2024, Vol. 45
2. 中国科学院城市环境研究所城市环境与健康重点实验室, 福建省流域生态重点实验室, 厦门 361021
2. Fujian Key Laboratory of Watershed Ecology, Key Laboratory of Urban Environment and Health, Institute of Urban Environment, Chinese Academy of Sciences, Xiamen 361021, China
海洋环境是指地球上广大连续的海和洋的总水域, 包括海水、溶解和悬浮于海水中的物质、海底沉积物和海洋生物. 海洋环境是生命的摇篮和人类的资源宝库. 随着人类开发海洋资源的规模日益扩大, 海洋环境已受到人类活动的一定程度的污染影响和生态破坏. 而海域带及毗连大陆的海岛等近岸海域地区往往是各类城市和乡镇的所在地, 居民的日常生活、工业生产和海洋养殖等人类活动直接对海岸带及临近的海岛的近岸海域环境产生了影响, 在一些近岸海域造成了重金属元素超标、海水富营养化和海漂塑料垃圾等环境污染问题[1, 2]. 海洋环境直接受纳了陆地的各种水体, 其中含有大量的浮游细菌、真菌和古菌等微生物, 不少微生物具有潜在的致病性, 还有一些微生物具有抗生素抗性(也称抗生素耐药性)的特点. 抗生素抗性是指细菌等微生物对抗生素产生抗性, 在此背景下抗生素杀菌抑菌的效果减小乃至失效, 微生物表现出抗生素耐药性的特点[3, 4], 鉴于抗生素抗性微生物在水环境生态中具有相对的生存和增殖优势, 抗性污染对水环境的生态健康与平衡造成了潜在的风险[5].
抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes, ARGs)作为一种环境新污染物[6], 由于其具有污染生物倍增(随着微生物繁殖而增加)和污染生物扩散(抗性基因在不同微生物间转化、转导和结合等而迁移扩散)的生物学特点[7], 近年来得到全球各地的科学家的持续关注和研究. 抗生素不仅有直接治疗疾病的作用, 而且还具有预防疾病和促进禽畜生长的作用[8], 被当作亚治疗剂和促生长剂添加在禽畜的饲料当中, 在畜牧和水产养殖行业当中是比较通行的做法[9]. 而抗生素在动物体内很难被充分吸收和利用, 抗生素大部分(约75%)未经代谢而随粪尿排出体外而进入环境中. 有研究表明, 动物粪便中含有大量的抗生素抗性基因和抗性微生物[8], 即便经过中温或者高温堆肥, 不仅仍旧能检出种类多样的抗生素残留, 而且含有抗生素抗性基因的微生物丰度仍维持在较高水平[10, 11], 以上有机肥可能促进了抗生素抗性基因在环境中的传播与扩散[12, 13], 并可能随着农产品的食物链影响人类健康[14]. 在海域带的生态环境当中, 特别是河口环境, 具有陆地与海洋的双重属性, 重金属、抗生素和氮磷等陆源污染物汇聚于此, 微生物种类繁多, 有利于抗生素抗性基因随着微生物增殖而迅速增加；此外, 抗生素抗性基因在不同种属微生物间普遍存在, 可移动遗传元件(mobile genetic elements, MGEs)通过转化、结合和转导等途径还能在不同微生物之间横向迁移扩散[15]. 在海洋环境的水体和沉积物中, 科学家不仅发现氮磷等营养元素超标[16], 而且抗生素抗性细菌和抗生素抗性基因的丰度也维持在较高水平并与人类活动显著相关[4, 17]. 因此, 海洋环境作为抗生素抗性微生物和抗生素抗性基因的污染的潜在热区, 其分布特征和潜在生态风险不容忽视.
目前基于地理环境关系的地球关键带(earth critical zone)和整体健康(one health)的科学视角, 围绕人类活动-地理环境的耦合关系, 开展环境微生物与健康研究具有重要科学意义及实践价值. 针对海岸带水体环境中的耐药微生物和抗性基因污染特征, 以及抗生素抗性基因的影响因素[17 ~ 19]已取得较多研究成果. 但是针对大陆边缘的海岛, 海湾以及海岛城市海洋环境抗生素抗性污染特征的相关研究还比较少, 尤其对于海湾型(海岛型)城市对海水抗生素抗性微生物和抗性基因影响机制尚不清楚. 因此, 本研究基于厦门岛的地理环境特点, 针对近岸海域水环境中抗生素抗性基因和微生物群落结构, 采用高通量分子生物学技术(高通量测序和高通量定量PCR)对海水中的微生物组成结构和抗生素抗性基因开展了深入研究, 全面分析近岸海域水体中微生物多样性和抗生素抗性的污染水平, 深入阐释抗生素抗性基因在厦门市近岸海域水体中的污染分布格局和影响因素. 基于本研究, 能够从抗生素抗性基因这一新污染物的角度, 为海洋环境质量综合评估和相应的生态环境政策的制定出台提供科学理论上的支撑, 具有前沿理论探索价值和新污染物管控的现实意义.
