2024, Vol. 45
2. 中国科学院大学, 北京 101408;
3. 华中农业大学资源与环境学院, 武汉 430070
2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 101408, China;
3. College of Resources and Environment, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China
土壤磷（P）是陆地生态系统影响净初级生产力最重要的营养元素, 全球有30% ~ 40%的作物产量受到P的影响[1]. 土壤有效磷是唯一能够被植物直接吸收利用的有效形态, 其仅占土壤总磷的很小一部分. 土壤中大部分磷以有机磷的形式存在, 占总磷的25% ~ 56%[2], 而土壤有机磷不能直接被植物吸收利用. 因此, 土壤有机磷的微生物矿化在植物养分吸收及作物生产等方面起着举足轻重的作用[3]. 编码碱性磷酸酶基因（phoD）的微生物承担着土壤有机磷的矿化过程, 通过分泌碱性磷酸酶将有机磷转化为植物能够直接吸收利用的无机磷, 进而影响作物生长[4]. 目前, 已有较多的研究发现能够编码碱性磷酸酶的phoD基因的微生物群落广泛存在于土壤中, 尤其是根际土壤, 其活性与土壤pH、养分含量、施肥量、土地利用方式和元素化学计量比等因子密切相关[5~11]. 农业土壤中, 施肥是影响土壤解磷菌多样性及群落结构的重要因子. 例如, 长期施用有机肥增加了有机磷矿化细菌群落丰度, 例如链霉菌属、诺卡氏菌属和戈登菌属[12]. 相比之下, 无机肥的持续施用抑制了有机磷矿化微生物群落的生长[13]. 也有研究表明, 化肥与生物炭配施可以增加根际与非根际土壤编码phoD基因的微生物多样性[14], 秸秆还田配施无机肥可以显著增加土壤编码phoD基因细菌群落多样性, 而单施无机肥对其微生物多样性无显著影响[15]. 外源磷添加显著影响土壤磷素组成, 进而影响编码phoD基因的细菌群落多样性、群落结构及关键类群的丰度[16]. 以上研究表明, 高强度施肥会影响土壤解磷菌的活性及群落组成, 但其影响机制尚不明晰. 因此, 正确理解编码phoD基因细菌群落对化肥投入及土地利用变化的响应, 对于优化施磷方案至关重要, 有助于提高作物产量与品质, 为守护土壤健康与粮食安全提供理论依据.
中国是全球最大的柑橘生产国之一, 柑橘也是中国重要的农产品之一[17]. 在追求经济最大化过程中, 越来越多非耕地逐渐转变为柑橘园, 这种土地利用方式的转化已经对土壤微生物产生重要的影响. 柑橘土壤微生物的多样性和功能对柑橘生长发育至关重要[18], 尤其是一些功能微生物类群, 比如解磷菌. 科学合理地调控土壤解磷菌的群落结构和功能, 有利于提高柑橘的产量和品质, 降低病虫害的发生率, 保障柑橘的健康生长. 已有研究表明, 编码phoD基因的微生物群落对化肥投入、土地利用方式和土壤pH等环境因子高度敏感[15, 16, 19]. 然而, 高强度长期化肥投入对土壤中编码phoD基因的微生物群落的影响机制尚不明晰, 尤其是在高强度单一种植的柑橘园中. 因此, 本研究借助于高通量测序及实时荧光定量PCR技术（qPCR）, 从流域尺度探究土地利用方式及高强度集约化柑橘种植对土壤有机磷循环微生物活性及群落组成的影响, 以期为发展有机果园和化肥减施提供基础数据及理论依据.
1 材料与方法 1.1 研究区概况研究区位于湖北省宜昌市秭归县水田坝乡, 该乡是典型的柑橘种植区, 具有百余年的种植史, 到目前为止, 几乎所有的耕地均种植脐橙. 由于脐橙的经济价值较高, 越来越多的未利用地及自然林地逐渐被种植为脐橙. 同时, 当地农民在追求利益最大化的过程中, 大量施用化肥和农药等化学品, 导致土壤板结、酸化和养分失衡等环境问题. 柑橘已经成为当地农民的主要经济来源. 因此, 该区域具有明显的典型性. 选取毗邻的自然林地作为对比, 探究柑橘种植对土壤解磷菌的影响机制. 该区域属于亚热带季风气候, 年均温为18.2℃, 年降雨量为940.3 mm, 土壤类型为紫色砂岩发育的紫色土[20, 21].
