2024, Vol. 45
氧化亚氮（N2O）和一氧化氮（NO）是大气中的两种痕量气体, 对全球气候变化有重要影响[1]. 其中N2O是一种强效温室气体（GHG）, 在100 a的尺度上, 增温潜力是二氧化碳的298倍, N2O还是平流层臭氧的主要消耗物质[2]. 而NO则会破坏对流层臭氧, 参与酸雨的形成, 对人类健康产生不利影响[3]. 农业土壤是人为产生的N2O和NO重要来源. 农业生产过程中, 由于投入大量的氮肥, 导致N2O和NO排放约占土壤总排放量的52%和10%[4]. 因此, 为了缓解农业温室气体排放, 减少氮肥施用引起的氮氧化物排放应该成为优先考虑的工作[5].
果园土壤是农业氮氧化物（N2O和NO）排放的热点区域. 在过去30年里, 中国果园种植面积从518万hm2增加到1 266万hm2. 统计表明, 中国的水果氮素投入占全国农作物氮素总投入的16.24%[6]. 有调查研究表明, 中国果园的年平均氮肥投入量为（以N计, 下同）550 kg·hm-2, 远远超过150 ~ 250 kg·hm-2的推荐施氮量[7, 8]. 果园种植面积的快速扩张和每年过量氮肥投入可能引起果园大量氮氧化物排放. 荟萃分析发现, 2000年全年中国果园的N2O直接排放量为（以N计, 下同）32 ~ 49 Gg·a-1, 约占旱地排放的14%[9]. 有研究表明, 化学氮肥的应用是中国水果生产中最大的温室气体来源[10]. 因此, 针对果园高氮投入引起的氮氧化物排放制定有效的缓解方案变得十分迫切.
在农业管理过程中, 有机肥替代化肥被视为一种提高土壤肥力和缓解环境恶化的可持续措施[11]. 有机肥施入土壤后, 可以调节土壤无机氮和有机碳的生物可利用性[12]. 通常情况下, 有机肥施用后会通过提供易分解的有机碳刺激微生物呼吸, 加剧了氧气消耗, 从而促进了反硝化和N2O产生的厌氧条件[13, 14]. 然而, 有机肥对果园N2O和NO排放的影响并不一致, 可能是促进、抑制或无影响[15, 16]. 目前, 缺乏对果园施用有机肥对N2O排放影响机制的评估.
近来, 自然丰度稳定同位素技术被用于了解N2O产生和还原的多种微生物途径[17]. 先前对N2O产生和还原途径的研究主要依赖于乙炔抑制和同位素标记技术[18]. 以上方法存在局限性, 例如标记物和抑制剂扩散不均匀、土壤存在系统干扰以及需要长期监测等[19]. 最近, 有研究提出了一种使用δ18O（N2O/H2O）vs. δ15NSP双同位素混合模型, 该模型对土壤N2O产生和还原过程中4个主要微生物过程贡献的δ18O（N2O/H2O）和δ15NSP进行了总结[20, 21]. 以上发现为研究果园中施用有机肥对N2O产生和还原的微生物过程的影响提供了理论依据.
本文以苏南地区桃园作为研究对象, 通过原位观测探究有机肥部分替代化肥对果园N2O和NO排放的影响, 并利用乙炔抑制剂法和同位素特征值法评估了果园土壤N2O排放的主要微生物过程的贡献. 本研究通过推广和使用有机肥替代作为化肥多元替代技术提供科学参考, 旨在助力我国果园低碳绿色发展.
1 材料与方法 1.1 研究区概况2020年11月至2021年11月在江苏典型桃园开展田间试验, 试验点位于句容市山乡缘家庭农场（119.14°E, 31.97°N）, 气候属于亚热带季风气候. 年平均气温为16.2℃, 年平均降水量为1 192 mm（https://data.cma.cn/en）. 试验点土壤被归类为Fluvisols[22]. 桃园土壤初始pH值为6.3（水土比为2.5∶1）, 土壤容重为1.30 g·cm-3, 土壤ω（总碳）为9.25 g·kg-1, ω（总氮）为0.86 g·kg-1.