1 材料与方法 1.1 研究区域地理环境与样品采集厦门市, 别称“鹭岛”, 旧称“嘉禾屿”, 南亚热带海洋性季风气候, 位于福建省南部的海湾, 其中厦门岛的辖区湖里、思明是厦门市六区中唯独没有连接大陆的市辖区, 常住居民为200万人(2022年), 湖里区和思明区两区的城镇化率已经达到了100%；岛外的常住人口330.8万, 城镇化率84.26%. 总体上看, 厦门市的经济相对发达, 居住密度相对较高, 港口航运活动繁忙, 经济和社会活动强度比较大, 深刻改变了土地利用方式与覆盖变化, 影响了厦门岛及周边的近岸海域生态环境状况.
本研究采样沿着厦门岛顺时针方向, 根据厦门岛与大陆海岸带的相对地理位置, 兼顾河流入海口、海湾、土地利用类型和污染源等因素(XMS1~XMS8为内侧海, XMS9~XMS16看成是外侧海), 预先选定了16个采样点(图 1). 采样时间为2022年11月, 在超过日间高潮时刻约50 min, 近岸海域的海水中来自陆地和海洋的水体充分混合, 水环境样本具有较好代表性, 能够体现海湾型兼具海岛型的近岸海域水环境特征. 每个海水采样点位采集3瓶水样(1 500 mL, 无菌聚乙烯瓶), 采集完毕后立即置于4℃冷藏箱, 运回实验室进行预处理和后续实验.
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图 1 研究区域地理环境与采样点位 Fig. 1 Sampling sites near the coast of Xiamen City |
采集回实验室的新鲜海水样本, 用0.22 μm孔径的混合纤维素酯滤膜(上海半岛实业有限公司), 在负压多联过滤器(天津津腾实验设备有限公司)分别过滤0.3 L体积海水, 海水微生物负载截留于相对应的滤膜上. 获得的含有水体微生物的滤膜, 先对折压实然后后剪碎(约0.5 mm×0.5 mm), 装载入DNA提取试剂盒的破碎管(FastDNA Spin Kit, MP Bio, 美国). 滤膜上的微生物组DNA提取方法和步骤参照试剂盒的说明书进行, 2 h内完成全部样品的微生物组DNA的提取. 最后, 为了综合评估所提取获得的DNA质量和浓度, 使用微量分光光度计NanoDrop 1000(Thermo Scientific Ltd., 美国)对水体微生物DNA的浓度和纯度进行检测；浓度低于30 ng·μL-1的样品, 需重新进行提取.
微生物的高通量测序分析, 基于细菌核糖体16S rDNA基因V4-V5可变区片段, 对厦门岛近岸海域水体微生物进行了高通量测序(广州基迪奥生物科技有限公司). 测序所得到的数据用QIIME 2软件进行进一步的数据过滤、序列拼接和亲疏聚类等处理, 按照97%的相似度置信水准, 聚类比对分析并获得操作分类单元(operational taxonomic units, OTU). 根据微生物基因数据库Greengene database(V13.8版本), 依据微生物OTU涵盖的序列信息, 在不同分类水平进行物种注释, 最终对微生物组成结构进行归类和物种组成相对丰度进行量化计算分析.
1.3 常规定量PCR和抗生素抗性基因的高通量定量PCR分析常规的基因定量PCR是在Roche LightCycler 480 II仪器上实验完成. 微生物16S rDNA基因(反映细菌多少)的绝对丰度适用于评估细菌总体丰度水平. 本实验中所用的16S rDNA基因标准质粒的浓度梯度变化范围为1.65×102 ~ 1.65×108 copies·μL-1. 定量PCR实验液体反应体系：PCR体积总20 μL, Roche SYBR Master I Mix预混合试剂10 μL, 无菌超纯水7 μL, 基因上游和下游引物各1 μL, DNA模板(海水样本和标准质粒)为1 μL.
