土壤微生物在土壤元素生物地球化学循环中发挥重要作用^[1]. 微生物群落结构及其多样性可反映土壤的受扰动情况, 能够有效表征土壤环境变化趋势^[2], 被认为是评判土壤质量的重要指标. 真菌大多数在土壤中与植物根系形成共生作用^[3], 细菌群落演变与土壤中碳、氮和磷等元素有着密切联系^[4]. 不同种类的微生物在凋落物分解、营养物质的吸收和释放及土壤碳氮循环过程中作用效果存在差异^{[5, 6]}. 土壤微生物群落结构和多样性对森林生态系统林型、林龄等变化能够迅速响应, 在森林演替过程中发挥着重要的作用^[7].

营造人工林是植被恢复的重要措施. 油松具有深根性、抗贫瘠性和抗风的作用. 一定种植密度下, 油松林有较强的保育水土和改善森林土壤性质的能力, 能够有效促进土壤团聚体的产生, 减少土壤肥力流失^[8], 是黄土高原地区植被恢复中广泛使用的树种. 人工油松林在演替过程中, 林龄增加会改变林分结构、林下物种组成以及林内微气候等条件^[9]. 有研究表明, 土壤受到根系生长差异的影响, 养分积累呈现差异性, 幼龄林主要以分解表面枯落物为主积累有机养分；而中龄林根系逐渐发达, 转化有机物能力增强, 使得有机质积累效果显著, 保水保肥能力显著提升, 在森林生态系统物质循环中起着至关重要的作用^[10]. 土壤理化性质的改变会进一步影响土壤微生物群落结构和组成^[11]. 前期对于人工油松林演替的研究, 多集中于林分结构和林下植物、理化特征、土壤微生物量、群落结构以及酶活性等^{[12, 13]}. 对于油松演替过程中土壤微生物特征的研究多以细菌为主, 真菌较少^{[14, 15]}. 研究方法上多采用PCR-DGGE和PLFA等方法^[16], 由于技术的限制还不能精准地反映土壤微生物组成. 采用反应灵敏度较高的高通量测序手段, 系统地阐述土壤真菌、细菌生物量、多样性和群落组成对人工油松林演替的响应及其环境因子驱动机制, 目前还鲜见报道.

基于此, 本文以太岳山脉潘家山为研究区域, 以不同林龄人工油松林土壤为研究对象, 采用理化分析、荧光定量PCR和高通量测序技术相结合的手段, 系统研究太岳山人工油松林演替过程中土壤真菌和细菌总量、多样性以及群落结构的变化及其环境驱动机制. 土壤微生物与土壤碳库周转及养分循环密切相关^{[17, 18]}, 有效驱动着森林生态系统的稳定和可持续发展^[19], 研究结果可为区域植被恢复的生态效益评价提供基础数据和理论参考.

研究区位于山西省长治市沁源县潘家山（112°28′36″E, 36°34′44″N）, 隶属太岳山脉, 海拔1 463 m, 属于温带大陆性季风气候, 年均温8.7 ℃, 土壤为中性偏弱碱性黄褐土. 该地区存在大量的天然和人造油松林, 是我国面积较广、生长较好且具有代表意义的油松分布区^[20]. 选取潘家山人工种植林龄为10、20和30 a的油松林土壤, 3个林龄样地坡向分别为东南、西北和正南, 坡度均在65°~70°之间, 各样地之间距离不超过1 000 m, 于2022年9月进行采样. 每个样地随机设置20 m×20 m的样方, 在样方内进行植被调查（见表 1）和土壤样品采集. 10 a油松林土壤由于土层较浅只取0~20 cm, 20 a和30 a林龄的土层按深度划分为0~20 cm和20~40 cm, 分别编号为10a-20、20a-20、20a-40、30a-20和30a-40；每个处理均采用随机取样法, 选择10个采样点混合作为一个样品, 所取样品为非根际土壤. 将所取土壤样品分为两部分, 一部分装入无菌袋密封后, 放入装有干冰的泡沫箱寄出进行高通量测序及荧光定量PCR检测. 另一部分土壤样品在实验室将枯枝和细根等杂质去除后过2 mm筛, 自然风干后用于土壤理化性质分析.

