2024, Vol. 45
2. 中国科学院大学, 北京 101408;
3. 福建农林大学菌草与生态学院, 福州 350002
2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 101408, China;
3. College of JunCao Science and Ecology, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China
微生物无处不在, 其安全是生物安全的重要组成部分, 在保障环境质量、人群健康及国家安全中发挥着重要作用. 随着人们生活水平的不断提升, 对空气质量提出了更高的要求. 除空气颗粒物和重金属等污染物达标外, 人们也希望空气微生物不影响甚至有益人群健康. 空气微生物主要包括悬浮于空气中的细菌、真菌及病毒等[1], 主要来源于土壤、水体、动植物及人类皮肤和生产活动等[2]. 其物种多样性、群落结构及丰度不仅受气温、湿度、风速、紫外线强度和光照等[3, 4]气象因素影响, 同时受空气质量[5]及人为活动[6]影响.
空气微生物多样性及浓度将影响人群健康. 城市中低多样性空气微生物增加了儿童哮喘发病率[7]；有研究表明, 暴露于高浓度空气微生物环境中将增加肺癌患病几率[8]. 此外, 空气中的潜在致病微生物也将威胁人类健康. 目前大量研究表明, 空气中广泛分布着潜在致病细菌和真菌, 且得到了部分的分离培养, 证明空气是人类疾病传播的重要媒介[9, 10]. 空气微生物及潜在致病微生物严重威胁人类健康, 因此空气微生物已经成为全球环境及健康领域研究的重点, 受到越来越多关注. 然而, 目前未有研究报道空气微生物及潜在致病细菌在不同海拔的分布特征.
青藏高原地区高寒缺氧、日照辐射强、高海拔及人类活动稀少, 具有极其独特的自然地理环境的特性[11], 是世界上极为特殊的原始生境. 青藏高原地区已成为微生物生态等领域的研究热点. 先前有研究表明, 青藏高原微生物与其他地区微生物组具有显著性差异, 具有自身独特性, 是微生物的一个重要资源库[12 ~ 15]. 然而, 当前青藏高原环境微生物研究主要集中于土壤[12]、冰川冻土[13]、高寒草甸[14]和湖泊[15], 针对空气微生物的研究较少. 吴文杰等[16]针对拉萨市不同季节的微生物浓度进行研究发现, 拉萨市的微生物浓度整体低于全国其他城市, 且受空气污染物的影响. 然而他们的研究只针对空气细菌丰度, 没有对空气细菌群落分布及潜在致病菌的丰度及组成进行研究. 另外, 青藏高原地区海拔高度差较大, 人口密度和植被类型等在不同海拔地区都存在显著性差异, 将可能影响空气细菌及潜在致病菌的丰度和组成[4]. 然而, 目前仍未见关于青藏高原不同海拔地区空气细菌群落及潜在致病细菌的分布规律及差异的报道.
基于此, 本研究从西藏日喀则亚东县不同海拔采集空气颗粒物及土壤. 通过基于细菌16S rRNA基因扩增子测序技术, 对空气及土壤细菌进行了群落结构分析, 本研究目的包括：①揭示空气细菌及潜在致病菌在不同海拔的分布特征及规律；②探究不同海拔地区土壤细菌对空气细菌的贡献是否存在差异. 本研究结果以期为国家空气质量提升及污染物防控政策制定等提供重要的数据支撑.
1 材料与方法 1.1 采样点位选取我国西藏自治区日喀则地区亚东县3个不同海拔地点进行采样. 采样地点分别为：下亚东乡（XYDX, 27°25′54″N, 88°55′38″E, 低海拔, 为2 880 m）、上亚东乡（SYDX, 27°31′59″N, 88°58′58″E, 中海拔, 为3 350 m）和帕里镇（PL, 27°39′49″N, 89°04′26″E, 高海拔, 为4 300 m）. 在选定的研究区域于2021年7月选取空旷且较为平坦草地进行空气微生物及土壤样品采集.
