2024, Vol. 45
2. 浙江省农业科学院环境资源与土壤肥料研究所, 浙江省生物炭工程技术研究中心, 杭州 310021;
3. 龙游县农业农村局, 衢州 324400
, JIANG Wen-ting1 , XU You-xiang3 , LIU Yu-xue2 , LÜ Hao-hao2 , WANG Yu-ying2 , YANG Sheng-mao2 , HE Li-li2
, CAI Yan-jiang1
2. Zhejiang Engineering Research Center of Biochar, Institute of Environment Resources and Soi Fertilizer, Zhejiang Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310021, China;
3. Longyou County Agriculture and Rural Affairs Bureau, Quzhou 324400, China
目前全球气候变暖现象已是世界各国面临的重大挑战, 其对人类健康、农业种植和社会经济发展都带来了严重影响. 氧化亚氮（N2O）作为一种主要的温室气体, 其百年尺度上的全球增温潜势是CO2的265倍[1]. 除此之外, N2O还会对臭氧层造成破坏, 甚至引起更严重的气候相关问题[2]. 在所有的人类活动当中, 农业活动对氧化亚氮的贡献量最大[3], 全球农田土壤N2O排放量在2007~2016年间从0.3 Tg·a-1增加到3.3 Tg·a-1, 占总增量的82%[4]. 其中, 水稻是重要的粮食作物, 在全球分布范围广, 亚洲占比最大（90%）, 而我国是水稻种植大国, 总产量可占世界水稻的31%[5]. 因此, 水稻田作为我国重要的土壤资源, 其占地面积广, 且受稻麦轮作制度、氮肥施用等的影响, 其N2O排放占我国农田土壤N2O排放总量的22%[6], 是重要的N2O排放来源.
在稻田土壤中氮转化过程复杂且容易受到众多因素的影响, N2O可通过多种途径产生, 其中反硝化作用对N2O排放的贡献最大, 占N2O排放总量的58% ~ 99%[7]. 土壤反硝化过程是指在低氧或厌氧条件下, 硝酸盐或亚硝酸盐经过反硝化微生物将中间体NO和N2O逐步还原成N2的过程. 长期以来, 关于反硝化N2O的产生过程被认为是由细菌主导的[8], 而早在1972年研究人员就发现了真菌产生N2O的途径并逐渐认识其重要性[9]. 在反硝化途径中, 细菌能将NO3-连续还原为NO2-、NO、N2O和N2, 而真菌缺乏N2O还原酶, 因而使得反应结果终止于N2O气体[10], 这表明它可能具有生态学意义. 在现有研究中, 真菌也已被确定为各种环境（例如草地, 农业和森林土壤）中N2O产生的重要贡献者[11, 12], 且在低O2浓度和酸性条件下对土壤N2O产生的贡献大于细菌[13, 14]. Liu等[15]的最新研究就发现, 在质地为壤土和黏土的水稻田中, 真菌对N2O排放通量的贡献大于细菌. 因此, 有必要探明在稻田土壤产生N2O的过程中真菌反硝化的作用.
生物炭是生物质原料在完全厌氧或部分厌氧条件下经高温热裂解产生的一类富碳、高度芳香化和高稳定性的固体产物. 其作为一种安全、实用且很有前途的土壤改良剂, 近些年在生产和环境治理等方面的研究和应用都较多, 其能够增强氮（N）保留率, 提高土壤肥力和作物产量, 在温室气体排放的控制技术上更是受到广泛的关注[16, 17]. 根据相关Meta分析报道, 生物炭可将稻田土壤N2O排放减少近40%[18]. 一般认为, 生物炭具有发达的孔隙结构, 在施用于土壤后, 能增加土壤孔隙度, 而将N2O滞留在了土壤孔隙中[19]；在添加生物炭后, 还能通过丰富土壤有机碳含量, 提高土壤pH[20, 21], 为微生物提供生存空间和能源[22, 23]等来增加细菌反硝化的功能基因丰度和活性, 促进完全反硝化, 减少土壤N2O排放. 真菌作为重要的反硝化N2O贡献者, 在生物炭介导下也会影响其参与氮循环过程[24]. 有新近研究发现生物炭通过提高茶园土壤pH值和改变真菌群落组成, 降低了真菌丰度和对N2O的贡献[25]. 综上所述, 生物炭施加可能会降低细菌反硝化对N2O排放的贡献, 不过此状况下真菌反硝化过程以及细菌和真菌反硝化的相对贡献还尚未可知. 因此, 本研究旨在探明：①施加生物炭对稻田土壤反硝化过程N2O排放的影响；②不同生物炭施加量下, 稻田土壤细菌和真菌反硝化作用对N2O排放的相对贡献及作用机制. 本研究结果将有助于增加对生物炭施用下稻田土壤真菌反硝化产生N2O过程的了解, 对研究生物炭促进温室气体减排具有重要意义.