海水微生物抗生素抗性基因的分析测试在WaferGen SmartChip高通量PCR平台进行. 研究中具体选择的功能基因(抗性基因)、高通量PCR反应扩增条件及合格数据筛选分析依据先前已有研究[4, 17]. SmartChip高通量微孔芯片PCR系统平台具有测试通量高(5184微孔阵列)、加样高度自动化(MSND)和相对节约试剂耗材等的优势. 基于PCR芯片分析检测通量高的特点, 特别适用于环境微生物的功能目标基因谱集(抗生素抗性基因、病原菌基因、粪便菌示踪、毒力因子基因和重金属抗性基因)的高通量定性定量分析[17, 20 ~ 22]. 根据目标基因引物和热循环仪的特点, 定义Ct值31时为检测限. 在具体实验时, 每个样品设置了3个PCR技术重复, 当且仅当3个技术重复的Ct值都有效时, 判定该样品目标功能基因为有效检出. 抗生素抗性基因的绝对丰度(AARGs)的计算过程与方法, 根据如下公式进行：
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式中, Ct表示高通量qPCR目标基因的检测值, RARGs表示抗生素抗性基因的相对丰度, AARGs表示抗生素抗性基因的绝对丰度.
1.4 数据处理与统计在本实验与研究过程中涉及到的统计和计算, 譬如平均值和标准差等皆采用Microsft Excel 2019版本进行分析统计. 海水样品抗性基因种和丰度的显著性差异和相关性分析基于软件IBM SPSS V18.0完成. 微生物组成结构和多样性的分析主要利用R(version 3.6.3)软件的相应工具软件包进行图片绘制, 例如pheatmap包进行热图分析, cluster包进行抗性基因的聚类树分析等. 抗性基因与微生物共现性网络分析的统计数据也是采用基于R(version 3.6.3)软件来先进行详细的数据统计分析, 根据获得的统计分析结果, 然后采用软件Gephi(V 0.9.2)进行共发生网络相互关系连结(细菌之间、抗生素抗性基因之间和细菌与抗性基因之间)的可视化绘制. 文中相应的抗性基因种类和丰度的柱状图等则是由OriginLab的Origin 9进行绘制.
2 结果与分析 2.1 近岸海域水体环境抗生素抗性基因多样性高通量定量PCR结果显示(图 2), 厦门市近岸海域选定的16个点位的海水检测出ARGs种类数介于107~150种之间. 抗生素抗性基因种类数最高的前3个点位是XMS9、XMS5和XMS13, 分别为150、143和138种；抗生素抗性基因种类数最低的3个点位是XMS7、XMS12和XMS11, 分别为107、108和113种. 检测出的抗生素抗性基因按照其所对应的抗生素类型, 可以具体归类为9大类型, 具体为：氨基糖苷类(aminoglycoside)、β内酰胺类(β lactamase)、氟喹诺酮类(fluoroquinolone)、MLSB类、多重耐药类(multidrug)、磺胺类(sulfonamide)、四环素类(tetracycline)、甲氧苄啶类(trimethoprim)和万古霉素类(vancomycin). 图 2可以看出, 16个研究点位的近岸海域水体环境抗生素抗性基因种类具有很高的多样性, 多重耐药类、氨基糖苷类和β内酰胺类是厦门市近岸海域水体环境最主要的3大类抗生素抗性基因.
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图 2 抗生素抗性基因种类数 Fig. 2 Number of detected ARGs |
此外, 本研究中也检测出可插入序列、整合子、转座子和质粒等可移动遗传元件(MGEs), 其中质粒在各个点位的检出数量介于3~6种之间, 总的MGEs种类数范围则为25~34种. MGEs种类数最高的4个点位是XMS9、XMS14、XMS4和XMS2, 可移动遗传元件的种类数分别为34、33、31和31种(图 3).
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图 3 质粒与MGEs种类数 Fig. 3 Number of detected plasmids and MGEs |
根据抗生素抗性基因的高通量定量PCR和普通16S rDNA定量PCR的结果, 经过计算显示[图 4(a)], 近岸海域16个点位海洋水体环境抗生素抗性基因总丰度范围为4.96×109 ~ 1.29×1010 copies·L-1. 其中, 抗生素抗性基因丰度最高的点位是XMS9, 抗性基因丰度最低的是XMS8点位. 基于厦门岛和大陆的地理环境关系(XMS1~XMS8为内侧海, XMS9~XMS16为外侧海), 厦门市内侧海域与外侧海域的水体抗生素抗性基因丰度水平整体上呈现显著差异的分布特征(P < 0.05), PCoA分析结果显示在第一轴和第二轴对近岸海域水体抗生素丰度水平的解释量分别为58.55%和18.31%, 表明厦门市的内侧海域抗性基因与外侧海域具有不同的分布特征[图 4(b)].