表 1 (Table 1)

表 1 油松林样地基本特征 Table 1 Characteristics of selected sampling plots of Pinus tabuliformis forests 林龄/a 坡度/（°） 坡向 总郁闭度/% 油松树高/m 油松胸径/cm 灌木 草本 10 68 东南 60 5.5~10.5 12~31 女贞（Ligustrum lucidum Ait.）和忍冬（Lonicera japonica Thunb.） 披针叶薹草（Carex lanceolata Boott）和小苦荬[Ixeridium dentatum (Thunb.) Tzvel.] 20 65 西北 70 8~15 36~90 土庄绣线菊（Spiraea pubescens Turcz.）、女贞、桦叶荚蒾（Viburnum betulifolium Batal.）和黄刺玫（Rosa xanthina Lindl.） 野艾蒿（Artemisia lavandulifolia Candolle）、披针叶薹草、牛尾蒿（Artemisia dubia Wall. ex Bess.）和糙叶黄芪（Astragalus scaberrimus Bunge） 30 70 正南 90 10~21 41~128 土庄绣线菊、女贞、黄刺玫和忍冬 披针叶薹草、苦参（Sophora flavescens Alt.）和糙叶黄芪

表 1 油松林样地基本特征 Table 1 Characteristics of selected sampling plots of Pinus tabuliformis forests

土壤有机质（soil organic matter, SOM）使用重铬酸钾容量法测定；全氮（total nitrogen, TN）使用凯氏定氮法测定；碱解氮（alkali hydrolyzable nitrogen, AHN）用碱解扩散法测定；铵态氮（ammonium nitrogen, NH₄⁺-N）和硝态氮（nitrate nitrogen, NO₃^--N）使用硫酸钾溶液浸提后, 采用流动分析仪测定；全磷（total phosphorus, TP）和有效磷（available phosphorus, AP）分别采用硫酸-高氯酸消煮法和碳酸氢钠法进行测定；全钾（total potassium, TK）使用氢氧化钠熔融-火焰光度法测定；速效钾（available potassium, AK）采用醋酸铵-火焰光度法进行测定^[21].

依照土壤DNA提取试剂盒（Omega, cat：M5635-02）说明书要求提取土壤基因组DNA并制备标准品, 采用Nanodrop（Thermo, USA）对DNA进行定量, 1.2%琼脂糖凝胶电泳检测完整DNA.

荧光定量PCR检测：真菌ITS1区使用ITS5F（5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′）和ITS1R（5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′）进行扩增；细菌则使用16S338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′）和16S806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）对V3-V4区进行扩增（型号：EDC-810型）；PCR反应体系为：10 µL 2×SYBR real-time PCR premixture试剂（预混DNA聚合酶、dNTP、特殊稳定剂、优化的反应缓冲液、BSA和SYBR Green I）, 10 μmol·L^-1的PCR特异引物F（ITS5F和16S338F）和PCR特异引物R（ITS1R和16S806R）各0.4 µL, 95℃预变性反应5 min后95℃变性15 s, 60℃退火30 s, 40个循环周期. 扩增结果用2%琼脂糖凝胶在电泳仪（Mini Pro 300V Power Supply, major science USA）中检测. 使用实时荧光定量PCR仪（LightCycler480I.384, Roche）进行荧光定量检测.

微生物高通量测序：采用Illumina MiSeq高通量测序平台对土壤真菌和细菌群落DNA片段进行双端（Paired-end）测序, 使用QIIME2（2019.4）Qiime cutadapt trim-paired功能去除未匹配引物的序列, 通过Qiime dada2 denoise-paired调用DADA2^[22]进行质控、去噪、拼接以及去嵌合体. 去噪后使用Qiime feature-table rarefy功能进行最低样本序列量的95%抽平, 合并ASVs（amplicon sequence variants）特征序列表格, 去除singletons ASVs后, 对序列长度分布进行统计. 测序工作委托上海派森诺生物科技股份有限公司进行.

土壤理化性质数据使用DPS（data processing system 7.5）进行方差分析（analysis of variance, ANOVA）并比较检验各组数据的最小显著性差异（least significant difference, LSD法）（显著性P＜0.05）. 使用QIIME2（2019.4）中classify-sklearn算法和Naive Bayes分类器进行门水平和属水平的分类学组成分析, 真菌选用UNITE数据库（Release 8.0, https://unite.ut.ee/）, 细菌选用GreenGenes数据库（Rlease 13.8, http://greengenes.secondgenome.com/）, Origin 2021进行绘图. Alpha多样性使用QIIME2（2019.4）进行分析, 使用Origin 2021绘制箱线图. 基于Bray-Curtis距离^[23]对抽平后的真菌和细菌ASV进行主坐标分析（principal coordinates analysis PCoA）, 使用R语言的ape包完成, 并借助R语言vegan包envfit函数进行环境拟合分析（environmental fitting analysis, envfit）. 基于spearman算法对微生物数据和理化性质进行相关性分析（显著性P＜0.05）, 使用Origin 2021中CorrelationPlot插件进行关联热图的绘制.