1 材料与方法 1.1 供试土壤土壤样品采自江苏省宜兴市的中国科学院常熟农业生态实验基地水稻田（31°07′~31°37′N, 119°31′~120°03′E）. 该区气候特征为亚热带季风气候, 年降水量1 177 mm, 年平均气温16℃. 试验田的种植模式为水稻-小麦轮作, 添加的生物炭是由水稻秸秆在500℃高温下炭化热解制成的. 供试土样选择该试验水稻田的①空白处理（BC0）：常规施肥；②低倍秸秆生物炭处理（BC1）：生物炭的施加量为每年每季2.25 t·hm-2、常规施肥；③高倍量生物炭处理（BC10）：生物炭的施加量为每年每季22.5 t·hm-2、常规施肥. 共3个处理, 每个处理有3个重复样地, 并随机区组排列. 生物炭添加试验从2010年稻季开始, 生物炭和肥料施加量根据各处理小区面积折算. 供试土样于2021年采集0~20 cm表层土壤, 用四分法混合均匀, 剔除土壤样品中植物残根和砾石等, 并过2 mm筛, 分别储存在4℃和-80℃下, 用于测量反硝化速率和DNA提取.
1.2 研究方法 1.2.1 室内培养试验试验一：为了探究不同生物炭施加量对稻田土壤反硝化过程N2O排放的影响, 通过室内密闭培养, 在抽真空后设置通入乙炔和通入氦气两个处理. 具体步骤如下：将3个供试土样分别称取相当于20 g风干土的鲜土平铺于250 mL锥形瓶中, 用KNO3（110 mg·kg-1）溶液调节含水量至土水比1∶1, 之后迅速加上瓶塞并涂704胶进行密封, 将培养瓶内上部气室抽成真空, 迅速向瓶中注入平衡于外界大气压的高纯氦气或乙炔气体（乙炔和氦气的混合气体, 乙炔的体积分数为10%）, 将所有培养瓶置于25 ℃恒温培养箱内无光培养. 在培养开始后的第6 h、第1、3、5、7、9和21 d采集培养瓶内10 mL气体以测量计算N2O浓度. 通入氦气的处理用于测定N2O排放速率, 用乙炔处理减去氦气处理产生的N2O速率计算N2的排放速率, 二者速率之和为反硝化势[26].
试验二：为了评估真菌和细菌对土壤N2O排放的相对贡献率, 设置添加不同抗生素来抑制微生物蛋白质的合成, 从而抑制细菌或真菌的活性. 具体地, 通过底物诱导呼吸抑制法（SIR）对供试土壤进行初步试验, 筛选出最佳的细菌抑制剂（链霉素）和真菌抑制剂（放线菌酮）浓度, 以防止高浓度的放线菌素对细菌和链霉素对真菌的非靶向作用. 使用葡萄糖（5mg·g-1, 以土壤计）作为碳源来刺激微生物呼吸, 并根据Laughlin等[27]描述的方法, 选择作为细菌抑制剂的链霉素（含量0、2、3和5 mg·g-1, 以土壤计）, 作为真菌抑制剂的放线菌酮（含量0、2、5和10 mg·g-1, 以土壤计）进行试验. 最后结合抑制剂加和比（IAR）来评估放线菌酮和链霉素是否发挥非靶向作用. 即：
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(1) |
式中, A为仅从葡萄糖产生的CO2；B为由葡萄糖+链霉素产生的CO2；C为由葡萄糖+放线菌酮产生的CO2；D为由葡萄糖+链霉素+放线菌酮组合后产生的CO2. 当加和比（IAR）最接近1时, 表明该抑制剂浓度组合最佳.
