2024, Vol. 45
2. 广西大学生命科学与技术学院, 南宁 530005;
3. 北京市水科学技术研究院流域水环境与生态技术北京市重点实验室, 北京 100048;
4. 中国科学院生态环境研究中心水污染控制实验室, 北京 100085;
5. 中国科学院大学, 北京 100049
, XIN Yuan1,2 , ZHANG Yao-fang3
, LI Lei3 , YE Zhi-han3 , WEI Yuan-song1,4,5 , ZHANG Jun-ya1,4,5
2. College of Life Science and Technology, Guangxi University, Nanning 530005, China;
3. Beijing Key Laboratory of Watershed Water Environment and Ecological Technology, Beijing Water Science & Technology Institute, Beijing 100048, China;
4. Laboratory of Water Pollution Control Technology, Research Center for Eco-Environmental Sciences, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100085, China;
5. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China
随着我国水污染防治行动计划（水十条）的严格实施, 以及连续3个“五年计划”水专项工作的贡献, 水污染防治工作进展迅速[1], 河流污染防治中的第1个阶段即河流的黑臭问题已基本得到有效控制. 而我国污水处理厂的不断增加, 以及水污染防治工作的推进, 污水由直排变为经污水处理厂处理后通过尾水排放, C、N和P等得到大幅削减, 处理过后得到的再生水进入河流, 河流污染的防治进入了第2个阶段, 即以氮磷等无机物为主的富营养化控制阶段[2]. 目前我国河流污染治理正处在第2个阶段, 可以预见生物污染防治会是我国河流污染防治下一阶段的主要目标, 但河流中生物污染的防控仍未引起足够重视, 亟需加强相关研究.
2020年10月17日, 为了维护国家安全, 防范和应对生物安全风险, 我国颁发了《中华人民共和国生物安全法》, 并将生物安全定义为国家有效防范和应对危险生物因子（dangerous biological agents, DBAs）及相关因素威胁, 生物技术能够稳定健康发展, 人民生命健康和生态系统相对处于没有危险和不受威胁的状态, 生物领域具备维护国家安全和持续发展的能力. 生物安全法的颁布也为河流生物污染的防控指明了方向和主要管控对象. 生物因子是指动物、植物、微生物、生物毒素及其他生物活性物质[3, 4], 从微生物分子生物学的角度, 张俊亚等[5]将畜禽养殖环境中微生物类DBAs分为了核酸类（抗生素抗性基因, antibiotic resistance genes, ARGs）, 核酸 & 蛋白类（病毒）及完整细胞结构类（致病菌）. 抗生素耐药性问题已成为全球所面临的重大公共卫生安全问题之一, 据世界卫生组织（World Health Organization, WHO）估算, 到2050年, 全球每年将有1000万人的死亡同细菌耐药直接相关, 超过因癌症导致的死亡人数；新型冠状病毒（SARS-CoV-2）所带来的危害更是引起人们关于病毒在环境中行为研究的重视[6]；水体致病菌风险的管控和评估一直是水环境中生物污染防控的重点研究领域[7, 8]. WHO调查显示, 全球80%的疾病同水相关, 儿童死亡中50%是由于饮用水问题造成的. 因此, 明确水环境中DBAs的赋存特征, 对保障用水安全具有重要的研究意义.
水生环境, 包括湖泊、河流和水库, 是自然生态系统的重要组成部分[9]. 这些水体是人类饮用、灌溉、工业过程和日常活动的淡水来源. ARGs是为细菌提供抗生素耐药性的遗传元件, 其存在于水体中引起了人们对抗生素耐药性向致病菌转移的担忧[10, 11]：限制抗生素治疗的有效性并增加感染疾病的风险. 有研究发现ARGs通过多种途径入侵水生环境, 包括人类和动物废物排放、在使用抗生素的农田径流以及污水处理厂处理后排放出的废水释放[12 ~ 14], 从而威胁到生态平衡并对人类健康构成风险. 作为以核酸和蛋白质为基础的传染源, 病毒具有感染人类和生态宿主导致疾病传播的潜力[15, 16], 水传播型病毒感染对人体健康带来了重大挑战, 特别是在用于饮用、娱乐或灌溉等目的地区；病毒存在于水体中可能来源于人类活动[17], 例如污水不当处理或受污染废水排放以及动物储存库和环境污染等自然来源. 耐药致病菌具有提供增强耐药性的功能[18], 使传统的抗生素治疗无效[19], 耐药致病菌可以通过各种途径进入水体, 包括污水排放、农业径流和医疗废物直接释放, 对环境和公共健康都构成风险[20]. 河流环境中的危险生物因子研究已成为环境科学和公共卫生领域的热点[21].