1.2 样品采集于2022年8月在水田坝乡选取22个种植年限为25 ~ 30 a的柑橘园为采样点. 柑橘品种为纽荷尔, 土壤类型为紫色土, 主要施用无机肥. 在每个柑橘园中随机选取15棵柑橘树作为土壤样品采集点, 沿着柑橘树的滴水线多点采集0 ~ 5 cm土壤样品, 然后将样品混匀后获得一个采样点的样品. 为了对比柑橘种植导致土壤磷循环微生物群落多样性及群落结构变化, 在柑橘园毗邻区选择了22个自然林地（侧柏）作为研究对象, 采集其表层（0 ~ 5 cm）土壤样品. 每个采样点的土壤在除去植物根系、碎屑和石头等杂物后, 利用四分法将土壤样品分成两部分, 一部分保存于4℃冰箱, 用于土壤基本特性分析, 另取大约10 g土壤保存于灭菌的离心管中, 并立即保存于-80℃冰箱, 用于土壤总DNA的提取.
1.3 土壤基本特性分析土壤的基本理化性质根据《土壤农化分析》的标准方法进行分析测定[22]. 土壤pH采用水土比1∶2.5的比例提取, 提取液（0.01 mol·L-1 CaCl2）的pH通过玻璃电极进行测定；土壤硝态氮与铵态氮通过1 mol·L-1的KCl浸提, 然后利用连续流动分析仪（AA3）测定[23]；土壤速效磷（AVP）的测定主要通过0.5 mol·L-1的NaHCO3浸提, 然后通过钼蓝比色测定其含量[24, 25]；土壤有机质采用重铬酸钾外加热法测定[26]. 不同形态磷含量通过不同的提取剂浸提, 其中CaCl2模拟土壤中可交换态磷（CaCl2-P）, 柠檬酸（citrate）模拟根系分泌有机酸溶解态磷（citrate-P）, HCl表征土壤中矿物结合态磷（HCl-P）, 具体分析方法见文献[27].
土壤碱性酶活性测定采用微孔板荧光法[28~30]. 具体方法为：称取1 g的土壤样品于250 mL的塑料瓶中, 加入125 mL（pH=7.5）的Tris缓冲溶液, 在摇床上振荡1 h, 然后取出将悬浮液加入到96孔板中, 与底物（4-MUB-phosphate）反应进行, 然后利用多功能酶标仪测定其荧光值. 同时在每板中设置3个参考、淬火、空白和阴性对照, 每个处理包含6个平行.
1.4 土壤DNA提取、PCR扩增、qPCR和测序土壤DNA提取采用DNA试剂盒提取（MoBio Laboratories, Carlsbad, CA, USA）, 按照试剂盒说明书进行逐步提取, 提取后通过测定A260/A230和A260/A280检验DNA纯度, 检验后的DNA放置于-80℃冰箱保存, 用于后续的PCR扩增.
土壤解磷细菌采用引物ALPS-F730（5′-CAGTG GGACGACCACGAGGT-3′）和ALPS-R1101（5′-GAG GCCGATCGGCATGTCG-3′）扩增phoD基因[7, 31, 32]. PCR反应体系包括：5 μL 2 × i-Taq Universal SYBR® Green Supermix [BIORAD, Hercules, CA, USA）、0.4 μL（10 μmol）]引物和0.4 μL模板DNA. 热循环条件为：在94℃保持4 min, 随后进行40个循环, 每个循环包括94℃ 45 s, 57℃ 30 s, 72℃ 1 min, 最后在72℃下保持8 min. 扩增产物在上海派森诺生物有限公司的Illumina HiSeq 2500平台进行测序.
每个样品phoD基因丰度利用qPCR仪（ABI 7500）进行测定. 热循环条件如下：95℃ 30 s, 然后在95℃ 5 s和60℃ 34 s下进行40个循环. 质粒构建根据已有的研究进行[13], 然后使用连续梯度稀释法制备标准曲线, 通过测定质粒浓度和碱基对数计算基因拷贝数. 扩增效率范围为90% ~ 98%, R2值为0.99.