1.2 空气微生物及土壤样品采集采用便携式大流量生物气溶胶采样器（北京鼎蓝科技有限公司, P-1000）对空气颗粒物进行收集, 步骤参见文献[17], 具体如下：将装有2 mL矿物油（Sigma）的培养皿放入采样器后进行120 m3样品采集, 仪器流速为1 m3·min-1. 样品收集完成后, 向培养皿中加入2 mL含有体积分数2%吐温-20的0.01 mol·L-1磷酸盐缓冲液, 充分混匀并尽可能将培养皿中的空气颗粒物等冲洗转移至15 mL离心管中；低温保存送至实验室后采用离心机7 000 r·min-1离心10 min, 去除上面矿物质层；将下面水层转移至2 mL离心管中, 14 000 r·min-1离心5 min, 去除上清液；收集到的颗粒物沉淀用于微生物DNA提取. 采样器距离地面1.5 m, 同一个地点每天早上09：00采用两台采样器同时进行空气微生物采样, 获得同一天同一时间段的两个重复样品. 相同操作连续采集3 d.
在采集空气样品的草地上采集土壤样品, 以探究土壤来源微生物对空气微生物的贡献. 采用“S”形取样法采集表层土壤（0~20 cm）, 每个样地采集3个重复. 样品采集之后低温保存运输至实验室后-20℃储存, 以备土壤微生物DNA提取.
1.3 空气及土壤微生物DNA提取与测序采用QIAamp® BiOstic® Bacteremia DNA Kit（QIAGEN, 德国）对空气微生物DNA进行提取；称取土壤0.25 g左右, 采用DNeasy® PowerSoil® Kit（QIAGEN, 德国）进行微生物DNA提取. 采用Nanodrop分光光度计对样品浓度及质量进行验证. 本实验中微生物DNA的D260/280和D260/230均在1.8~2.0之间, 表明DNA质量合格.
采用338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′）/806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）[18]对细菌16S rRNA基因V3-V4进行扩增. 扩增体系为50 μL：包括25 μL Premix TaqTM Mix（TaKaRa, 大连, 中国）, 0.2 μmol·L-1上游引物, 0.2 μmol·L-1下游引物, 1.0 μL DNA模板, 灭菌PCR级水. 扩增条件为：95℃预变性5 min；30个循环包括95℃变性15 s, 60℃退火1 min, 72℃延伸20 s；最终72℃延伸10 min. 本研究总计18个空气微生物样品和9个土壤样品, 其中11个空气样品的细菌16S rRNA基因V3-V4区域扩增成功, 9个土壤样品细菌16S rRNA基因V3-V4区域扩增成功（表 1）. 扩增产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳验证片段特异性, 并采用天根DNA回收试剂盒进行目的片段纯化回收. 纯化后的目的片段DNA送至广东美格基因（Magigene, 中国）科技有限公司, 采用Illumina Nova6000平台进行测序.
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表 1 空气及土壤样品采集信息 Table 1 Detail information for sampling |
1.4 测序数据及统计学分析
采用DADA2[19]对所获得的测序序列进行质控, 并去除低质量序列；采用QIIME2[20]对获得的高质量测序数据进行ASVs（amplicon sequence variants）划分（97%相似性）及细菌分类（Silva数据库）鉴定. 去除只含有1条序列的ASVs, 同时被鉴定为叶绿体和线粒体的ASVs也被去除. 剩余符合要求的ASVs用于细菌α及β多样性和群落组成分析. 微生物群落nMDS分布基于Bray-Curtis距离聚类, 且组间差异采用adonis检验进行确定. 对不用组间的ASVs进行LEfSe差异性分析, 差异倍数大于2的ASVs被认为是组间存在显著性差异的菌属, 并采用火山图进行展示. 维恩图（Venn plots）展示了空气与土壤中共享及特异性的ASVs.