北京郊区河流在补充水库和保障北京饮用水、灌溉和工业用水等各种用途的充足供水方面发挥着重要作用. 解析北京郊区河流中潜在DBAs的赋存特征对于有效管理和可持续利用该地区水资源至关重要. 本研究通过对典型北京郊区河流（牤牛河、潮河和白河）中水体和底质中ARGs、病毒群落和致病菌的赋存特征开展调查解析, 旨在助力北京市用水安全管理和为生物风险管控提供数据支撑.
1 材料与方法 1.1 采样点布置采样区域位于北京市郊区密云水库上游, 其入库支流包含潮河、白河和牤牛河等. 密云水库是我国南水北调项目中重要的“调蓄库”, 截止到2020年8月底, 已有超过5亿m3的“南水”注入密云水库. 值得注意的是, 南水北调的水质一直稳定在《地表水环境质量标准》（GB 3838-2002）Ⅱ类标准之内. 然而, 密云水库的ρ（总氮）却呈现逐年增加的趋势, 从2008年的0.72 mg·L-1上升至2019年的1.49 mg·L-1, 且约85%的总氮负荷是来自于入库支流的输入[2].
本研究于2022年5月对北京典型郊区河流牤牛河、白河和潮河进行采样, 并对典型山区河流——牤牛河开展深入调研解析, 共设置19个采样点, 其中牤牛河15个, 潮河和白河各2个. 采样点位置见图 1和表 1所示.
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图 1 北京郊区河流采样点设置 Fig. 1 Sampling sites of Beijing suburban rivers |
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表 1 北京郊区河流采样点设置及缩写 Table 1 Sampling points of Beijing suburban rivers in this study |
1.2 样品的采集和预处理 1.2.1 样品采集
在样品采集过程中, 使用取样器在靠近河道中间点水面下10~20 cm处采集0.5~2 L水体样品. 针对牤牛河部分水位较浅（< 10 cm）, 本研究直接采集表层水样；采集水样的同时采集水体底质, 如底质均为沙石则采用擦拭法采集生物膜样品.
将样品存放于干净无菌的取样袋, 并置于存有冰袋的冷藏箱中, 于当日运回实验室, 于4℃保存, 24 h内测定相关常规水质指标；样品的采集和储存按照《环境水质监测质量保证手册》（第二版）要求进行.
1.2.2 样品预处理使用抽滤设备, 取500 mL水样于0.22 μm无菌聚酯纤维膜（直径47 mm, Millipore, 天津实验设备有限公司, CHN）进行过滤, 将过滤后的滤膜剪碎保存于2 mL EP管中, 并于-80℃保存, 待DNA提取, 过滤液用于后续常规指标分析.
1.2.3 常规指标检测本研究分析测定11项常规指标, 包括：pH值、温度（T）、溶氧（DO）、总氮（TN）、氨氮（NH4+-N）、硝氮（NO3--N）、总磷（TP）、磷酸盐（PO43--P）、叶绿素a（Chl-a）、化学需氧量（COD）和总有机碳（TOC）等.
其中水温（T）、溶解氧（DO）和pH采用便携式测定仪（Multi3620IDS, WTW, 德国）现场测定, 浊度、Chl-a采用叶绿素测定仪（DS5, Hach, 美国）现场测定, TOC采用总有机碳分析仪（TOC-L, SHIMADZU, 日本）测定, 其余指标均采用国家标准方法（GB 17378.4-2007）进行分析.
1.3 DNA提取采用FastDNA SPIN Kit for soil（MP Biomedicals, USA）试剂盒进行DNA提取. 通过1%琼脂糖凝胶电泳和NanoDrop 2000对DNA提取效果进行质检和浓度测定.
1.4 宏基因组测序和生物信息学分析本研究使用HiSeq 4000平台进行文库构建（350 bp）和双末端测序（150 bp）. 在通过删除包含3个或更多不明确核苷酸的reads、超过36个碱基的质量分数低于20或有适配器污染的数据后, 获得每个样品的clean reads, 每个样本生成大约29 GB的clean reads数据, 本研究共获得555 GB原始数据.