如表 2所示, 演替30 a的油松林表层ω（SOM）最高, 达到32.56 g·kg^-1, 20 a林龄油松林土壤SOM含量显著低于10 a. 表层（0~20 cm）土壤SOM显著高于亚表层（20~40 cm）. 土壤TN、AHN、NH₄⁺-N、NO₃^--N、AP和AK均随演替的进行逐渐升高, 在油松演替30 a时含量最高, 且TN、AHN、AP和AK在表层土壤中含量显著高于亚表层, NH₄⁺-N和NO₃^--N在土层间含量无显著差异. 土壤TP和TK含量与上述其他指标趋势相反, 在演替30 a处理中其含量显著低于10 a和20 a. 表层与亚表层的TP含量无显著差异；演替10 a和20 a处理中TK无显著差异, 30 a处理中表层显著高于亚表层.

表 2 (Table 2)

表 2 不同林龄油松林土壤基础理化性质1） Table 2 Physicochemical properties of soil in different ages of Pinus tabuliformis forest 处理 ω（SOM）/g·kg-1 ω（TN）/g·kg-1 ω（TP）/g·kg-1 ω（TK）/g·kg-1 ω（AHN）/mg·kg-1 ω（NH4+-N）/mg·kg-1 ω（NO3--N）/mg·kg-1 ω（AP）/mg·kg-1 ω（AK）/mg·kg-1 10a-20 14.90±1.62b 1.41±0.12bc 0.59±0.03a 18.84±0.13a 87.37±6.02b 4.51±0.26c 0.73±0.02c 1.47±0.15bc 36.52±3.93b 20a-20 11.40±2.03c 1.24±0.02cd 0.64±0.02a 19.16±0.47a 75.56±6.02b 4.72±0.10c 0.95±0.08b 1.79±0.09b 47.63±3.25a 20a-40 9.57±0.94c 1.14±0.08d 0.59±0.03a 17.94±0.86ab 43.68±1.67c 6.19±0.36b 0.93±0.02b 1.35±0.09c 32.49±1.09b 30a-20 32.56±1.19a 1.78±0.12a 0.42±0.02b 17.17±1.02b 152.31±10.43a 9.83±0.62a 1.20±0.06a 2.86±0.09a 53.05±1.80a 30a-40 15.45±0.78b 1.51±0.07b 0.40±0.02b 15.41±0.40c 74.38±5.01b 8.99±1.03a 1.21±0.02a 1.79±0.32b 22.90±2.89c 1）数据为均值±标准差；不同小写字母表示不同林龄及深度的显著性差异（P＜0.05）, 下同

表 2 不同林龄油松林土壤基础理化性质1） Table 2 Physicochemical properties of soil in different ages of Pinus tabuliformis forest

不同林龄油松林土壤微生物qPCR结果中, 真菌ITS引物扩增效率达到95.29%, 细菌16S引物扩增效率达到96.06%. 真菌的标准曲线相关系数R²=0.999 6, 曲线方程为y = -3.44x+34.67；细菌标准曲线相关系数R² = 0.995 9, 曲线方程为y=-3.42x+37.24, 说明测序结果与标准品的相关性较强, 测序所得数据能够准确反映土壤真菌和细菌群落在不同林龄和深度下的变化. 表 3为不同林龄油松林土壤真菌（ITS）和细菌（16S）的拷贝数及其比值（ITS/16S）. 油松林演替至30 a时, 土壤真菌ITS和细菌16S拷贝数达到最大. 此外, 表层土壤的ITS和16S拷贝数显著高于亚表层；其余林龄和土层之间无显著性差异. 真菌/细菌随着林龄的增加在30 a时显著高于10 a, 在各土层之间无显著性差异.