针对每个田间采集的土壤, 以BC0为例, 分别设置4个处理, 各处理重复3次. A：空白, 无抗生素添加；B：细菌抗生素抑制剂处理（链霉素0、2、3和5 mg·g-1）；C：真菌抗生素抑制剂处理（放线菌酮0、2、5和10 mg·g-1）；D：细菌抗生素抑制剂+真菌抗生素抑制剂处理. 将各处理葡萄糖、抑制剂均匀加入到10 g土样中（250 mL锥形瓶）后, 调节含水量至最大持水量（WHC）的60%, 并盖上带有三通阀的瓶塞, 在0~36 h内每隔4 h采集并测定瓶中顶空气体CO2浓度[28], 最后根据最接近1的抑制剂加和比（IAR）, 筛选出抑制剂最佳浓度组合.
确定放线菌酮和链霉素的合适浓度后, 针对每个处理土样进行以上4种抗生素处理的正式试验, 每个处理重复3次. 将土壤样品（相当于10 g风干土的鲜土）放入250 mL锥形瓶中, 加入2 mL抗生素溶液（2 mL蒸馏水用于空白处理）, 并将瓶子在4℃下培养过夜. 然后添加葡萄糖（5 mg·g-1）和KNO3溶液（110 mg·kg -1）到土壤中, 调节含水量至土水比1∶1. 最后抽真空并用乙炔气体（与试验一步骤一致）代替顶空空气, 以抑制N2O还原酶的活性, 于25℃培养箱无光培养. 在培养的第4、8、12、16、24和32 h采集并测量土壤N2O通量[27, 29]. 从无抗生素处理样品的N2O通量中减去添加抗生素处理样品的N2O通量来估算真菌和细菌对土壤N2O排放的相对贡献[14].
1.2.2 土壤DNA提取和定量PCR测定分别将3个处理的土样通过E.Z.N.A.® soil DNA kit（Omega Bio-tek, Norcross, GA, U.S.）说明书进行DNA的提取. 土壤总DNA质量用1%的琼脂糖凝胶电泳检测抽提, 使用NanoDrop2000（Thermo Scientific, USA）测定DNA浓度和纯度. 随后采用的是ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix（2X）定量PCR试剂（诺唯赞生物科技有限公司, 南京）, 于ABI7300型荧光定量PCR仪（Applied Biosystems, USA）对DNA样品定量分析, 并用5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物. 根据所使用的纯化质粒DNA模板生成的标准曲线来确定目的基因拷贝数. 目的基因包括：细菌nirS、nirK、nosZ和fungal nirK, 具体所使用的引物及扩增条件见表 1.
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表 1 相关功能基因及其引物序列和PCR扩增条件 Table 1 Functional genes measured in this study, their primer sequences, and PCR amplification conditions |
1.3 数据分析
N2O气体样品浓度使用配备电子捕获检测器（ECD）的气相色谱仪（安捷伦7890B, USA）及时测定. 厌氧培养的N2O排放速率和累计排放量以及N2排放速率计算公式[26, 34]如下：
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(2) |
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(3) |
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(4) |
式中, F为N2O排放速率[μg·（kg·h）-1, 以N/土壤计], ΔC为采气间隔时间前后N2O的浓度差（μg·L-1）, V为培养瓶的顶部有效空间体积（mL）, M为土壤干重（g）, Δt为培养时间（h）, T为培养时的温度（℃）. E为N2O累积排放量（μg·kg-1, 以N/土壤计）, Fi和Fi+1为在培养时间ti和ti+1时的N2O排放速率, ti+ ti+1为培养时间间隔. 用乙炔处理减去无乙炔处理产生的N2O速率计算N2的排放速率.