1.5 测序数据分析使用QIIME对基因序列进行质控及群落多样性分析. 首先, 使用Qiime（1.17）保留序列长度 > 150 bp、平均质量得分 > 20且没有模糊碱基对的原始序列. 序列经过质量过滤后, 按照所有样本的最小序列数进行标准化（7981）, 以确保所有样本的下游分析在相同的测序深度下进行. 使用UPARSE将高质量序列在75%相似性水平下进行OTU聚类[7, 33]（version 7.1, http://drive5.com/uparse/）, 使用UCLUST在对Greengenes数据库（13_850）中进行物种信息注释, 得到每个样本的物种信息, 然后计算每个样品的α-多样性指数（Shannon指数）.
1.6 土壤解磷菌微生物网络构建土壤解磷菌共现网络利用R 3.5计算每个OTU之间的Spearman相关系数, 取相关性系数的绝对值大于0.7, 且显著性小于0.01的OTU进行后续的微生物网络分析. 基于以上阈值, 使用microeco包进行微生物网络构建[34]. 构建好的微生物网络利用Gephi 0.10（https://gephi.org/）进行可视化[35]. 网络分析中, 节点代表OTU, 连接节点的边代表OTU之间的关联性. 微生物网络复杂性与稳定性表示微生物群落之间相互作用和关系, 可用于预测生态系统功能[36].
1.7 数据统计分析利用SPSS 16.0（IBM Corporation, Armonk, NY, USA）分析土壤磷组分与phoD基因丰度、编码phoD基因微生物群落多样性的相关性, 其拟合结果利用R 3.5作图. 利用方差分析比较不同土地利用方式对土壤基本特性、磷组分、phoD基因丰度及编码phoD基因的细菌群落多样性的影响. 利用主坐标分析（PCoA）研究不同土地利用方式对土壤解磷菌群落结构的影响, 利用韦恩图（Venn）探究柑橘与自然林地土壤OTU组成差异, 利用多元回归模型解析环境因子对土壤碱性磷酸酶、phoD基因丰度及微生物群落多样性的影响, 然后用relaimpo包的lmg函数计算每个变量的相对重要性（RI）, 其可量化每个环境因子的相对影响[37~39]. 在R 3.5中利用随机森林模型量化主要环境因子对土壤碱性磷酸酶、phoD基因丰度及微生物群落多样性的影响[40, 41].
2 结果与分析 2.1 土壤性质及磷组分土地利用方式显著影响土壤基本特性. 柑橘土壤pH显著低于自然林地（P < 0.05, 表 1）. 柑橘土壤ω（有机质）为20.8 g·kg-1, 显著低于自然林地（37 g·kg-1）. 柑橘土壤累积着大量的硝态氮、铵态氮及速效磷, 其中柑橘土壤ω（速效磷）为112 mg·kg-1, 是自然林地（3.7 mg·kg-1）的30倍, 柑橘土壤硝态氮和铵态氮含量是自然林地的12倍和8倍. 柑橘土壤磷组分与自然林地差异显著（P < 0.05）, 柑橘土壤ω（CaCl2-P）为28 mg·kg-1, 是自然林地（3.5 mg·kg-1）的8倍, 自然林地Citrate-P和HCl-P含量显著低于柑橘土壤（P < 0.05）. 长时间的高度无序柑橘种植已经导致土壤酸化、氮磷速效养分的大量累积.
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表 1 不同土地利用方式下土壤基本特性1） Table 1 Soil properties in different land uses |
2.2 土壤碱性磷酸酶活性及phoD基因丰度
土地利用方式显著影响土壤碱性磷酸酶活性及phoD基因丰度（P < 0.05）. 柑橘土壤碱性磷酸酶活性显著低于自然林地（P < 0.05）, 其中自然林地土壤碱性磷酸酶活性是柑橘土壤的10倍左右. 自然林地phoD基因丰度在9.16×106 ~ 1.72×108 copies·g-1之间变异, 均值为9.25×107 copies·g-1, 柑橘土壤phoD基因丰度在3.15×106 ~ 5.16×107 copies·g-1之间变异, 均值为1.99×107 copies·g-1. 拟合分析表明, 土壤碱性磷酸酶活性与phoD基因丰度呈显著相关（R2=0.68, P < 0.01, 图 1）.