表 3 (Table 3)

表 3 不同林龄油松林土壤微生物拷贝数 Table 3 Microbial abundance of soil at different ages of Pinus tabuliformis forest 分组 ITS/copies·g-1 16S/copies·g-1 ITS/16S 10a-20 (5.46±1.19)×105b (4.76±1.96)×106b 0.13±0.05b 20a-20 (4.13±0.80)×105b (2.22±0.83)×106b 0.21±0.09ab 20a-40 (4.27±1.57)×105b (2.16±0.43)×106b 0.20±0.05ab 30a-20 (6.29±1.78)×106a (2.14±0.99)×107a 0.32±0.08a 30a-40 (9.39±8.16)×105b (2.87±1.19)×106b 0.32±0.18a

表 3 不同林龄油松林土壤微生物拷贝数 Table 3 Microbial abundance of soil at different ages of Pinus tabuliformis forest

不同林龄油松林土壤细菌和真菌Alpha多样性指数分析表明[图 1（a）], 土壤真菌群落丰富度（Chao1指数和Observed species指数）、多样性（Shannon指数和Simpson指数）、均匀度（Pielou_e指数）和覆盖度（Goods_coverage指数）均随着演替年限显著降低, 除了20 a亚表层土壤真菌群落丰富度（Chao1指数和Observed species指数）和覆盖度（Goods_coverage指数）显著高于表层, 其余林龄处理中土壤真菌群落Alpha多样性指数（Shannon指数和Simpson指数）均在土层之间变化不显著. 如图 1（b）所示, 土壤细菌群落多样性（Simpson指数）和均匀度（Pielou_e指数）均随着油松林龄的增加显著降低, 细菌群落多样性（Simpson指数）在土层变化方面无显著差异, 20 a处理中亚表层细菌群落均匀度（Pielou_e指数）显著高于表层；Chao1指数、Observed species指数、Shannon指数和Goods_coverage指数在不同处理油松林土壤细菌群落中无显著性差异.

图 1

Fig. 1

（a）真菌, （b）细菌；不同小写字母表示不同林龄及深度相应土壤微生物Alpha多样性指数存在显著性差异（P＜0.05） 图 1 不同林龄油松林土壤微生物Alpha多样性指数 Fig. 1 Alpha diversity index of soil microbial communities at different ages of Pinus tabuliformis forest

油松林土壤真菌和细菌门水平物种组成相对丰度排名前10如图 2所示. 真菌门水平以子囊菌门（Ascomycota）、担子菌门（Basidiomycota）和被孢菌门（Mortierellomycota）为优势门（相对丰度 > 3%）, 合计占总真菌群落相对丰度的48.51%以上. 如图 2（a）所示, 对3种优势门水平真菌分析发现, 子囊菌门相对丰度在20a亚表层土壤中最高（80.9%）, 30a亚表层土壤中相对丰度最低（23.36%）. 担子菌门相对丰度随着演替由10 a的15.17%增至30 a的31.41%. 在不同深度土壤中, 20 a林龄土壤中担子菌门相对丰度表层（2.4%）略高于深层（1.19%）. 被孢菌门相对丰度随着林龄增加而逐渐减小, 相对丰度最高为10 a表层的2.72%, 最低为30 a表层的0.33%.

图 2

Fig. 2

图 2 不同林龄油松林土壤真菌和细菌门水平物种分类学组成 Fig. 2 Taxonomic composition of fungal and bacterial communities at the phylum level in soil at different ages of Pinus tabuliformis forest

如图 2（b）所示, 细菌门水平相对丰度排名前10的细菌合计占总细菌群落相对丰度的96.68%以上. 放线菌门（Actinobacteria）、变形菌门（Proteobacteria）、酸杆菌门（Acidobacteria）、绿弯菌门（Chloroflexi）和芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）为细菌中优势菌门（相对丰度 > 3%）. 放线菌门相对丰度在10 a油松土壤中最高, 为41.02%, 在30 a表层中相对丰度最低, 为24.58%. 相反, 随着油松林龄的增加, 变形菌门相对丰度呈增加趋势；油松演替30 a时表层土壤中变形菌门丰度最高, 为39.78%. 酸杆菌门相对丰度也随林龄增加逐渐增大, 最高为30 a表层的18%, 最低为10 a表层的14.15%. 绿弯菌门和芽单胞菌门总体丰度低于前3个细菌门, 绿弯菌门整体相对丰度随着林龄增加由7.99%降至3.8%；芽单胞菌门总体随着林龄增加相对丰度逐渐升高, 由3.41%增至6.16%. 其他类别菌门相对丰度占总细菌群落的2.11%~3.32%.