利用Excel整理数据, 将nirS、nirK、nosZ和fungal nirK基因的拷贝数进行对数转换, SPSS软件进行方差分析检验不同生物炭施用量对水稻土壤反硝化势、N2O排放量、理化性质以及真菌、细菌基因丰度的显著差异, 由Origin 2021绘制统计图. 为了更好地研究水稻土壤N2O排放对不同生物炭施用量的响应, 利用R语言的corrplot函数包对每种土壤真菌和细菌N2O排放贡献率、土壤理化性质以及反硝化功能基因丰度等不同指标之间进行相关性分析.
2 结果与分析 2.1 土壤理化性质与BC0处理相比, BC1和BC10处理均显著提高了稻田土壤的pH值和有机质含量（表 2）, 其中BC10处理pH（6.64）和ω（有机质）（46.0 g·kg-1）最高, 其次是BC1处理, pH和ω（有机质）分别为6.36和20.6 g·kg-1. 另外, BC10处理也显著提高了土壤的NH4+-N、TN和DOC的含量, 显著降低了土壤容重和NO3--N含量, 而BC1处理的影响并不显著.
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表 2 3种供试稻田土壤的理化性质 Table 2 Physical and chemical properties of the three tested paddy soils |
2.2 土壤反硝化N2O、N2排放速率, 反硝化势和N2O累计排放量
培养期间各处理的N2O排放速率均呈先升高后降低并趋于平稳的趋势, 在培养的第1~3 d达到峰值[图 1（a）]；各处理的N2排放速率在总体上呈现升高的趋势, 在培养的第7~9 d达到峰值[图 1（b）]. 其中BC0的N2O排放速率峰值最大[34.88 μg·（kg·h）-1], 在添加生物炭后的BC1和BC10处理N2O排放速率均很低；BC1处理有最高的N2排放速率峰值[116.47 μg·（kg·h）-1], BC10的N2排放速率峰值最低[22.36 μg·（kg·h）-1]. BC0和BC1之间的反硝化势差异不显著, 而BC10显著低于前两者[图 1（c）]. 另外, 在乙炔和氦气条件下BC10处理的N2O累计排放量均显著低于BC0[图 1（d）].
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不同小写字母表示处理之间的显著差异（P < 0.05） 图 1 各处理稻田土壤N2O、N2排放速率和反硝化势动态变化以及N2O累计排放量 Fig. 1 Dynamic changes in N2O, N2 emission rate, denitrification potential, and cumulative N2O emissions from paddy soil under different treatments |
通过不同浓度的筛选, 从表 3中可看出, 在添加不同含量的抗生素后, 3种土壤的IAR值都出现了先增长后降低的趋势, 均表现为在12 h时为最大值, 随后下降, 差异也逐渐变大. 根据表中结果显示, 在培养时间12~16 h内3种土壤均在链霉素和放线菌酮施加含量为5 mg·g-1和2 mg·g-1时IAR值最接近1, 因此选择该含量作为最佳的抗生素添加含量.
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表 3 各处理土壤在添加不同抗生素含量后的IAR比值 Table 3 IAR ratios of soil treated with different antibiotic concentrations |
3种生物炭施加量处理的稻田土壤在0~32 h培养时间内, N2O排放速率呈现升高的趋势（图 2）. 在分别添加抑制剂链霉素和放线菌酮后, 与空白相比, 均显著降低了各处理土壤的N2O排放速率, 其中添加链霉素处理比添加放线菌酮处理的N2O排放速率降低得更多.
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不同小写字母表示处理之间的显著差异（P < 0.05） 图 2 添加抗生素后各处理土壤的N2O排放速率 Fig. 2 N2O emission rate of each treated soil after adding antibiotics |
通过计算添加各抑制剂处理下土壤N2O速率的比值, 来分别反映细菌和真菌反硝化的相对贡献. 由于在12~16 h时各处理的IAR值最接近1, 因此选择12~16 h的N2O速率进行计算比较, 以更准确地量化真菌、细菌反硝化贡献. 如图 3所示, 各处理的细菌反硝化相对贡献均大于真菌；BC0处理细菌和真菌的反硝化相对贡献差异不大, BC10处理的细菌相对贡献率（62.9%）相较于BC0（50.8%）显著增加, BC10的真菌反硝化相对贡献率（37.1%）显著低于BC0（49.2%）, 这与图 2中添加链霉素后土壤N2O排放速率比添加放线菌酮更低的结果一致. 随着稻田土壤中施炭量的增加, 显著增加了细菌反硝化的相对贡献, 而降低了真菌反硝化的相对贡献.