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图 1 土壤碱性磷酸酶活性及phoD基因丰度 Fig. 1 Abundance of phoD gene and the activity of alkaline phosphatase in soils |
柑橘土壤编码phoD基因的细菌多样性（5.35）显著低于自然林地（4.61）, 其群落组成也有别于自然林地[图 2（a）]. 柑橘土壤与自然林地共有2 244个相同OTU, 其占总体丰度的67.4%, 自然林地和柑橘土壤分别含有11 635和2 518个特异OTU, 以上OTU是导致群落多样性变化的主要因子. 柑橘土壤与自然林地土壤特异OTU占总体丰度的比例分别为12%和20.6%[图 2（b）]. PCoA分析表明, 自然林地土壤解磷细菌群落组成较为相似, 柑橘土壤解磷细菌微生物群落组成相似[图 2（c）]. 土壤解磷细菌主要由变形菌门和放线菌门组成, 其相对丰度 > 80%. 柑橘土壤（相对丰度27%）放线菌门的相对丰度显著大于自然林地（相对丰度16%）, 而变形菌门在自然林地更为丰富. 在目分类水平上, 柑橘土壤含有较为丰富的Rhizobiales（相对丰度24%）、Streptomycetales（相对丰度14%）和Pseudomonadales（相对丰度10%）, 而自然林地含有较为丰富的Pseudomonadales（相对丰度28%）和Burkholderiales（相对丰度9%）[图 2（d）]. 低丰度微生物群落在自然林地中较多. 方差分析表明, 柑橘土壤与自然林地存在明显的微生物群落差异, 其相对丰度差异显著的微生物群落有：Pseudomonadales、Streptomycetales和Burkholderiales.
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e1.Burkholderiales, e2.Pseudomonadales, e3.Pseudonocardiales, e4.Rhizobiales, e5.Rubrobacterales, e6.Streptomycetales, e7.Xanthomonadales 图 2 不同土地利用方式土壤编码phoD基因细菌群落多样性及群落结构 Fig. 2 Diversity and community structure of soil phoD-harboring microbial communities in different land uses |
微生物网络分析表明, 相比于自然林地, 柑橘土壤解磷细菌网络更为简单和松散, 节点数和边数均少于自然林地. 模块数也表现出自然林地高于柑橘土壤, 尤其是丰度较多的模块. 自然林地中, 相对丰度大于10%的模块数有4个, 而柑橘土壤中只有模块1和模块2的相对丰度大于10%, 二者占总体的46%（图 3）.
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不同颜色表示不同模块 图 3 不同土地利用方式下编码phoD基因微生物网络特征 Fig. 3 Microbial network of soil phoD-harboring microbial communities in different land uses |
相关性分析表明, 土壤pH和有机质与碱性磷酸酶活性、phoD基因丰度和编码phoD基因细菌的Shannon指数显著正相关, 而土壤硝态氮、铵态氮、速效磷和不同形态磷组分均与phoD基因丰度和编码phoD基因的细菌Shannon指数显著负相关. ALP与phoD基因丰度和编码phoD基因细菌Shannon指数呈显著的负相关（图 4）.
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*表示P≤0.05, 不同圆圈大小表示相关性系数的绝对值大小 图 4 土壤基本特性、不同磷组分、phoD基因丰度、编码phoD基因细菌群落多样性及优势细菌群落的相关性分析 Fig. 4 Associations between soil properties, P fractions, and the diversity and community structure of soil phoD-harboring microbial communities |
利用多元回归模型探究土壤pH、SOM、硝态氮、铵态氮及磷组分对土壤碱性磷酸酶活性的影响, 发现这8个参数可以解释碱性磷酸酶89%的变异, 其中pH（28%, 相对贡献率, 下同）影响最大, 其次为：速效磷（18%）、有机质（14%）、CaCl2-P（12%）、Citrate-P（11%）、硝态氮（7%）、HCl-P（6%）和铵态氮（5%）. 土壤有效态磷对ALP酶活性的影响大于矿物结合态磷（HCl-P）. 土壤有机质、土壤速效磷对phoD基因丰度的影响最大, 其相对贡献率分别为30%和21%, 而土壤pH对其的影响相对较小（相对贡献率7%）. 此外, 土壤的铵态氮对phoD基因丰度的影响也较大, 相对贡献率为12%. 编码phoD基因微生物群落多样性主要受土壤pH、速效磷及CaCl2-P的影响. 随机森林模型结果表明, 土壤pH、SOM和AVP是影响碱性磷酸酶活性的主要因子, SOM、CaCl2-P和AVP是影响土壤phoD基因丰度变异的主导因子, 而编码phoD基因的细菌群落多样性的主要因子为pH和AVP（图 5）.