在属水平上, 对不同林龄及深度的油松林土壤进行真菌和细菌群落组成及相对丰度分析, 取排名前20的菌群. 图 3（a）所示, 所得属水平真菌群落合计占总属水平真菌群落35.05%以上, 其他类别相对丰度占属水平真菌群落的35.35%~64.95%；在油松林龄10 a的土壤中, 篮状菌属（Talaromyces）、镰刀菌属（Fusarium）、腐质霉属（Humicola）和Solicoccozyma相对丰度较高（相对丰度 > 3%）, 分别为11.54%、12.18%、9.54%和8.87%；20 a林龄中, 红菇属（Russula）和青霉菌属（Penicillium）相对丰度最高, 分别为15.58%和21.71%, 20 a亚表层土壤真菌属水平相对丰度高于3%的真菌主要有红菇属、青霉菌属、Cladophialophora、Knufia、树粉孢属（Oidiodendron）和Devriesia；林龄30 a时红菇属相对丰度大幅上升, 增加至29.78%, 其余属水平真菌相对丰度均降低, 最低下降至0.04%.

图 3

Fig. 3

图 3 不同林龄油松林土壤真菌和细菌属水平物种分类学组成 Fig. 3 Taxonomic composition of fungal and bacterial communities at the genus level in soil at different ages of Pinus tabuliformis forest

如图 3（b）所示, 属水平群落相对丰度前20的细菌占总细菌群落29.56%以上, 其他类别相对丰度占属水平细菌群落的60.54%~70.44%. 酸杆菌门Subgroup_6目下未定名属、Rokubacteriales、RB41、67-14、MB-A2-108纲未定名属、变形菌门慢生根瘤菌属（Bradyrhizobium）、KD4-96、放线菌门红色杆菌属（Rubrobacter）和放线菌门土壤红杆菌属（Solirubrobacter）为优势细菌群落（相对丰度 > 3%）；酸杆菌门Subgroup_6目下未定名属相对丰度随着油松演替由6.29%下降至2.82%, 随土层加深相对丰度在20 a和30 a分别增加1.29%和0.32%；Rokubacteriales在20 a表层相对丰度为5.13%, MB-A2-108纲未定名属在20 a亚表层土壤中相对丰度为5.96%；RB41和67-14相对丰度在林龄10 a时最高, 分别为3.63%和4.46%, 随演替相对丰度分别下降2.48%和2.61%.

针对油松林土壤真菌、细菌总量和理化性质进行相关分析（表 4）, 细菌总量与SOM、TN、AHN和AP呈显著正相关关系（P＜0.05）. 真菌总量与SOM、TN和AHN呈显著正相关关系（P＜0.05）. 真菌/细菌与NO₃^--N呈显著正相关关系（P＜0.05）.

表 4 (Table 4)

表 4 不同林龄油松林土壤微生物群落结构、多样性与理化性质相关性分析1） Table 4 Correlation analysis of soil microbial community structure, diversity, and physicochemical properties at different ages of Pinus tabuliformis forest 类别 TN TP TK SOM AHN NH4+-N NO3--N AP AK 16S 0.68* -0.48 -0.14 0.70* 0.61* 0.41 0.08 0.52* 0.32 ITS 0.57* -0.43 -0.33 0.67* 0.65* 0.41 0.39 0.46 0.36 ITS/16S 0.29 -0.40 -0.37 0.32 0.30 0.44 0.71* 0.46 0.14 真菌 Chao1指数 -0.75* 0.68* 0.43 -0.75* -0.69* -0.46 -0.53* -0.79* -0.16 Observed_species指数 -0.75* 0.68* 0.43 -0.75* -0.69* -0.46 -0.53* -0.79* -0.16 Shannon指数 -0.65* 0.69* 0.61* -0.69* -0.58* -0.56* -0.68* -0.72* -0.13 Goods_coverage指数 0.53* -0.20 0.18 0.40 0.54* -0.18 -0.27 0.16 0.01 Simpson指数 -0.67* 0.79* 0.69* -0.74* -0.56* -0.60* -0.65* -0.60* 0.00 Pielou_e指数 -0.61* 0.72* 0.67* -0.67* -0.56* -0.57* -0.70* -0.67* -0.12 细菌 Chao1指数 -0.40 0.28 0.42 -0.36 -0.08 -0.47 -0.45 -0.35 -0.06 Observed_species指数 -0.37 0.23 0.39 -0.33 -0.06 -0.43 -0.42 -0.33 -0.05 Shannon指数 -0.45 0.34 0.47 -0.39 -0.17 -0.50 -0.60* -0.46 -0.13 Simpson指数 -0.50 0.46 0.52* -0.41 -0.21 -0.62* -0.72* -0.54* -0.18 Goods_coverage指数 0.41 -0.24 -0.24 0.43 0.24 0.37 0.27 0.35 0.17 Pielou_e指数 -0.52* 0.47 0.56* -0.43 -0.25 -0.61* -0.74* -0.57* -0.18 1）数值为相关性系数, *表示显著性相关（P＜0.05）