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图 4 抗生素抗性基因丰度水平 Fig. 4 Absolute abundance of ARGs |
在检测出的9大类抗生素抗性基因中, 多重耐药类、氨基糖苷类和MLSB类抗性基因是丰度水平最高的前3大类抗性基因(图 5), 与抗生素抗性基因种类多样性分布特征基本一致(图 2). 其中, 多重耐药类抗性基因和可移动遗传元件(MGEs)在内侧海和外侧海在丰度上都呈现出显著差异的分布特点(P < 0.05), 而且是外侧海域水体中抗性基因的丰度高于内侧海域.
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图 5 近岸海域水体各类抗生素抗性基因的丰度水平 Fig. 5 Abundance of different ARGs and MGEs |
微生物基因组是水体环境抗生素抗性基因主要携带者, 水体微生物的种类组成与丰度水平对抗生素抗性基因有直接的影响. 厦门市近岸海域水体微生物群落组成及结构如图 6所示. 整体上看, 近岸海域内侧海和外侧海微生物群落组成分布差异显著(P < 0.05), 内侧海分布相对离散, 可能与近海岸的潜在多种污染源有关, 而外侧海各点位微生物群落种类组成的相似度更为接近, 并聚类在一起；PCoA分析显示, 在第一轴和第二轴对近岸海域水体微生物群落结构的解释量分别为27.97%和22.10%. 在门分类水平上, 相对丰度在前5的是：变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidota)、浮霉菌门(Planctomycetota)、放线菌门(Actinobacteriota)和蓝藻门(Cyanobacteria), 共占总微生物组成的88.15%. 在属分类水平上, Nautella、Candidatus、Tenacibaculum、Rubripirellula和Woeseia相对丰度前5的种属微生物在内侧海域占比为27.22%, 外侧海域占比为16.41%. 总体上看, 厦门市近岸海域内侧海和外侧海的微生物种类多样性水平相对较高.
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图 6 近岸海域水体微生物群落组成与结构 Fig. 6 Composition and structure of bacterial community near the Xiamen island |
水环境微生物与抗性基因组关系密切, 基于二维网络整体分析的视角, 采用普氏分析(procrustes analysis), 结果表明海水微生物组与抗生素抗性组有极显著的关联映射关系[图 7(a)], 具有良好的一致性(两个数据组坐标之间的偏差平方和M2 = 0.61, P = 0.002), 表明近岸海域微生物对于抗性基因的赋存和演变有着直接的密切关系. 此外, 基于普氏分析也证明了近岸海域内侧海和外侧海不仅在微生物组, 而且在抗生素抗性组的组成分布格局都呈现出显著差异的特征, 表明海洋的地理环境对海水抗生素抗性组有直接的影响.
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(a)交叉的虚、实线形成的2个坐标轴系统分别表示OTU和ARGs分布 图 7 微生物组与抗生素抗性组的整体关系和网络关系 Fig. 7 Relation and co-occurrence among microbial community and ARGs |
进一步基于微生物分类操作单元(operational taxonomic units, OTU), 选用共现性网络分析(co-occurrence network analysis)的方法, 在OTU的分类角度深入探究了微生物与抗生素抗性基因的共现性特征与规律, 识别发现了共有22种细菌是相应16种抗生素抗性基因的携带者[图 7(b)]. 譬如, czcA基因在海水环境中可能具有6种微生物携带者, 细菌OTU000415是mexA和vanA基因的潜在宿主；细菌OTU000419可能同时含有OXY-1抗性基因和IS6100插入序列元件. 共现性网络分析结果表明, 抗生素抗性基因与微生物群落结构和可移动遗传元件关系在整体上紧密相关[图 7(b)].