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不同小写字母表示处理之间的显著差异（P < 0.05） 图 3 12~16 h各处理真菌和细菌反硝化相对贡献率 Fig. 3 Relative contribution rate of fungi and bacteria to denitrification after 12-16 h |
3种处理土壤的细菌nirK基因拷贝数均大于nirS、nosZ和fungal nirK基因（图 4）. BC10与BC0和BC1处理的4种基因的拷贝数均存在显著差异, 其中BC10的3种细菌反硝化功能基因拷贝数均显著高于BC0和BC1, BC0相对最低, 而BC10的真菌fungal nirK基因显著低于前两者, BC0相对最高. BC1处理除了nirK基因显著大于BC0外, 其他基因拷贝数与BC0差异不明显.
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不同小写字母表示处理之间的显著差异（P < 0.05） 图 4 不同处理土壤的细菌和真菌反硝化功能基因丰度 Fig. 4 Abundance of denitrification functional genes of bacteria and fungi in different soil treatments |
相关分析结果表明, N2O排放速率（F）与土壤fungal nirK和真菌反硝化N2O的贡献率（fungal）呈显著正相关, 与细菌反硝化N2O贡献率（bacteria）呈显著负相关（图 5）. N2O累计排放量与土壤pH呈显著负相关. 真菌贡献率与土壤pH、TN、SOM、DOC以及nirK、nirS、nosZ呈显著负相关, 与NO3--N呈显著正相关；细菌反硝化N2O的贡献率和土壤理化指标的相关性与真菌完全相反. 真菌反硝化功能基因fungal nirK与土壤理化指标间的相关性不显著, 而细菌反硝化功能基因（nirK、nirS和nosZ）与pH、TN、SOM以及DOC呈显著正相关, 与NO3--N呈显著负相关.
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1.pH, 2.TN, 3.SOM, 4.DOC, 5.AN, 6.NN, 7.nirK, 8.nirS, 9.nosZ, 10.fungal nirK, 11.fungal, 12.bacteria, 13.VN2O, 14.N2O；* 表示P < 0.05；色块表示r值, r > 0表示正相关, r < 0表示负相关 图 5 各理化指标与细菌、真菌和总反硝化之间的相关性 Fig. 5 Correlation between physical and chemical indexes and bacteria, fungi, and total denitrification |
本研究发现, 施加生物炭后稻田土壤反硝化N2O排放速率（F）和累计排放量均显著降低（图 1）, 这与以往研究的结果一致[35, 36]. 另外, 随着施炭量的增加, 真菌反硝化N2O的相对贡献率显著降低, 细菌反硝化的相对贡献率则显著增加（图 3）. 这说明相较于细菌反硝化过程, 在稻田土壤中, 生物炭的添加显著抑制真菌反硝化过程可能是降低反硝化N2O排放的重要原因. 这可能是由于在施加生物炭后改变了土壤理化性质, 影响反硝化微生物活性来达到N2O减排的作用. 本研究相关分析也发现土壤pH与细菌反硝化功能基因（nirK、nirS和nosZ）及其N2O相对贡献率呈显著正相关（图 5）, nirK、nirS和nosZ的丰度被显著提高, 这可能是生物炭因其石灰效应降低了低pH对细菌反硝化氧化亚氮还原酶合成的限制, 因此提高了土壤nosZ的丰度, 促进N2O向N2的转化, 减少反硝化N2O的产生, 从而促进细菌的完全反硝化的进行[20]. 相反, BC10显著减少了真菌fungal nirK基因丰度（图 4）, 且pH与真菌反硝化N2O的相对贡献率呈显著负相关, 说明pH对真菌反硝化N2O排放的影响可能与其基因丰度和群落生长有关[37, 38]. Rousk等[39]研究发现, 在pH 4.5~8.3之间, 随着pH值的增加, 细菌生长量增加而真菌生长量减少；Rütting等[37]也证明了酸性最强的土样（pH为4.8）其N2O排放量是pH值为5.8的约10倍, 真菌丰度也更高.