表 4 不同林龄油松林土壤微生物群落结构、多样性与理化性质相关性分析1） Table 4 Correlation analysis of soil microbial community structure, diversity, and physicochemical properties at different ages of Pinus tabuliformis forest

土壤真菌Alpha多样性指数中, Chao1指数和Observed species指数与TP呈显著正相关关系, 与TN、SOM、AHN、NO₃^--N和AP呈显著负相关, 其中与AP的相关系数绝对值最大, 均为-0.79；Shannon指数、Simpson指数和Pielou_e指数与TP和TK呈显著正相关关系, 与TN、SOM、AHN、NH₄⁺-N、NO₃^--N和AP呈显著负相关关系, 其中Shannon指数、Simpson指数和Pielou_e指数与TP相关系数分别为0.69、0.79和0.72, 均高于与TK的相关系数；Goods_coverage指数与TN和AHN呈显著正相关关系, 相关系数为0.53和0.54, 与其余理化性质相关性并不显著. 土壤细菌Alpha多样性指数中, Shannon指数与NO₃^--N呈显著负相关, 相关系数为-0.60；Simpson指数与TK显著正相关, 与NH₄⁺-N、NO₃^--N和AP有显著负相关关系, 其中与NO₃^--N的负相关系数为-0.72；Pielou_e指数和TK呈显著正相关关系, 相关系数为0.56, 与TN、NH₄⁺-N、NO₃^--N和AP有显著负相关关系, 与NO₃^--N负相关程度最高, 为-0.74.

选取属水平相对丰度前20的土壤微生物与土壤理化性质进行相关性分析. 如图 4（a）所示, 属水平真菌微生物相对丰度与土壤理化性质分析中, 除块菌属（Tuber）和Amphinema与TP和TK呈显著负相关外, 其余大部分真菌与TP和TK呈显著正相关关系；TN、SOM、NH₄⁺-N和NO₃^--N与真菌属水平相关性类似, 其中青霉菌属、Knufia、木霉菌属（Trichoderma）、Paraboeremia和假裸囊菌属（Pseudogymnoascus）与TN和SOM均呈显著负相关关系, 红菇属、块菌属和Amphinema则与TN呈显著正相关；在与NH₄⁺-N和NO₃^--N相关分析中, 除红菇属、块菌属、外瓶柄霉属（Exophiala）和Amphinema外, 其余真菌属均与NH₄⁺-N和NO₃^--N呈显著负相关.

图 4

Fig. 4

红色表示正相关关系, 蓝色表示负相关关系, 椭圆颜色越深越窄表示相关程度越高；*表示二者呈显著相关关系（P＜0.05）；色柱中数值为相关系数 图 4 不同林龄油松林属水平土壤微生物与理化性质相关性分析 Fig. 4 Correlation analysis of soil microbial communities at the genus level and physicochemical properties at different ages of Pinus tabuliformis forest

如图 4（b）所示, TP和TK与细菌属水平相关性类似, 除与酸杆菌门Subgroup_2目下未定名属、赭黄嗜盐囊菌（Haliangium）和Candidatus_Solibacter呈显著负相关关系外, 与其余大部分属水平细菌呈显著正相关关系；TN和SOM与酸杆菌门Subgroup_6目下未定名属、RB41、MB-A2-108纲未定名属、红色杆菌属、土壤红杆菌属和酸杆菌门Subgroup_17目下未定名属呈显著负相关关系, 与酸杆菌门Subgroup_2目下未定名属、赭黄嗜盐囊菌、芽单胞菌属（Gemmatimonas）和Candidatus_Solibacter呈显著正相关关系；NH₄⁺-N和NO₃^--N除与酸杆菌门Subgroup_6目下未定名属、RB41、红色杆菌属、Gaiella和土壤红杆菌属均呈显著负相关外, 与其他大部分属水平细菌呈显著正相关关系；AP和AK与NO₃^--N类似, 但不及NO₃^--N与属水平细菌相关性显著.