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图 5 随机森林模型解析环境因子对土壤碱性磷酸酶活性（ALP）、phoD基因丰度、编码phoD基因的细菌群落多样性（Shannon指数）的影响 Fig. 5 Random forest model to analyze the impact of environmental factors on soil alkaline phosphatase activity (ALP), phoD gene abundance, and bacterial community diversity (Shannon index) encoding phoD gene |
磷是生命不可或缺的营养元素, 是DNA的基本骨架, 也是合成三磷酸腺苷（ATP）的主要元素, 因此土壤磷有效性与植物初级生产力息息相关[42]. 由于集约化农业的普及, 高度无序的柑橘种植, 大量化肥施用导致土壤中累积了大量速效养分, 尤其是土壤有效磷的累积. 由于无机磷极易被土壤有机质及铁铝氧化物吸附固定[43], 因此柑橘土壤磷随着化肥的不断施用逐渐累积, 导致土壤ω（速效磷）高达112 mg·kg-1, 其显著高于自然生态系统, 也远远大于柑橘生长对磷的需求[44]. 此外, 柑橘种植也显著影响土壤磷组分. 柑橘土壤CaCl2-P、citrate-P和HCl-P均显著高于自然林地. HCl-P主要表征土壤中矿物结合态无机磷, 其在柑橘土壤中大量累积, 其含量是自然林地的4倍左右, 表明柑橘种植导致土壤无机磷过量.
有研究表明, 土壤可利用态磷含量介导微生物对碱性磷酸酶的分泌[27]. 磷限制状态下, 微生物会分泌磷酸酶来矿化有机磷, 将其转化成无机磷, 进而被微生物利用. 本研究中, 土壤碱性磷酸酶活性与土壤速效磷、CaCl2-P、citrate-P和HCl-P均呈现显著的负相关, 表明土壤磷累积会降低土壤碱性磷酸酶活性. 也有研究发现土壤有效磷含量与碱性磷酸酶活性呈显著的正相关[27], 这与本研究结果相反. 造成这种相反的拟合关系主要与土壤的有效态磷含量有关. 在低磷土壤中, 微生物会分泌碱性磷酸酶来矿化有机磷提高土壤有效态磷含量, 而在高磷土壤中, 土壤微生物会减少碱性磷酸酶的分泌, 因而导致土壤碱性磷酸酶与土壤速效磷的负相关. 柑橘土壤中, 有效磷含量显著高于植物生长的阈值（< 80 mg·kg-1）[44], 其高磷累积会抑制微生物对碱性磷酸酶的分泌, 因此其磷酸酶活性与phoD基因丰度显著低于自然林地. 有研究表明, 农业土壤中低磷有助于促进碱性磷酸酶的分泌, 高磷反而会抑制碱性磷酸酶的活性[45], 这与本研究的结果一致.
3.2 柑橘种植对土壤解磷菌多样性及群落组成的影响土地利用方式是影响土壤磷循环微生物活性的重要因子[46]. 本研究中, 柑橘土壤phoD基因丰度显著低于毗邻的自然林地. 此外, 柑橘土壤编码phoD基因的微生物多样性也显著低于自然林地. 因此, 柑橘种植改变了土壤解磷细菌群落组成及多样性.
高强度集约化柑橘种植导致土壤高磷累积, 主要以无机磷的形式存在, 土壤中可利用态磷含量也显著高于柑橘生长需求的阈值. 土壤高磷累积会减少土壤碱性磷酸酶的分泌, 同时也会降低phoD基因丰度, 抑制编码phoD基因微生物的多样性, 改变其微生物群落组成. 自然林地土壤含有较多的变形菌门, 而柑橘土壤含有较多的放线菌门. 不同的微生物类群对有效磷的响应不一致, Pseudomonadales和Burkholderiales随着有效磷含量的增加而降低, 而Rhizobiales、Streptomycetales和Pseudonocardiales随着有效磷含量的增加而增加. 因此, 从整体来看, 高磷会抑制编码phoD基因的细菌活性, 但是也会促进部分解磷菌群落的生长, 这主要是微生物存在功能冗余和生态位差异[7]. 此外, 高磷投入还会影响编码phoD基因微生物群落之间的协作关系, 微生物网络也会随着磷含量的增加而变得简单和松散.