有研究发现在低氧或完全厌氧条件下, 真菌对土壤N2O产生的贡献大于细菌[14]. 生物炭具有孔隙丰富、密度低和比表面积大等特点, 在施用于土壤后显著增加了土壤容重, 提高土壤的透气性能[40], 这使真菌微生物活动受限, 从而降低了真菌反硝化过程的活性. Zhou等[41]研究也发现, 过量的O2会抑制真菌尖孢镰刀菌的反硝化活性. 相反, 细菌却更善于在多孔生物炭材料的表面繁殖[42], 王晓辉等[43]就发现添加生物炭显著增加了土壤中的nirK基因型反硝化细菌的丰度. 在本研究中这种可能性也得到qPCR数据的支持——生物炭显著降低了真菌fungal nirK基因的丰度, 提高了细菌nirK、nirS和nosZ功能基因的丰度（图 4）.
施加生物炭能显著增加土壤DOC和氮含量[44], 这与本研究的结果一致（表 2）, 且发现土壤碳氮含量与细菌nirK、nirS和nosZ功能基因丰度呈显著正相关, 但与真菌fungal nirK基因丰度的相关性不显著. 这可能是由于生物炭能为土壤微生物提供能源和栖息地, 导致真菌和细菌群落结构变化来影响反硝化过程[25, 45], 但细菌可能会比真菌更容易获得土壤的碳[46], 且高碳氮比也会影响真菌的生长[47]. Chen等[48]的发现也有助于解释这一结果, 该研究在施用麦秸生物炭2 a后增加了微酸性稻田细菌丰度, 但真菌基因丰度随群落结构的变化而降低. 另外, 生物炭是富碳固体, 能显著提高土壤DOC含量, 但其表面不稳定碳也会对微生物群落结构产生影响, 这与Farrell等[49]的研究发现一致, 生物炭处理显著降低了F∶B（真菌和细菌的磷脂脂肪酸浓度比）. 因此, 生物炭改变土壤碳氮含量可能更有利于细菌反硝化微生物的生长, 提高细菌反硝化N2O的贡献率.
此外, 硝酸盐是土壤微生物产生N2O的主要还原底物[50], 而由于生物炭具有吸附作用[51], 能通过影响参与反硝化过程底物的浓度, 减少微生物所需氮源, 在一定程度上减少N2O排放. 本研究中, BC10显著提高了土壤的NH4+-N的含量, 显著降低了NO3--N的含量, 而BC1的影响却不明显. 这可能是生物炭对NO3-的吸附量和吸附强度均低于NH4+, 导致水稻土和生物炭对NO3-的截留作用很弱, 使其含量减少[52], 从而导致反硝化过程缺乏可还原的反应底物, 限制了其向N2O的还原[53]. 综上, 本研究认为, 施用生物炭影响真菌反硝化过程的主要原因是由于其增加了土壤的透气性、pH值和碳氮含量, 使反硝化真菌的生长受到抑制, 真菌反硝化功能基因丰度降低以及微生物群落结构发生变化, 而抑制了真菌反硝化过程中NO还原为N2O, 使真菌反硝化过程N2O贡献率显著下降, 从而减少了稻田土壤反硝化N2O排放.
4 结论本研究发现稻田土壤长期生物炭添加能显著减少反硝化N2O排放, 且随着施炭量的增加显著降低了真菌反硝化N2O排放的相对贡献, 增加了细菌反硝化的相对贡献. 这可能是由于生物炭的添加改善了稻田土壤透气性, 显著提高了pH和碳氮量等理化性质, 使真菌微生物活动受限, 反硝化真菌的功能基因丰度降低, 而抑制了真菌反硝化过程, 减少NO还原为N2O的能力, 进而降低了稻田土壤反硝化N2O排放. 本研究进一步反映了真菌在土壤N2O产生中的重要作用, 可为生物炭调控真菌反硝化N2O减排提供理论基础. 另外, 在此基础上还需考虑生物炭添加对真菌群落结构影响的相关研究.
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