1.2 试验设计果园桃树于2015年种植, 果树行距为4 m, 种植密度为625棵·hm-2. 试验共设置3个处理：单施化肥处理（CF）, 有机肥部分替代化肥处理（COF, 30%有机肥替代）和不施肥处理（CK）. 化肥为N∶P2O5∶K2O = 15∶15∶15, 有机肥为牛粪发酵, 其碳氮比（C/N值）为13. 所有处理按照完全随机区组布置, 每个田块的面积为16 m2（3个重复）. 根据当地的管理, 按照离树根0.70 m的环形沟施肥. 桃园的年总氮投入为（以N计）300 kg·hm-2. 复合肥分3次施用, 2020年12月3日施用基肥, 2021年的3月16日和5月16日施用两次追肥. COF处理的有机肥在基肥和第一次追肥施用. 补充COF和CK处理中的磷和钾使其与CF处理一致.
1.3 气体样品采集与测定在整个试验过程中, 采用静态暗箱法每周采集一次气体样品, 用于测定N2O和NO的排放通量[23]. 当施用氮肥时, 加密采样以捕捉氮氧化物脉冲排放. 由于新冠病毒疫情管控, 2021年的1月25日至3月4日和7月26日至8月26日两段时间未采样. 在每个小区的土壤中安装一个永久性的正三角形PVC底座（边长为0.40 m, 高0.20 m）. 将0.40m高的三角形采样室放在底座上, 将采样室插入采样室底座上端的水槽. 采样室覆盖了一层隔热膜, 以减少空气温度的变化. 每个底座采集4个气体样品（1.5 L）, 24 h内送到气相实验室测定气体样品浓度. 气体样品中N2O的浓度使用改进的气相色谱仪（Agilent 7890A）进行分析. NO浓度用42i型化学发光NO-NO2-NOx分析仪（thermo environmental instruments）进行分析. 施氮引起的N2O和NO的直接排放系数（EF）通过施肥和未施肥处理的总排放量之差除以施氮量计算[2]. 该公式如下：
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(1) |
式中, EN和E0分别为施肥处理和非施肥处理的累计N2O或NO排放量（以N计, 下同, kg·hm-2）；Nfer为施肥的总氮量（kg·hm-2）.
1.4 土壤理化性质在气体采样的同时, 用手持温度计和MPM 160含水率仪记录采样点10 cm深度的土壤温度和体积含水量. 气温和降水数据由试验区附近的原位自动气象站收集. 在整个实验过程中, 每两周采集一次0 ~ 10 cm的土壤样品, 用2 mm的网筛进行筛分, 储存起来用于测定物理化学特性和微生物定量分析. 假设土壤颗粒密度为2.65 g·cm-3, 土壤孔隙含水率（WFPS）表示为土壤体积含水量与总孔隙度的测量比例. 分别使用pH电极（PHS-3C）在土水比为1∶2.5（质量浓度）的情况下分析土壤pH. 使用流动分析仪（auto-analyzer 3）测定2 mol·L-1 KCl提取液中的NH4+-N和NO3--N浓度.
1.5 DNA提取和实时定量PCR（qPCR）基因分析采用DNeasy Power土壤试剂盒提取约0.25g新鲜土壤中的微生物DNA. 通过琼脂糖凝胶电泳确定基因组DNA的完整性, 使用赛默飞Nanodrop 2000分光光度计检测DNA样品浓度, 若浓度过高则需进行稀释. DNA样品通过实时定量PCR（3个重复）测定氨氧化古菌（AOA）和细菌（AOB）、反硝化基因（nirS、nirK、nosZ⁃I和nosZ⁃II）的拷贝数. 多聚酶链式反应使用StepOnePlusTM实时PCR系统（ABI, 美国）在96孔板中进行. 每个孔中20 μL的qPCR反应体系包含2 μL模板DNA, 6.8 μL无菌水, 0.4 μL ROX参考染料, 0.4 μL正向和反向引物（10 μmol·L-1）以及10 μLSYBR@ Premix Ex Taq. 笔者课题组先前研究描述了基因特异性引物和qPCR循环热条件[24]. 实时定量PCR结束时对熔解曲线分析以确认PCR产物的特异性. 所有基因的扩增效率范围在90% ~ 95%之间, 标准曲线R2值在0.990 ~ 0.998之间.