利用耐药基因数据库（CARD, version 3.0.8）[22]和毒力因子基因（virulence factor genes, VFGs）数据库（Victors, https://phidias.us/victors/）的核心数据集, 通过diamond v0.9.22对相关基因进行基于reads的blast分析（blastx, -query-cover 75, -id 90, -evalue 1e-5）, 解析样品中的ARGs和VFGs的组成, 从而获得ARGs和致病菌类型和组分信息；通过arg_ranker进一步解析了高风险ARGs的赋存特征[23]. 通过Kraken2比对Refeq viral数据库（https://genome-idx.s3.amazonaws.com/kraken/k2_viral_20230605.tar.gz）和16S_Greengene数据库, 分别获得样品中病毒群落组成和16S rRNA信息；根据比对的reads数, 按照如下公式计算目标基因的相对丰度：
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式中, Ntarget gene-like sequence为数据库中被标注为参考序列的clean reads的个数. Lreference sequence为参考序列的序列长度. Lreadss为reads长度（150 bp）. N16S sequence为被分类为16S rRNA的reads的数目. L16S sequence为16S rRNA的平均长度[24].
对于病毒的相对丰度, 将每百万序列中检测到的病毒reads数定义为RPM（reads per million）, 同理计算16S rRNA的RPM, 然后进一步均一化获得病毒群落的相对丰度组成信息.
2 结果与分析 2.1 北京郊区河流水质状况本研究所选择北京郊区河流水质指标如表 2所示. 水样在T、DO、pH、氧化还原电位（ORP）、氮和磷水平以及有机碳含量方面表现出时空异质性. 温度的整体变化范围为6.7~22.2℃. pH值范围为7.61~8.72. ρ（DO）范围为0.78~10.79 mg·L-1. 氧化还原电位（ORP）值范围为13.33~176.5 mV. ρ（TN）为0.65~10.77 mg·L-1, 而ρ（NO3--N）值范围为0.43~8.21 mg·L-1, ρ（NH4+-N）范围为0.044~0.18 mg·L-1, 以硝态氮为主, 平均占比在90%以上. ρ（TP）范围为0.01~0.056 mg·L-1, 而ρ（PO43--P）范围为0~0.068 mg·L-1, ρ（TOC）范围为1.40~3.59 mg·L-1. 根据密云水库入库支流地表Ⅲ类水要求, 主要超标因子为TN.
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表 2 北京郊区河流水质指标1） Table 2 Water quality of the Beijing suburban rivers |
2.2 北京郊区河流ARGs的赋存特征
从北京郊区河流中共检出20个大类抗性的ARGs, 且以多重耐药（multi-drug）ARGs为主, 其在所有样品中的平均占比为74.11% ± 6.82%相对丰度前5的ARGs大类依次是氨基糖苷类（aminoglycoside）、二氨基嘧啶类（diaminopyrimidine）、大环内酯-林可酰胺-链霉素类（MLS）、利福霉素（rifamycin）和四环素（tetracycline）, 其占比分别为7.54%、3.42%、2.23%、2.13%和2.06%.
从ARGs相对丰度上来看, 牤牛河上游XTZ的ARGs相对丰度最高（图 2）, 相对于其他支流位点ARGs丰度构成极显著性差异（P < 0.01）；西台子位点的主要优势ARGs大类为多重耐药类和氨基糖苷类抗生素. 这主要是由于西台子位点靠近陈家峪村, 相对其他位点, 人口密集, 可能存在一定程度的生活污染、农业面源污染等. 其次是WM子流域, 与其他支流不同的是, WM富集了利福霉素和四环素类ARGs. KQS、KQZ中ARGs丰度水平较低, 为半城子水库位点（图 2）, 但在KQX库区下游的ARGs相对丰度显著增加（P < 0.05）, 且以MLS和氨基糖苷类ARGs为主. 然而MNQ-MNZ-MNX有着较明显的ARGs富集, 主要富集氨基糖苷类和MLS类ARGs, 表明牤牛河从半城子水库后至终点有抗生素抗性的显着富集. 对于北京不同郊区河流, 底质中的ARGs大类组成上并无显著差异, 但水体中ARGs的相对丰度表现出牤牛河显著高于潮河和白河.
