测到高的SOM含量, 推测可能与在连作15 a的枸杞根区土壤中有更多的枯枝败叶等为土壤SOM的积累提供来源有关[23].有研究表明, 连作年限的增加会影响土壤化学性质的变化, 特别是农药降解时间的延长[24].本研究结果中随着连作年限的增加, 土壤中吡虫啉和啶虫脒的残留量呈现增加的趋势, 特别是在连作15 a的枸杞根区土壤中吡虫啉显著富集, 这与长期以来吡虫啉和啶虫脒的使用, 而造成枸杞根区土壤中农药的残留有关.以往的研究也表明了农药在土壤中的残留更持久[25].
3.2 连作年限对枸杞根区土壤微生物群落结构的影响土壤微生物是影响土壤质量和肥力的重要因素, 在土壤健康生境的营造中发挥着重要的作用[26].有研究表明, 土壤微生物的多样性和丰富度能够影响土壤生态系统的功能与稳定[27].连作9 a的枸杞根区土壤中细菌、真菌的总OTU数目和特有OTU数目最高.此外, 与连作15 a的枸杞相比, 连作9 a的枸杞根区土壤中的细菌多样性和丰富度, 以及真菌丰富度显著更高, 这可能与连作9 a的枸杞具有高的生长速度和代谢活性有关, 对土壤微生物的调节和促进作用也更强.整体上, 细菌的多样性和丰度大于真菌, 这与多数的研究结果类似[28].此外, 微生物群落可以通过合作、竞争与共生等关系而在环境中形成错综复杂的生态互作网络[29].细菌和真菌的共生网络分析也表明真菌群落内部各物种间的联系更为紧密, 但真菌网络具有比细菌更低的平均路径距离, 表明真菌对连作年限的变化反应也更为敏感, 从而使它们在枸杞根区土壤中更易受到连作年限的影响[30 ~ 32].然而, 本研究中网络鲁棒性的结果表明真菌的网络稳定性高于细菌, 二者结论相反, 具体原因还有待进一步研究.
土壤微生物群落组成和微生物生物量的变化会间接影响土壤的质量[33].不同连作年限枸杞根区土壤细菌的优势门主要为变形菌门和放线菌门, 它们也是农业土壤中主要的优势菌门, 存活能力极强[34].绿弯菌门(Chloroflexi)和芽单胞菌门在连作9 a的枸杞根区土壤中的富集可归因于土壤养分水平如AP、TN和AN的增加[35].子囊菌门则是枸杞根区土壤中的绝对优势真菌门, 子囊菌门真菌的营养类型大多是腐生菌, 弱碱环境有利于其生存和繁殖, 其与担子菌门和毛霉菌门均是土壤中重要的分解者, 在促进土壤养分循环和植物生长过程中发挥着重要作用[36, 37], 连作9 a的枸杞根区土壤中丰富的营养也为它们的生存提供了必要的条件.此外, 优势细菌属和真菌属水平的富集变化也表明了连作年限能够影响微生物群落的构成, 特别是假单胞菌属、节杆菌属、放射毛霉属和木霉属等植物有害病原菌在连作15 a的枸杞根区土壤中显著富集[38, 39].
3.3 土壤理化性质、农药残留对微生物群落特征的影响土壤微生物作为土壤生态系统的重要组成部分, 土壤微生物对环境的变化是高度敏感的[40].Huang等[41]研究不同连作年限黄瓜时, 发现连作会增加土壤SOM、AK和AP等含量, 而土壤SOM、AK和AP又是影响土壤细菌群落分布的主要因素.Walder等[17]研究环境因素对土壤微生物影响时, 也发现农药残留与土壤微生物组的相关性最强, 农药残留能够改变土壤微生物组.本研究中, 长期连作显著改变了土壤TS、SOM、AN、AK和吡虫啉的含量, 而TS、SOM、AN和AK显著影响了枸杞根区土壤细菌群落的分布, 而AN则显著影响了枸杞根区土壤真菌群落的分布, 也进一步证实了土壤养分能够为微生物的生存提供助力[42].吡虫啉和变形菌门之间的显著正相关关系, 以及与未被注释到的细菌、酸杆菌门和罗兹菌门等之间的显著负相关关系, 与微生物对它们的耐受性有关.以往的研究也发现长期连作棉田的土壤微生物在吡虫啉农药残留的胁迫下, 变形菌门的相对丰度由25%增加到67%, 而酸杆菌门的占比则减少了50%, 而变形菌门对吡虫啉的强耐受性也使其成为吡虫啉农药降解的潜在菌株资源[43].但农药与微生物之间的作用是复杂的, 后续仍需要进一步深入的研究.结果提示人们, 在枸杞种植的过程中要注意把控肥料类型和用量, 也要对老龄枸杞植株进行及时的更替[44].
3.4 枸杞根际土壤细菌和真菌功能预测的分析通过KEGG数据库对细菌功能预测的分析中得到包括与代谢、遗传信息处理和环境信息处理等功能相关的第1层级, 以及和氨基酸代谢、碳水化合物代谢和能量代谢在内的第2层级, 表现了枸杞根区土壤微生物功能的丰富性.代谢功能的绝对优势地位也说明了细菌的代谢活动在枸杞根区土壤养分循环中具有积极的作用, 特别是在连作9 a的枸杞根区土壤中代谢活动更为旺盛, 连作15 a的枸杞根区土壤中低的营养供应和高的农药残留可能影响了微生物的代谢能力.连作15 a的枸杞根区土壤中与膜转运相关的基因功能丰度增加, 如ABC转运体和转运体的增加, 进而通过跨膜运输与外界环境进行物质交换, 对自身进行养分的补给[45].在连作对辣椒土壤细菌群落影响的研究中也观察到了相似的结果[46].不同连作年限枸杞根区土壤真菌群落结构的变化, 不仅会改变真菌群落自身的功能, 对枸杞根区土壤生态系统也产生影响.腐生营养型在枸杞根区土壤中的绝对优势, 可能与优势子囊菌门相关, 子囊菌门中多为腐生菌, 在土壤中能够分解难降解的有机物以促进土壤养分的不断循环利用[47].病原交叉营养型次之, 与赤霉菌属(Gibberella)等病原真菌从宿主获取营养而对作物产生病害作用[48].连作9 a的枸杞根区土壤中病理营养型和病理-腐生营养型的增加, 表明连作9 a的枸杞根区土壤有高的营养供应以及微生物代谢活动, 也可能会增加土壤中相关病原菌的活性, 提示在关注枸杞高生产力的同时也要及时做好防病虫害等措施.
4 结论(1) 枸杞连作导致枸杞根区土壤盐分积累, 显著改变了TS、SOM、AN、AK和吡虫啉的含量.
(2) 连作9 a的枸杞根区土壤中细菌和真菌的OTU数目、Alpha多样性最高；连作年限的增加也增加了变形菌门和放线菌门的相对丰度, 降低了酸杆菌门的相对丰度, 同时也增加了假单胞菌属、节杆菌属、放射毛霉属和木霉属等植物有害病原菌的富集.
(3) 土壤TS、SOM、AN和AK显著影响了枸杞根区土壤细菌群落的分布, 而AN则显著影响了枸杞根区土壤真菌群落的分布；此外, 吡虫啉与变形菌门之间存在显著性正相关关系.
(4) 枸杞根区土壤细菌的功能预测中以代谢活动为主的功能居多, 特别是连作9 a的枸杞根区土壤中, 连作年限的增加也增加了膜转运相关的基因功能丰度；真菌功能预测中腐生营养型居多, 但其功能丰度在不同连作年限中存在差异.
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