1.6 同位素分析和N2O来源划分自然丰度的N2O同位素分析通常被用来估算来自特定途径的可能贡献率[25]. 前人研究发现果园的N2O排放主要集中在第二次追肥后的春夏季, 这个时期贡献了全年大部分的N2O排放[9, 26]. 因此, 选择第二次追肥后田间试验采集的2021年5月18日气体样品用于N2O同位素特征分析. 气体样品和空气的N2O同位素特征通过中国农业科学院农业环境与可持续发展研究所的IRMS同位素比值质谱仪（IRMS, Isoprime100）分析确定. δ18O和δ15NSP同位素特征分别使用维也纳标准水（VSMOW）和大气中的N2作为标准物进行测定, 测定结果的扰动因子和校正原则参考文献[27]. 其中δ15Nbulk、δ15Nα和δ15Nβ分别表示N2O中15N在整体、α位和β位水平上的同位素特征值, N2O同位素特征值δ15Nβ和δ15NSP值的计算见式（2）和式（3）.
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(2) |
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通过气体样品和环境空气双组分的总同位素特征值计算土壤排放的N2O同位素特征值（δ15N、δ18O或δ15NSP）.
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(4) |
式中, δ和C分别为环境和样品空气中N2O的同位素特征值和浓度, 其下标分别为样品和环境空气. 田间环境空气中的ρ（N2O）为（271.86 ± 7.41）μg·L-1, 当密闭结束时顶空N2O浓度小于环境空气浓度时, N2O的同位素特征值不计算.
土壤N2O排放的4个主要微生物过程包括：硝化作用（Ni）、真菌反硝化作用（fD）、细菌反硝化作用（bD）和硝化细菌反硝化作用（nD）[28]. 前人研究提出利用δ18O（N2O/H2O）vs. δ15NSP双同位素法量化N2O排放中4个主要微生物过程的贡献[20]. 根据SP和δ18O的差异, 4个微生物过程可以分成两大部分来量化微生物过程的贡献和N2O的还原程度[29]. 在估算过程中把δ15NSP和δ18O值相似且较高的Ni和fD两个过程视为Ni/fD, 而把δ15NSP和δ18O值较低且相似的nD和bD两个过程视为nD/bD. 为了评估Ni/fD和nD/bD过程对土壤N2O排放的贡献, 同时考虑到N2O还原的发生, 依据以下公式进行计算[28]
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式中, X为Ni/fD微生物过程对总N2O产生的贡献；ηr为与N2O还原相关的净同位素效应；Fr为N2O还原程度, 用N2/（N2O + N2）的值表示；δNi/fD和δnD/bD分别为Ni/fD和nD/bD的同位素特征值（δ15NSP和δ18O）；1- Fr为未还原的N2O分数（即rN2O）, 用N2O/（N2O + N2）的值表示.
1.7 硝化潜势和反硝化潜势评估根据改良的摇动泥浆法来评估3次施肥时期和夏季高温多雨（2021年6月21日）采集的土壤自养和异养硝化作用产生N2O的潜力[28]. 为田间CK、CF和COF处理的土壤样品设置以下处理：对照（不添加抑制剂）、乙炔（288 μL, 6 μmol·L-1）和1-辛炔（2.6 mL, 4 μmol·L-1）. 将相当于3 g干重的新鲜过筛土样放入120 mL的血清瓶中, 并加入20 mL含有1.0 mmol·L-1 NH4+的磷酸盐缓冲液（pH = 7.0）, 最大限度地提高硝化作用. 然后在温控摇床上以200 r·min-1的速度摇动, 在25℃下通气培养2 h, 然后密闭培养22 h. 使用10% 乙炔作为硝化抑制剂, 以区分自养和异养硝化过程对N2O产生的相对贡献, 1-辛炔作为差异抑制剂用于区分AOA和AOB的贡献. 通过采集2 h和24 h血清瓶的顶空气体样品, 来计算N2O累积排放量.