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横坐标为采样地点和样品类型, d-表示底质 图 2 北京郊区河流中ARGs按抗生素类型的分布特征 Fig. 2 Distribution characteristics of ARGs by antibiotic type in rivers in suburban Beijing |
PCA结果可以看出相比于水体（图 3）, 不同支流底质中的ARGs差异较小. 底质中的ARGs的丰度显著低于水体（P < 0.05）. 但底质相比于水体中含有较高丰度的二氨基嘧啶（diaminopyrimidine）类ARGs. 值得注意的是, 北京郊区河流中底质多以砂石和砾石等为主, 表层微生物多以生物膜形式存在[25], 生物量较低, 这可能是底质中ARGs相对丰度较低的原因之一.
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图 3 北京郊区河流ARGs的PCA聚类分析 Fig. 3 PCA analysis of the ARGs in Beijing suburban rivers |
目前已知的耐药机制主要包括抗生素外排（antibiotic efflux）、减少抗生素通透性（reduced permeability to antibiotic）、抗生素失活（antibiotic inactivation）、抗生素靶位点改变（antibiotic target alteration）、抗生素靶位点保护（antibiotic target protection）和抗生素靶位点替换（antibiotic target replacement）, 从图 4可知, 北京郊区河流中主要耐药机制为抗生素外排（46.23% ± 15.76%）、靶位点替换（32.54% ± 14.62%）和酶失活（14.98% ± 7.96%）. 以半城子水库为界限, 牤牛河上游中外排泵机制ARGs在下游大幅削减, 抗生素靶位点替换类ARGs占比逐渐增加, 表现出同潮河和白河相似的组成特征, 而底质中ARGs的耐药机制组成变化较小, 并以抗生素外排和靶位点替换为主. 在SZZX位点, 抗生素外排类ARGs占比可达84.0%. 相反, 在KQS和MNX中, 抗生素失活是主要耐药机制, 在这些位点达到了32.0%. 由此可见, 半城子水库改变了牤牛河支流中ARGs的耐药机制, 大幅减少了抗生素外排泵机制类ARGs, 而靶位点替换和保护机制的ARGs丰度大幅增加或保留.
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横坐标为采样地点和样品类型, d-表示底质 图 4 北京郊区河流中ARGs耐药机制分布特征 Fig. 4 Occurrence of resistance mechanisms of ARGs in Beijing suburban rivers |
本研究从北京郊区河流中共检测到404种ARGs亚类, 平均每个样品检出67个, 在XTZ检出数最多（171个）, 表现出丰富的ARGs多样性（图 5）. ARGs亚类检出数量从上游至库区整体呈现下降趋势, 且底质中的亚类数量明显低于水体中. 北京郊区河流中占主导的AMR基因家族为耐药-结节-细胞分裂（RND）抗生素外排泵[resistance-nodulation-cell division（RND）antibiotic efflux pump]基因家族以及耐利福霉素RNA聚合酶的β亚基（rifamycin-resistant beta-subunit of RNA polymerase）（rpoB）基因家族, 其主要ARGs亚型为rsmA、mexK和rpoB（图 5）. 耐药-结节-细胞分裂（RND）抗生素外排泵是将抗生素从细胞中定向泵出以获得耐药性[26]. 阻力-结节-分裂（RND）蛋白存在于原核和真核细胞中, 具有多种底物特异性和生理作用. 然而, RND转运体相对较少, 并且它们是次级转运体, 不是通过ATP结合/水解来提供能量, 而是通过质子沿跨膜电化学梯度的移动来提供能量[27]. 利福平耐药RNA聚合酶包括氨基酸置换, 破坏利福平与其结合位点的亲和力. 这些突变通常集中在β亚单位的利福平I区域, 并且最常涉及直接与利福平进行交互的氨基酸[28]. 但是, 在该区域之外也可能发生导致耐药性的突变, 并且可能涉及不直接与利福平接触的氨基酸.
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图 5 北京郊区河流相对丰度前50亚类ARGs热图 Fig. 5 Heatmap of the occurrence of the top 50 ARGs subtypes in Beijing suburban rivers |
牤牛河上游占主导的多重耐药类ARGs和外排泵耐药类ARGs主要是rsmA和mexK, 在牤牛河下游、潮河和白河中占主导的抗生素靶位点替换类ARGs主要是rpoB. 这3种ARGs多位于染色体上, 并在多数宿主体内表现出内源抗性, 传播能力较弱, 属于低风险ARGs.