柑橘土壤中累积着大量可利用态氮磷, 为微生物生长提供了很好的养分基础, 但是其pH和有机碳含量较低, 其也是影响微生物生长的重要因子. 已有研究表明, 土壤微生物分布主要受pH的调节, 尤其是细菌[37]. 由于土壤细菌的最佳pH适应范围较窄, 其对pH较为敏感[37]. 高强度的化肥投入, 会引起土壤pH的急剧下降, 其直接影响到细菌的活性及分布. 因此, 柑橘土壤解磷细菌的多样性也会受到土壤pH下降的影响. 此外, 土壤有机碳也是影响土壤微生物分布的重要因子[39], 尤其是土壤解磷菌群落多样性[6, 13]. 本研究中, 土壤有机质是影响phoD基因丰度的第一大影响因子, 其直接影响土壤解磷菌对碱性磷酸酶的分泌, 因此提高土壤有机碳含量可以有效地提高解磷菌活性, 促进其对碱性磷酸酶的分泌.
3.3 柑橘种植改变土壤微生物对磷的获取策略柑橘种植伴随着氮、磷、钾肥过量施用, 有研究表明柑橘园施用磷肥量高达695 kg·hm-2[47]. 过量施用化肥会直接导致养分过剩及土壤酸化[48], 进而会影响土壤微生物多样性. 已有研究表明, 集约化农业土壤微生物多样性丧失严重, 而这些丧失的微生物也承担着重要的生态功能, 比如氮周转、磷矿化、碳分解等重要过程[13]. 土壤解磷菌通过分泌碱性磷酸酶分解有机磷, 并将其转化成植物和微生物可以直接利用的无机磷, 是土壤磷循环中最为重要的环节[49]. 有研究表明, 土壤有机磷循环微生物多样性与土壤速效磷显著正相关[50], 这与本研究结果相反. 本研究中, 土壤编码phoD基因的细菌群落多样性与速效磷呈负相关, 这主要是柑橘土壤中积累了大量的有效磷, 其含量远远超过了微生物生长需求量. 因此, 柑橘土壤中解磷菌活性受到了抑制. 在低磷土壤中, 活化解磷菌可以有效地提高土壤磷可利用性[51], 尤其是在自然生态系统中. 本研究中, AVP与phoD基因丰度呈显著负相关, 主要是由于柑橘土壤有效磷主要来源于外源磷添加, 而非微生物转化而来. 高磷土壤中, 解磷菌活性受到了抑制, 其多样性显著低于低磷土壤[13]. 因此, 长期高强度柑橘种植会改变土壤微生物对磷的获取策略, 即当土壤有效磷过剩时, 土壤解磷菌生长缓慢, 其分泌的碱性磷酸酶活性也较少；当土壤有效磷不足时（比如自然林地）, 土壤解磷菌生长迅速, 促进其分泌大量的碱性磷酸酶来矿化土壤中的有机磷, 以满足其生长. 因此, 柑橘种植会改变土壤微生物对磷的获取策略, 从微生物获取向依赖外源磷的方式转变. 自然林地土壤高phoD丰度、高编码phoD基因的细菌群落多样性, 表明自然林地低磷会刺激土壤微生物分泌碱性磷酸酶去获取更多的磷. 自然林地中, 土壤碱性磷酸酶显著高于柑橘土壤, 这也合理地解释了自然林地土壤微生物通过有机磷矿化获取磷的策略（图 6）.
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图 6 柑橘种植改变了土壤微生物对磷的获取策略 Fig. 6 Citrus planting changes the acquisition strategy of soil microorganisms for phosphorus |
（1）柑橘种植增加了土壤有效磷及矿物结合态磷含量, 降低了土壤碱性磷酸酶活性.
（2）柑橘种植降低了土壤解磷细菌多样性和phoD基因丰度, 改变了解磷细菌群落结构.
（3）土壤解磷细菌多样性和phoD基因丰度均随着土壤有效磷含量的增加而显著降低, 土壤磷累积降低了土壤碱性磷酸酶活性.
（4）柑橘种植改变了土壤微生物对磷的获取策略. 柑橘土壤微生物获取磷主要依赖于外源磷, 而在自然林地土壤微生物主要通过微生物矿化有机磷来获取磷.
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