通过使用乙炔抑制法, 评估土壤潜在的反硝化作用[30]. 经过一些修改后, 对3次施肥时期和夏季高温多雨（2021年6月21日）采集的土壤样品进行评估. 对于每个样品, 两个25 mL的血清瓶称有相当于3 g干土重的过筛鲜土（10目筛网）, 加入3 mL的底物（由硝酸钾、琥珀酸、葡萄糖和乙酸配制而成）并抽真空, 最后分别加入26 mL的氮气或10%的乙炔气体. 将血清瓶置于25℃的黑暗环境的温控摇床中培养5 h, 并以200 r·min-1的速度摇动. 培养结束后采集气体样品, 使用气相色谱仪（Agilent 7890A）进行分析. 两个血清瓶分别用于测定潜在的反硝化作用和潜在的N2O产生量. 通过计算确定每个血清瓶中N2O累积排放量, 并计算出土样反硝化最终产物比.
1.8 数据处理本实验结果以平均值±标准误差（mean ± SE, n = 3）的形式给出. N2O和NO的年度累计排放量通过对测量的排放通量之间的时间间隔应用梯形规则近似计算, 并考虑了施肥点和未施肥点对整个小区排放的影响. 土壤理化性质和微生物功能基因对N2O和NO排放的影响通过Pearson相关系数进行表征. 所有数据均采用R version 4.1.2进行分析和绘图.
2 结果与分析 2.1 环境因子的动态变化在整个原位观测期内土壤温度变化范围为2 ~ 26.7℃（均值：14.80℃）, 最高温度出现在2021年9月（图 1）. 桃园灌溉方式为雨养, 土壤WFPS范围为15.3% ~ 89.1%（均值：53.4%）. 所有处理的WFPS动态一致, 分析显示不同处理的WFPS无显著差异. 施氮处理导致土壤pH值升高, 而有机肥部分替代化肥能减缓这种效应. 其中CK、CF和COF这3种处理的pH均值分别为6.71 ± 0.05、6.94 ± 0.05和6.86 ± 0.08.
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图 1 桃园不同施肥处理土壤理化因子的动态变化 Fig. 1 Dynamics of soil physicochemical factors in peach orchards under different fertilization treatments |
施用氮肥显著提高了土壤NH4+-N和NO3--N含量, 其中单施化肥后土壤矿质氮含量高于有机肥部分替代化肥处理（图 1）. 在整个试验期内, CK、CF和COF这3种处理的土壤ω（NH4+-N）均值分别为（16.96 ± 5.10）、（170.40 ± 32.43）和（143.88 ± 25.40）mg·kg-1, 土壤ω（NO3--N）均值分别为（8.84 ± 1.85）、（87.69 ± 25.86）和（59.28 ± 17.90）mg·kg-1. 相较于CK处理, CF和COF处理的土壤NH4+-N含量分别增加了7.49倍和6.05倍, NO3--N含量分别增加了8.81倍和5.12倍.
2.2 N2O和NO通量与累计排放量整个观测期内, 施肥处理N2O排放在时间和空间上都有很大的变化, 但施肥处理具有相似的季节性排放模式（图 2）. 冬季施肥前, 所有处理N2O排放都处于较低水平, 约为（以N计, 下同）1.76 g·（hm2·d）-1. 施氮处理CF和COF排放量较高且具有可比性的排放主要受施肥事件和夏季降雨的影响, 而CK处理的N2O排放通量一直较低. 结果表明, CK、CF和COF这3个处理春季和夏季N2O排放分别占各自年排放量的43.1%、75.4%和69.9%. 从图 2中观察发现, 春季COF处理N2O排放高于单施化肥的CF处理, 而夏季CF处理的N2O排放要远高于COF处理. 夏季的追肥和降雨事件后, CF处理的N2O脉冲排放高达2 636.47 μg·（m2·h）-1, 而同一时间COF处理仅为310.09 μg·（m2·h）-1（图 2）. CK、CF和COF这3种处理的N2O平均排放通量分别为23.06、76.14和64.73 μg·（m2·h）-1.