2.3 北京郊区河流中病毒群落赋存特征本研究主要是基于DNA水平开展的病毒群落研究, 所以得到的病毒菌落主要属于Duplodnaviria和Varidnaviria病毒域（Realm）. 这两个病毒域均为双链DNA（dsDNA）病毒, Duplodnaviria目前只包含1个病毒界Heunggongvirae, 而Bamfordvirae病毒界是北京郊区河流中Varidnaviria病毒域的主要成员. 隶属于Heunggongvirae的有尾噬菌体门（Uroviricota）是郊区河流中主要病毒门, 是可侵染细菌的病毒, 其能够感染细菌细胞并将它们用作宿主进行复制[29], 在病毒群落中平均占比为84.58% ± 9.73%, 而属于核质巨DNA病毒（NCLDV）的Nucleocytoviricota是Bamfordvirae的主要病毒门类, 是一种真核生物病毒, 其感染范围广泛的真核生物, 在病毒群落中平均占比为12.53% ± 9.76%.
本研究共检测到154个病毒科, 可注释到科水平的病毒reads占总病毒reads数的比例为36.04%~74.34%. 其中, d-KQX中注释到病毒科水平的比例最高（74.34%）, 而WM最低（36.04%）. 北京郊区河流中主要病毒科为蓝病毒科（Kyanoviridae）和尾病毒科（Peduoviridae）（图 6）, 平均占比为16.98% ± 8.44%和16.19% ± 10.79%, 均属于有尾噬菌体门, 为原核生物病毒, 可侵染蓝藻和其它细菌如大肠杆菌、克雷伯菌等致病菌.
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横坐标为采样地点和样品类型, d-表示底质 图 6 北京郊区河流中病毒群落科水平赋存特征 Fig. 6 Occurrence of the viral community in Beijing suburban rivers at the family level |
在经过半城子水库后, 病毒组分也发生了剧烈变化, 主要的病毒科为蓝病毒科, 且拟菌病毒科（Mimiviriae）平均占比为10.37% ± 12.68%和藻类DNA病毒科（Phycodnaviridae）平均占比为8.34% ± 6.97%, 两种病毒科在经过水库后丰度大幅增加, 这两类病毒科属于Bamfordvirae, 为真核生物病毒, Mimiviriae的主要宿主为棘阿米巴原虫（Acanthamoeba）, Phycodnaviridae是一类可侵染真核藻类的病毒, 如硅藻、绿藻等[30]. XTZ和ZLJH流域中尾病毒科占比较高, 分别占46%和43%. 拟菌病毒科在d-KQX、d-MNQ和MNQ中的占比达46%、41%和40%, 表明拟菌病毒科在水库下游大量存在, 无论是在底物还是水样中. 从病毒总丰度来看, d-KQX的病毒总丰度最高, 其次为d-KQZ, 其中优势病毒科均为感染原生生物的拟菌病毒科. 拟菌病毒科会感染原生生物, 它们是单细胞微生物[31]. 这表明在水库中下游的沉积物中, 主要的病毒是针对原生生物的病毒. 其次是BH2, 优势病毒科为自复制短尾噬菌体科（Autographiviridae）和藻类DNA病毒科. 对于牤牛河, 以半城子水库为界, 上游以细菌为宿主的尾病毒科为主, 下游逐渐转化为以藻类为宿主的蓝病毒科和以原生动物为宿主的拟菌病毒科；PCA聚类结果表明, 潮河、白河和牤牛河水体中病毒群落存在显著差异, 而底质中差异相对较小（图 7）, 且潮河和白河中存在大量以真核藻类为宿主的藻类DNA病毒科.
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图 7 北京郊区河流中病毒群落的PCA聚类分析 Fig. 7 PCA analysis of the viral community in Beijing suburban rivers |
以上结果表明, 郊区河流中病毒群落组成随支流中细菌和藻类组成的变化而变化, 对于控制藻类多样性和细菌群落组成具有重要的作用, 未检出对人体健康造成风险的病毒群落, 而更多是对生物污染控制具有一定作用的噬菌体和藻类病毒. 但值得注意的是, 本研究主要对DNA病毒开展研究, 与人和动物相关的病毒多属于RNA病毒, 而本研究采取的核酸提取方法, 并未考虑RNA病毒.