使用所获得的高质量测序数据进行人类致病细菌数据库[21]比对, 与库中序列相似性高于99%（通常认为基于16S rRNA基因比对, 相似性高于99%即为一个种）且E值小于10-10的序列才被确定为潜在致病菌. 最终通过比对获得不同海拔地区空气潜在致病菌的丰度及群落组成. 本研究中的ANOVA one-way检测使用IBM SPSS Statistics 22（SPSS, Inc, Chicago, Ⅲ, U.S.A.）进行.
1.5 测序数据获取本研究所获得的细菌16S rRNA基因测序原始数据可于Science Data Bank中获得, 获取地址为https://cstr.cn/31253.11.sciencedb.10182.或https://doi.org/10.57760/sciencedb.10182.
2 结果与讨论 2.1 日喀则不同海拔地区空气细菌α多样性及来源差异本研究共获得3 132 247条细菌16S rRNA基因序列, 划分为19 589个ASVs, 其中空气中检测出1 421个ASVs, 土壤样品中检测出18 558个ASVs. 通过测序数据分析了空气细菌α多样性, 如图 1（a）所示：日喀则地区空气细菌的Chao1指数为131.9 ~ 518.9, 低于北京和厦门等地区空气细菌Chao1指数[22, 23], 这可能与日喀则地区属于高海拔地区有关. 同时, 本研究发现PL（帕里）的空气细菌Chao1指数显著低于SYDX（上亚东乡）；基于细菌Shannon指数[图 1（b）]笔者也发现空气细菌多样性在PL低于其他采样地点, 证明空气细菌多样性受海拔显著影响.
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图 1 空气及土壤微生物α多样性指数 Fig. 1 The α-diversity of bacterial communities in air and soil |
造成空气微生物多样性在海拔上的差异的原因是多方面的. 首先是微生物来源方面, 低海拔地区空气微生物的来源相对较多, 如土壤、植物、动物、水体及人类[2]；然而随着海拔升高, 比如在PL地区, 大部分为草甸, 植被类型的减少, 人类活动的减少降低了空气微生物中植物及人类来源的微生物种类, 因此, 多样性相对较低；其次高海拔地区空气中的低氧、低温及强紫外线对微生物进行了过滤, 以上不利环境因素将抑制微生物的生长和繁殖[24], 最后导致微生物多样性降低. 有大量研究表明土壤是空气微生物的重要来源, 然而本研究发现空气中有17.5% ~ 37.4%的细菌与土壤共享, 但以上共享ASVs仅占土壤细菌1.4% ~ 3.7%, 且在较高海拔地区空气与土壤共享ASVs占空气细菌的比例较低海拔地区低（图 2）, 证明大部分土壤来源的微生物在日喀则地区的空气中无法生存和繁殖, 尤其是在较高海拔地区, 如PL. 这可能与日喀则地区空气中低氧量及强紫外线有关. 氧气是好氧微生物进行物质代谢和能量代谢的基础, 氧含量将影响微生物活性及丰度. 有研究表明, 在拉萨市空气中的细菌丰度显著低于北京、新乡等其他低海拔地区[16]. 另一方面, 高强度紫外线也是日喀则地区空气细菌多样性较低, 且PL地区空气细菌多样性显著低于SYDX的原因. 太阳辐射不利于微生物的生存与繁殖, 通常与环境微生物的多样性呈显著负相关[2]；通过紫外线的有效杀菌功能, 高强度的紫外线将杀死空气中的部分微生物[24, 25], 降低空气细菌多样性.