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黑色箭头表示3次施肥事件, 灰色条带表示由于新冠疫情管控未采样 图 2 桃园不同施肥处理下N2O和NO的季节性通量 Fig. 2 Seasonal fluxes of N2O and NO under different fertilization treatments in peach orchards |
施用氮肥显著增加桃园土壤的N2O排放. CF和COF处理的N2O排放通量是CK处理的3.30倍和2.81倍. COF处理能降低氮肥施用引起的N2O排放, 比单施化肥减少了15.0% N2O排放, 使得排放系数（EF-N2O）降低了21.3%（表 1）. 相关性分析表明, 桃园N2O排放与土壤pH呈显著正相关关系（P < 0.01）, 与土壤温度、WFPS、NH4+-N含量和NO3--N含量呈极显著正相关关系（P < 0.001）. 另外N2O排放还与AOA基因丰度、AOA/AOB值呈显著负相关（P < 0.05）, 与nosZ-Ⅱ基因丰度成极显著负相关（P < 0.001）（图 3）.
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表 1 不同施肥处理N2O、NO和（N2O+NO）的累积排放量和排放系数（EF）1） Table 1 Cumulative emissions and emission factors (EF) for N2O, NO, and (N2O+NO) under different fertilization treatments |
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*、** 和*** 分别表示在P < 0.05、0.01和0.001时具有统计学意义, A/B为AOA/AOB, （K+S）/Z为（nirK+nirS）/（nosZ-I+nosZ-II） 图 3 N2O、NO和（N2O+NO）通量与土壤理化性质和与氮循环相关功能基因的相关性 Fig. 3 Correlation of N2O, NO, and (N2O+NO) fluxes with soil physicochemical properties and functional genes associated with the nitrogen cycle |
NO与N2O具有相似的排放动态模式, 呈秋冬季节低、春夏季节高. 相较于CK对照, 施用氮肥促进了NO排放. 通过计算累计排放量, CF和COF处理NO排放相较于未施肥的CK处理分别增加了95.0%和76.7%. 其中春夏季节CK、CF和COF处理的NO排放分别占全年排放的82.0%、62.7%和64.7%. 相较于单施化肥, 使用有机肥部分替代能够减少约9.4%的NO排放. CK、CF和COF这3种处理的NO平均排放通量分别为6.85、13.36和12.10 μg·（m2·h）-1. 氮肥引起的EF-NO分别为0.19% 和0.15%, COF处理比CF处理EF-NO降低了21.1%（表 1）. 季节性NO通量与NO3--N含量和pH呈显著正相关（P < 0.01）, 与NH4+-N含量和土壤温度呈极显著正相关（P < 0.001）. 但NO通量与AOA丰度和AOA/AOB值呈极显著负相关（P < 0.001）（图 3）.
2.3 氮循环功能基因丰度通过实时定量PCR技术测定与氮循环相关功能基因的丰度. 图 4为氮循环中影响土壤氮氧化物排放的关键功能基因丰度, 分别测定了3次施肥事件和夏季6月21日的土壤样品. 结果显示不同处理之间的功能基因丰度存在一定差异. 硝化功能基因中, 氮肥的施用提高了AOA和AOB的基因丰度. 对比不同时期, 3个处理的AOA基因丰度均呈现下降趋势. 相比CF处理, 施用有机肥的COF处理提高了AOA和AOB的丰度, 并且COF处理的AOA/AOB值也要大于CF处理. AOA和AOB基因丰度对施用氮肥的不同响应表明, 氮肥主要通过增加土壤中AOB基因丰度来刺激与硝化相关的N2O排放. 反硝化功能基因中, 除了nosZ-Ⅱ基因外, 两个施氮处理均提高了其他功能基因的丰度. 相比单施化肥的CF处理, COF处理中有机肥添加降低了nosZ-I和nosZ-Ⅱ丰度, 但提高了nirK和nirS的丰度. 与其他处理相比, 最高的nirK、nirS和nosZ-Ⅱ基因丰度均出现在CF处理中, 化肥的施用有增加反硝化功能基因丰度的趋势.