3 讨论 3.1 厦门市近岸海域抗生素抗性基因的分布格局厦门岛近岸海域的水体环境在各个点位检测到了107~150种抗生素抗性基因, 总计检出187种抗性基因, 抗生素抗性基因平均检出率为76.1%；可移动遗传元件在各个点位检测出的种类数则为25~34种；近岸海域的抗生素抗性基因丰度介于4.96×109 ~ 1.29×1010 copies·L-1. 其中, 抗生素抗性基因丰度最高的点位是XMS9(南端), 抗性基因丰度最低的是XMS8点位(北端, 靠近大陆, 海水淡水充分混合稀释). XMS8点位抗生素抗性基因丰度水平与厦门滨海湿地水体抗性基因的相关研究比较接近[7], 表明内侧海域水体与厦门滨海湿地水环境抗性基因分布特征比较相似. 根据厦门市近岸海域研究地理环境特点, 可以将研究区域分成2个部分, XMS1~XMS8可以归为内侧海域, XMS9~XMS16则是外侧海域, 内侧海域与外侧海域抗生素抗性基因在种类数和丰度水平整体上都有显著差异. 进一步用抗生素抗性基因和可移动遗传元件丰度的聚类热图来探究抗性基因分布组成差异和相互之间的关系(图 8). 结果显示, 抗生素抗性基因总体上聚类成2簇(图 8的左侧纵轴), 颜色鲜红的这一簇, 基因丰度整体上较高, 内侧海域抗性基因丰度显著低于外侧海域, 氨基糖苷类、多重耐药类和总抗生素抗性基因关系密切, 并与可移动遗传元件(MGEs)显著相关, 表明氨基糖苷类、多重耐药类抗性基因在海水环境中可能存在着高频率的水平基因转移现象, 通过转化、转导和结合等方式, 抗生素抗性基因在不同种属的微生物中迁移并随微生物自身种增殖不断传播扩散开来[9, 23]. 颜色比较淡的另一簇(图 8的红色区域下方), 各类抗生素抗性基因和可移动基因元件的丰度水平低于上述的第一簇, 其中MLSB类、β内酰胺类、四环素类和氟喹诺酮类抗性基因的丰度维持在一定丰度数量, 并且内侧海域与外侧海域之间没有显著差异；其它类的抗生素抗性基因和可移动基因元件之间在相对较低的丰度水平上也显示出紧密的聚类关系. 总的来说, 厦门市近岸海域水环境中抗生素抗性基因呈现出种类多样、丰度较高和基因相互紧密关联的分布格局.
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图 8 基于ARGs和MGEs丰度的聚类热图分析 Fig. 8 Clustering heatmap showing the relationship of ARGs and MGEs |
针对近岸海域抗生素抗性基因的分布赋存和演变特征, 采用冗余分析(redundancy analysis, RDA)来进一步量化分析并从整体角度阐释抗生素抗性基因的潜在影响因子(图 9). 图 9(a)可以看出外侧海域抗生素抗性基因聚类在相对较小的区域内, 并且与细菌Marivivens和一些未知的微生物相关, 表明一些未知微生物和环境因素对外侧海域抗生素抗性基因的影响比较大；而内侧海域, 水体环境抗生素抗性基因与Nautella、Candidatus、Tenacibaculum、Rubripirellula、Woeseia、NS5_marine_group和Leisingera这7种属水平的微生物显著相关. 此外有研究证明, 抗生素抗性基因在海洋噬菌体中也普遍存在[24]. 因此, 本研究认为海洋中包括细菌在内的各种微生物群落是抗生素抗性基因赋存的重要影响因素, 这也与已有的研究结论一致[15, 25, 26]. 此外, 进一步采用方差分解分析(variance partitioning analysis, VPA)对驱动海水抗生素抗性基因的动态变化驱动机制进行量化分析. 图 9(b)显示, 可移动遗传元件(MGEs)对抗生素抗性基因变化的解释量达到了53.8%, 微生物群落能够解释13.8%的变化量, 上述两者之间还能够另外共同解释海水抗生素抗性基因变动的26.3%, 而未知因素仅占6.1%, 这个结果表明海水环境中可能存在着高频的抗生素抗性基因迁移交流的现象(不同物种微生物之间), 水平基因转移(HGT)成为厦门市近海岸抗生素抗性基因变化的最主要驱动力. 此外, 海水微生物群落是各种功能基因的主要载体或携带者[27, 28], 也是抗生素抗性基因种类和丰度变化的一个重要影响因子. 因此, 海水微生物本身的增殖扩增过程和水平基因转移机制, 共同塑造了厦门市近海岸水环境抗生素抗性基因的赋存特征和演变传播机制.
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图 9 抗性基因的影响因子RDA分析和抗性基因变化的解释量VPA分析 Fig. 9 Redundancy analysis and variance partitioning analysis for alterations of ARGs |
(1) 高通量定量PCR技术显示, 近岸海域水体环境总共检测出187种抗生素抗性基因, 丰度水平高达1.29×1010 copies·L-1, 多重耐药类、氨基糖苷类和β内酰胺类是厦门市近岸海域水体环境最主要的3大类抗生素抗性基因, 抗生素抗性基因这一新污染物呈现出丰度较高、种类多样以及普遍共存的特点, 近岸海域水环境是抗生素抗性基因分布的重要热区和储存库.
(2) Nautella、Candidatus、Tenacibaculum、Rubripirellula和Woeseia等22种微生物是16种抗生素抗性基因的潜在携带者, 可移动遗传元件(MGEs)和微生物群落结构对近岸海域水体环境抗性基因变化的综合解释量达到了93.9%, 微生物群落和可移动遗传元件是近岸海域水体抗生素抗性基因赋存和演化最重要的驱动力.
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