2.4 北京郊区河流中致病菌赋存特征本研究在北京郊区河流中共检测到131种致病菌毒力因子, 覆盖2个门（Proteobacteria和Actinobacteria）40个属92个种, 占主导的致病菌为脑膜炎奈瑟菌（Neisseria meningitidis）、主要感染猪并可导致人类患上布鲁氏菌病的猪布鲁氏菌（Brucella suis）、肠道沙门氏菌（Salmonella enterica）和伯克霍尔德氏菌（Burkholderia pseudomallei）等（图 8）, 平均占比分别为19.17% ± 3.63%、12.76% ± 2.88%、11.22% ± 1.95%和8.26% ± 1.84%.
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横坐标为采样地点和样品类型, d-表示底质 图 8 北京郊区河流中致病菌赋存特征 Fig. 8 Occurrence of the bacterial pathogens in Beijing suburban rivers |
其中, 几个主要的致病菌引起了特别关注：脑膜炎奈瑟菌的相对丰度在不同位点变化范围在8%~26%, 在潮河和白河中可达26.0%. 脑膜炎奈瑟菌会引起脑膜炎球菌性脑膜炎, 这是一种可能危及生命的感染, 会影响大脑和脊髓周围的膜[32]. 其次为布鲁氏菌属主要与人类的布鲁氏病（又称弯曲热）有关, 这种人畜共患病可以通过直接接触感染动物或食用被污染的动物产品传播[33]. 在北京郊区河流中, 布鲁氏菌的占比范围为6%~21%, 在牤牛河中游底质中丰度最高, 布鲁氏菌引起的布鲁氏病可以通过接触感染动物或食用被污染的动物产品传播[34]. 肠道沙门氏菌属和伯克霍尔德氏菌属的占比范围在6%~15%和3%~12%. 肠道沙门氏菌是食源性疾病的常见原因[35], 受污染的食物和水是主要的感染源, 它可引起沙门氏菌病. 而伯克氏菌是常见病原体, 其导致的疾病可以表现为局部感染、肺炎或败血症[36]. 致病菌在底质中的丰度变化与在水体中相比变化不大. 但是以半城子水库为节点, 致病菌丰度大幅削减, 但随后又逐渐增加, 这说明了水库对于致病菌丰度起到一定的削减作用.
从不同位点的致病菌相对丰度来看, 西台子和支流交汇口子流域的总致病菌相对丰度最高. 而西台子流域主要富集革兰氏阴性细菌铜绿假单胞菌属（Pseudomonas aeruginosa）, 其相对丰度达23%. 支流交汇口的致病菌丰度分布较平均, 脑膜炎奈瑟菌属占19%, 猪布鲁氏菌属占10%, 肠道沙门氏菌属占11%, 伯克霍尔德氏菌属占12%, 胸膜肺炎放线杆菌属（Actinobacillus pleuropneumoniae）占8%, 铜绿假单胞菌属占7%, 霍乱弧菌属（Vibrio cholerae）占6%. 无名支流子流域中结核杆菌属（Mycobacterium tuberculosis）达38%. PCA聚类分析表明, 与水体相比, 底质样品中的致病菌组成更为稳定（图 9）, 差异性相对水体中较小.
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图 9 北京郊区河流中致病菌的PCA聚类分析 Fig. 9 PCA analysis of pathogenic bacteria in Beijing suburban rivers |
从核酸角度出发解析DBAs, 即对北京郊区河流ARGs的赋存特征分析, 结果表明西台子地区ARGs相对丰度最高, 考虑原因可能是多种因素的综合作用, 包括农业活动[37]、污水排放[38]、人口密度和城市化程度以及环境因素等[39]. 值得注意的是牤牛河中ARGs相对丰度表现出上游显著高于下游的特点, 且半城子水库对于牤牛河上游ARGs的削减起到了关键作用, 但出库后逐渐增加, 这些都说明了半城子水库对于ARGs丰度的控制起到了一定作用.
为了明确北京郊区河流高风险ARGs的组成, 本研究进一步对鉴定到的ARGs亚类进行了风险评级. 结果表明（图 10）, 郊区河流中共发现13种高风险ARGs亚类（包括Ⅰ型和Ⅱ型）, 且占比极低, 占总ARGs的0.025% ± 0.076%. 西台子流域高风险ARGs相对丰度较高, 包含MLS类抗生素的lnuB、lnuA、ermT和ermB, 以及氨基糖苷类的aph（3'）-I, 均为I型风险ARGs. 古石峪泉子流域检出MLS类ermT, 而古石峪上游子流域检出MLS类抗生素的lnuA. 库区上游检出氨基糖苷类I型风险ARGs为aac（6'）-I, 库区中游未检出高风险亚型, 库区下游和潮河流域检出MLS类抗生素lnuB高风险亚型. 底质中除史庄子下游富集喹诺酮类抗生素qnrS亚型, 其余均未检出高风险ARGs亚型.