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图 4 4个时期不同施肥处理中与氮循环相关的功能基因丰度 Fig. 4 Abundance of functional genes associated with the nitrogen cycle in different fertilizer treatments at four different time periods |
δ18O（N2O/H2O）vs. δ15NSP模型是分析N2O的产生和还原过程的有效方法, 应用于本研究来区分硝化作用/真菌反硝化（Ni/fD）和硝化细菌反硝化/细菌反硝化（bD/nD）. 经第二次追肥后, N2O呈现脉冲排放, 且30 d内的N2O排放量占全年累计排放量的27.7%, 因此, 采用2021年5月18日（第二次追肥）的气体样品进行N2O同位素特征分析. 如双同位素图所示, CF和COF处理可能涉及复杂的过程, 两个处理的同位素δ都来自于硝化和反硝化的混合区域[图 5（a）]. CF处理的N2O同位素特征值的位置更接近Ni/fD, 而COF处理的同位素特征值则更接近bD/nD. 这表明, 有机肥的部分替代可能改变不同微生物过程对N2O产生的贡献. 根据式（5）计算了硝化作用和N2O还原程度（Fr）的贡献率. 基于双同位素混合模型的源分配结果表明, 硝化细菌反硝化/细菌反硝化（bD/nD）是桃园土壤N2O排放的主要途径[图 5（b）]. 此外, COF处理bD/nD贡献率高于CF处理. 相应地, 与CF相比, 有机肥部分替代处理中, N2O的还原程度（Fr）增加, 而残留比例（rN2O）降低.
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（a）N2O同位素数据δ18O（N2O/H2O）vs. δ15NSP图解；（b）不同途径对N2O产生的相对贡献率；（c）硝化过程产生N2O的相对贡献率；（d）反硝化过程产物比 图 5 N2O同位素数据图解与4个时期土壤硝化过程贡献率和反硝化过程产物比 Fig. 5 Graphical representation of N2O isotope data along with the contribution rates of soil nitrification and the ratio of denitrification products at four different time periods |
好氧泥浆实验结果显示, 在12月3日和3月18日土壤硝化过程中COF处理的N2O排放量比CF处理低, 但在5月18日和6月21日土壤硝化过程中COF处理的N2O排放量比CF处理高[图 5（c）]. 所有处理土壤中的氨氧化过程主要是以AOB为主. 相对于异养硝化作用（HN）, 3个处理中自养硝化作用（AOA+AOB）的N2O排放贡献都更高. 乙炔抑制实验结果显示, 相对于CF处理, COF处理增加了异养硝化作用对硝化作用产生的N2O的贡献. 如图 5（d）所示, 施肥土壤的潜在反硝化和N2O排放速率要高得多. 施肥土壤中的反硝化最终产物比[N2O/（N2O + N2）]的增加表明N2O排放过程发生了变化, 其中COF的产物比要低于CF处理. 此外, 虽然施肥土壤的N2O/（N2O + N2）值在COF的0.58 ± 0.11和CF的0.94 ± 0.19之间变化, 但是87.5%的N2O/（N2O + N2）值高于0.73, 这表明在培养条件下, 大多数氮潜在排放形式是N2O而不是N2. 相比之下, COF处理中的N2O还原程度高于单施化肥的CF处理, 其中反硝化最终产物比在0.58 ~ 0.87之间.
3 讨论本研究表明, 在果园土壤中施用有机肥有助于缓解氮氧化物排放. 单施化肥和有机肥部分替代处理的N2O和NO累计排放分别是对照处理的2.8 ~ 3.3倍和1.8 ~ 2.0倍（表 1）. 这与前人的研究结果一致, 即氮肥的施用是土壤N2O和NO排放的重要影响因子[31, 32]. 此外, 与单施化肥处理相比, 有机肥部分替代可以有效缓解桃园土壤N2O和NO累积排放, 其中N2O降低幅度接近前人研究中估算的11%[33]. 对比发现, 有机肥替代对土壤氮氧化物排放的缓解作用也发生在果园、蔬菜和谷类作物中[26, 34, 35]. N2O排放对有机肥料施用的差异反应与其分解性有关, C/N值相对较高的有机物不太可能导致N2O排放[36]. 全球荟萃分析也显示, 有机肥对土壤N2O的排放既有刺激作用, 也有抑制作用, 这取决于其C/N值, 如在C/N值高于8.6的情况下, 有机肥可以缓解N2O的排放[12]. 在本研究中, 施用牛粪有机对N2O排放的减缓作用归因于其C/N值为13. 处理之间的排放差异主要有以下两个原因：①相对于有机肥替代处理, 单施化肥导致土壤中矿质氮的含量升高, 这会为硝化和反硝化微生物提供较多的底物, 成为导致N2O微生物形成的主要因素（图 1）. ②与CF处理相比, 有机肥部分替代化肥处理提高了土壤有机碳和氮的可用性, 刺激异养微生物的生长和增殖, 促进土壤微生物对NO3-的固定, 减少反硝化的氮损失, 从而降低N2O的排放[37].