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图 2 空气与土壤共享ASVs的维恩图 Fig. 2 Venn plots showing the shared and unique ASVs between air and soil |
Proteobacteria（变形菌门）在空气细菌群落组成中占比为84% ~ 91%, 为优势菌属[图 3（a）], 这与以前研究的结果一致[22, 26], 证明在空气微生物群落中主要的细菌门为Proteobacteria、Firmicutes和Actinobacteria. 在日喀则地区不同海拔土壤中, Proteobacteria、Firmicutes（厚壁菌门）、Actinobacteria（放线菌门）、Acidobacteria（酸杆菌门）、Bacteroidetes（拟杆菌门）及Chloroflexi（绿弯菌门）为优势菌门；Proteobacteria相对丰度随着海拔升高而显著降低, 而Firmicutes呈现相反的变化趋势[图 3（a）]. 这可能与高海拔地区牦牛的放牧有关, 由于牦牛瘤胃及粪便细菌群落中Firmicutes占主导[27]. nMDS分析也表明空气与土壤微生物群落组成存在显著性差异[图 3（b）, adonis F = 4.48, P = 0.006]. 虽然土壤是空气细菌的重要来源[28, 29], 然而空气是一个寡营养环境, 与土壤生境在理化性质及营养条件等方面存在显著性差异, 不利于细菌等微生物生存和繁殖；并且空气微生物受到太阳辐射的作用, 导致较多微生物在空气中无法生存和繁殖[2], 空气环境的选择压力导致其细菌群落组成与土壤细菌群落存在显著性差异.
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（a）细菌门水平组成；（b）基于细菌ASVs水平的nMDS分析 图 3 空气与土壤细菌群落组成及分布 Fig. 3 Community compositions and patterns of bacteria in air and soil |
不同海拔地区空气细菌科水平群落组成结果表明[图 4（a）]：空气中细菌的优势菌为Moraxellaceae（莫拉菌科, 25% ~ 43%, 相对丰度, 下同）, 其次为假单胞菌科（Pseudomonadaceae, 12% ~ 40%）和肠杆菌科（Enterobacteriaceae, 1.3% ~ 16%）；同时本研究发现空气细菌科水平在不同海拔地区存在一定差异. 通过基于ASVs的nMDS分析表明：同一地区空气细菌在不同时间存在较大的异质性, 3个地区的空气微生物群落组成不存在显著性差异[图 4（b）]；进一步通过比较两两海拔地区空气细菌群落Bray-Curtis距离发现：上亚东乡和下亚东乡两个海拔较低区域空气细菌群落相似性显著高于低海拔与高海拔地区空气细菌群落相似性[图 4（c）]. 以上证明海拔是影响空气微生物群落组成的重要因素, 空气的流通可能减弱海拔对空气微生物影响. 植物和人类活动是影响空气细菌群落组成的重要原因[4], 下亚东乡和上亚东乡虽然海拔相差500 m高度, 但是两个地区的植物类型和人口密度不存在显著性差异, 这可能是造成上亚东乡和下亚东乡两个区域空气细菌群落组成不存在显著性差异的原因之一. 另外, 空气中微生物将随着空气流动进行传播, 对不同区域空气微生物造成影响[30, 31]. 有研究表明, 风速是影响空气微生物群落组成的重要因素[32], 一方面是由于风速增大造成扬尘增多, 导致土壤来源微生物增加；另外一方面, 风速的增大将加速空气流动, 将上风向的空气微生物带至下风向区域, 造成两者之间空气微生物群落差异减弱.