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横坐标为采样地点和样品类型, d-表示底质 图 10 密云水库入库支流高风险ARGs亚型分布 Fig. 10 Distribution of high-risk ARGs subtypes in tributaries of Miyun Reservoir |
从核酸和蛋白角度出发解析DBAs, 即对北京郊区河流中病毒群落的赋存特征分析, 在北京郊区河流中共检测到了154个病毒科, 主要病毒科为蓝病毒科（Kyanoviridae）和尾病毒科（Peduoviridae）, 其中蓝病毒科研究更加关注在水库、湖泊等水生生态系统中的应用, 尤其是与蓝藻水华相关的问题[40]. 而尾病毒科一般不认为是水体中主要的病毒类型, 而是在细菌感染中的研究中较为常见, 其研究主要涉及到细菌宿主的感染和生命周期等方面[41]. 进一步, 本研究发现经过半城子水库后病毒组分发生的显著变化. 该水库的存在导致了病毒组成的重大改变, 主要体现在病毒科的变化. 本研究结果显示, 蓝病毒科的丰度显著增加, 同时拟菌病毒科和藻类DNA病毒科的丰度也大幅上升. 这表明水库环境可能为这些病毒提供了更适宜的生境, 进而导致它们的显著增加. 这一变化可能与水库内的生态系统互动以及水体的生物多样性变化有关. 总体而言, 河流中病毒的赋存特征受到多种因素的影响[42], 包括病毒类型、宿主种类、水体特性以及周围环境等[43].
从完整细胞结构出发解析DBAs, 即对北京郊区河流中致病菌的赋存特征分析, 脑膜炎奈瑟菌、猪布鲁氏菌、肠道沙门氏菌和伯克霍尔德氏菌等致病菌被确定为主要的致病菌. 这些致病菌的存在可能会对人类和动物健康构成潜在威胁. 其次, 致病菌在河流中的存在和分布受到多种因素的影响, 其中包括水质、污染源、环境因素和人类活动等[44, 45]. 这些因素共同作用, 可能导致不同地点的致病菌组成和丰度差异. 值得关注的是, 脑膜炎奈瑟菌的相对丰度在不同位点间变化范围较大, 这可能与地理和环境因素有关, 这也表明需要对高丰度地区进行更密切的监测和干预, 以防止细菌传播和潜在疫情的暴发. 总体而言, 北京郊区河流中存在多种致病菌, 其分布和丰度受多种环境因素影响. 对于高丰度的致病菌, 需要特别关注并采取措施以预防其传播. 水库在控制致病菌的传播方面具有一定作用.
然而, 河流底质作为水生环境的重要组成部分, 扮演着水体生态系统的重要角色[46]. 底质的物理、化学性质以及微生物群落可能受到不同的选择压力影响, 从而导致水体和底质中抗性基因、病毒群落和致病菌都存在差异[47].
4 结论（1）北京郊区河流中共检出404种ARGs亚类, 并以多重耐药类为主, 主要的耐药机制为抗生素外排、抗生素失活和抗生素靶位点替换, 半城子水库对于牤牛河上游ARGs起到了削减作用, 且水体中ARGs丰度显著高于底质, 主要ARGs亚型为低风险的rsmA, mexK和rpoB等.
（2）北京市郊区河流中病毒群落表现出对藻类和致病菌的潜在控制作用. 牤牛河上游主要病毒为蓝病毒科（Kyanoviridae）和尾病毒科（Peduoviridae）, 可侵染蓝藻和其它细菌如大肠杆菌、克雷伯菌等致病菌. 潮河、白河及牤牛河下游主要病毒为Mimiviriae和Phycodnaviridae, 可侵染棘阿米巴原虫和真核藻类.
（3）北京市郊区河流中存在的主要潜在致病菌为脑膜炎奈瑟菌、猪布鲁氏菌、肠道沙门氏菌和伯克霍尔德氏菌等, 且半城子水库表现出对致病菌的削减作用.
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