施用有机肥改变了土壤中的硝化和反硝化过程. 氮肥是N2O产生的主要前体, 因此控制氮肥投入是控制土壤N2O的产生和排放的关键[28]. 土壤N2O排放对氮肥投入一般呈现线性或非线性反应[38, 39]. 在两种化肥处理中, 单施化肥的矿质氮含量要高于有机肥部分替代处理, 且底物N的可用性与N2O排放呈显著正相关（图 1和图 3）. 在硝化作用中, AOB产生N2O的能力要比AOA强, 因此有机肥部分替代化肥提高了硝化作用中AOA的贡献, 降低AOB的贡献[40]. 然而, 在春季追肥后, COF处理提高了AOB在硝化过程中的贡献, 并且AOA和AOB基因显示出更高的丰度, 导致其N2O排放高于CF处理[图 4和图 5（c）]. 由于土壤中存在多种微生物途径可以产生N2O, 因此很难确定其具体来源[40]. 有研究发现, N2O的双同位素图可用于区分N2O生产的4个主要微生物过程[29, 41]. 根据δ18O与SP图的结果, bD/nD是两种处理的主要过程, 贡献率超过了60%, 而有机肥部分替代处理要高于单施化肥处理. 施用有机肥后, 反硝化功能基因nirS和nosZ-I的丰度都高于单施化肥处理, 这可能是由于有机肥改良土壤后碳可用性更高（图 4）. 由于底物碳的可利用性增加, 施用有机肥会增加反硝化功能基因的丰度和反硝化活性[42]. 同时, 随着微生物活性增强, 土壤中的O2会被消耗掉, 形成厌氧条件, 从而增强了反硝化功能[图 5（a）]. N2O还原为N2被认为是控制N2O排放的重要过程[42]. 相较于单施化肥处理, 有机肥部分替代处理不仅减少了N2O排放, 还减少了NO排放. 施用有机肥可以促进土壤反硝化作用, 将一部分NO还原为N2O, 同时增强了完全反硝化作用, 将更多的N2O还原为N2, 导致N2O残留变少[图 5（b）]. 有全球荟萃分析显示, 与单施化肥相比, 有机肥料单独施用或与无机肥料配施用都可以降低土壤中的NO排放[39].
果园种植是农业土壤N2O排放的重要的来源之一. 果园已成为中国第三大农业种植行业, 仅次于谷物和蔬菜, 其种植面积约占全球总种植面积的1/4[43]. 本研究表明, 有机肥部分替代化肥可以降低土壤EF-N2O（表 1）, 与前人报道的果园的全球平均EF-N2O（1.27%）接近, 均高于IPCC默认值1.0%[9]. 有统计数据显示, 果园年化学氮肥投入量高达550 kg·hm-2, 远高于谷类作物（< 250 kg·hm-2）和蔬菜（约383 kg·hm-2）[44]. 考虑到种植面积和潜在的N2O排放, 政策和实践层面的缓解措施应该是中国果园管理的优先事项. 自2017年农业农村部制定《开展果菜茶有机肥替代化肥行动方案》以来, 作为重要技术模式之一的“有机肥-减肥增效”在蔬菜系统中广泛推广应用[45]. 因此, 针对果园这一重要农业种植领域, 合理施用有机肥部分替代化肥是缓解气候变化、实现农业碳中和的可行措施.
4 结论通过田间原位观测和室内实验分析, 本研究探讨了不同肥料处理对果园土壤氮氧化物排放的影响. 结果表明, 果园不同施肥处理氮氧化物排放总量差异较大, 且氮肥导致果园具有较高的N2O排放. 其中N2O排放主要发生在春夏季节两次追肥前后. 与单施化肥处理相比, 有机肥部分替代化肥能够降低底物N的可用性, 降低硝化作用中AOB的贡献, 增强反硝化作用和完全反硝化过程, 从而有效降低果园土壤N2O和NO排放. 因此, 本研究认为果园施肥采用有机肥部分替代化肥有助于种植业减排, 从而助力农业低碳绿色发展.
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