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（a）细菌科水平组成；（b）基于细菌ASVs水平的nMDS分析；（c）不同海拔地区空气细菌群落组成Bray-Crtis聚类距离 图 4 不同海拔地区空气细菌组成及分布 Fig. 4 Communities and patterns of airborne bacteria along altitude |
LEfSe分析表明：3个不同海拔区域空气细菌中有些种属在相对丰度上存在显著性差异[图5（a）和5（b）]；由于较低海拔区域空气细菌群落具有更高的相似性, 因此本研究比较了较低海拔与较高海拔空气中存在显著差异的细菌, 结果表明：相对于较高海拔区域, 8个ASVs和10个ASVs在较低海拔地区分别显著升高, 比如空气中Flavobacterium属的相对丰度在较低海拔地区显著高于在较高海拔地区, 而Paludibacter和Lactobacillus属等在较高海拔地区的丰度显著高于较低海拔地区[图 5（c）]. Flavobacterium属是一类需氧型细菌, 通常适宜的生长温度为20 ~ 30℃[33]. 采样地区西藏日喀则亚东县地区温度较低, 7月白天气温为12.7℃, 不适合Flavobacterium属生长, 随着海拔的升高, 气温将进一步降低, 可能会阻碍Flavobacterium属生长, 这可能是造成Flavobacterium属在低海拔地区显著高于较高海拔地区的重要原因. 目前发现的几株Paludibacter属的细菌都是严格厌氧型细菌[34, 35], 但Lactobacillus属是兼性厌氧型细菌, 常发现于人的口腔、肠道及妇女阴道内, 目前发现的Lactobacillus属中有20%的种属于严格厌氧型细菌[36], 因此, 不同海拔区域不同氧气含量可能是造成Paludibacter和Lactobacillus属在不同海拔分布差异的重要因素. 气温和氧气含量是影响微生物生长繁殖的两个重要因素, 环境因素的改变将直接影响空气微生物群落组成, 最终造成其功能差异.
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（a）上亚东乡与下亚东乡具有显著差异（差异倍数 > 2, P < 0.05）的细菌菌属ASVs；（b）帕里与上亚东乡具有显著差异（差异倍数 > 2, P < 0.05）的细菌菌属ASVs；（c）较高海拔地区（帕里）与较低海拔地区（下亚东乡和上亚东乡）具有显著差异（差异倍数 > 2, P < 0.05）的细菌菌属ASVs 图 5 不同海拔地区存在显著性差异的空气细菌菌属 Fig. 5 Bacterial ASVs in air with significant differences among different altitudes |
通过数据库比对, 在日喀则不同海拔地区空气中共检测出78种潜在致病细菌[图 6（b）], 少于城市空气及降尘中检测到的种类[4, 37, 38]. 空气潜在致病细菌在日喀则不同海拔地区分布及相对丰度存在一定差异. 潜在致病细菌占空气总细菌比例为2.69% ~ 38.19%, 在XYDX、SXDX和PL地区的平均值依次为8.97%、16.23%和5.99%；较低海拔地区空气中的潜在致病细菌相对丰度高于较高海拔地区[图 6（a）]. 空气中潜在人类致病细菌主要来源于人体, 比如皮肤、口腔及粪便等. 研究表明城市化将增加空气[22]及水体[39, 40]等生态系统中的潜在人类致病细菌的丰度. 日喀则地区的较低海拔地区（XYDX和SYDX）的人口密度显著高于较高海拔地区, 这就导致较低海拔地区潜在致病细菌丰度高于较高海拔地区. 另外, 笔者发现在西藏日喀则地区的空气中存在较高的潜在致病细菌, 与城市室内环境[41, 42]、医院[43]及人体皮肤[41]上检测到的潜在致病细菌丰度相当, 这预示着日喀则地区空气细菌对人群健康存在一定威胁, 为空气质量的检测及相关疾病的预防提供了重要的理论及数据支撑.
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（a）潜在致病细菌占总细菌的比例；（b）潜在致病细菌在不同海拔采样地区的分布 图 6 不同海拔地区空气中存在的潜在致病细菌 Fig. 6 Potential bacterial pathogens in air along altitudes |
（1）不同海拔地区空气细菌与土壤细菌群落存在显著性差异, 较高海拔地区空气中细菌群落中与土壤细菌共享的ASVs显著低于较低海拔地区.
（2）海拔对空气细菌群落存在一定影响, 且在不同海拔地区将富集不同的空气细菌.
（3）海拔对空气中潜在致病细菌群落及相对丰度存在显著影响, 较高海拔地区空气中的潜在致病细菌显著低于较低海拔地区. 日喀则地区空气细菌存在一定潜在的人群健康风险, 需引起人们关注.
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