基于Bray-Curtis距离对抽平后油松林土壤微生物ASV距离矩阵进行PCoA分析, 后与土壤理化因子进行envfit拟合, 如图 5（a）所示, 两个坐标轴分别解释了不同林龄及土层土壤真菌38.2%和22.1%的变异；10 a与20 a的土壤真菌群落结构在第一轴上表现为聚集效应, 与TP和TK呈正相关性. 30 a土壤真菌群落与10 a和20 a分离, 与TN、AHN、AP、SOM、NH₄⁺-N和NO₃^--N显著正相关. 3个演替年限的土壤真菌群落结构在第二坐标轴上均发生分离, 与土壤AK呈相关性. 另外, 同一年限不同土层真菌群落结构呈现较强聚集效应.

图 5

Fig. 5

图 5 不同林龄油松林土壤微生物群落主坐标-环境拟合分析 Fig. 5 Principal coordinate analysis (PCoA) based on environmental variables of soil microbial communities at different ages of Pinus tabuliformis forests

如图 5（b）所示, 油松林不同林龄及深度土壤细菌菌群的分布及影响因子分析：两个坐标轴分别解释了细菌微生物在不同林龄及深度中28.7%和17.1%的变异. 与真菌不同, 不同演替年限中土壤细菌群落结构在两个坐标轴上均发生分离. 在第一坐标轴, 10 a和20 a土壤细菌群落结构与TP和TK呈正相关, 30 a土壤细菌群落结构与TN、AHN、AP、SOM、NH₄⁺-N和NO₃^--N显著正相关. 此外, 演替20 a时, 不同土层土壤细菌第一坐标值出现较大分离. 在第二坐标轴, 10 a和30 a的土壤细菌则表现为聚集, 与TN、AHN、SOM、NH₄⁺-N和AP等均呈正相关. 20 a与10 a和30 a土壤细菌群落出现较大分离, 与TP、TK和AK呈正相关.

人工油松林在次生演替过程中, 土壤理化性质能够反映出养分变化的动向^[24]. 本研究表明, 油松林演替过程中, SOM、土壤氮素和速效磷钾与TP和TK呈现不同的变化方向. SOM含量随林龄增加呈现先降低, 再升高趋势, 30 a时土壤SOM含量大幅升高. 这与前人研究的结果一致^[25], 主要是由于演替初期的幼林生长迅速, 养分消耗量较大. 随着演替的进行, 林下植物生物量逐渐提高, 凋落物积累逐渐增多, 根系系统也发展迅速^[26], 致使有机物质输入大于消耗, SOM在土壤中聚集. 类似地, 油松林演替过程中土壤TN、AHN、NH₄⁺-N和NO₃^--N的含量也是在30 a时最多. 演替20 a与10 a相比, 除NO₃^--N含量显著上升, 其他不同形态氮均无显著差异. 值得注意的是, 本研究中土壤ω（TN）为1.14~1.78 g·kg^-1, 低于欧洲国家土壤TN水平（2.09 g·kg^-1）, 氮素处于缺乏状态^[2]. 此外, 随着演替的进行, 土壤磷钾含量变化趋势与碳氮差异较大. TP和TK均在演替30 a油松林土壤中含量显著下降, 但演替30 a油松林土壤中AP和AK含量显著上升. 本研究中ω（TP）处于0.40 ~ 0.64 g·kg^-1, 远低于0.8 g·kg^-1；ω（AP）处于1.35 ~ 2.86 mg·kg^-1, 远低于8 mg·kg^-1, 属于严重缺磷土壤, K含量相对丰富^[27]. 可见, 虽然30 a油松林土壤中TP含量较低, 适宜的土壤条件有助于磷从凋落物或土壤矿物中的释放, 导致AP含量上升, 供应植物生长. 因此, 油松林演替有助于缓解本地区植物的缺磷状况, 逐步解除磷限制. 对不同深度土壤理化性质的对比表明, 20 a和30 a人工油松林土壤中, 表层土壤养分含量高于亚表层, 与前人研究的结果一致^{[28, 29]}. 这可能主要因为表层土壤植物枯枝落叶分解物及根系分泌物较多, 碳和氮等养分输入较大.

本研究中, 不同演替年限油松林土壤细菌和真菌总量均在30 a时达到最大. 此外, 真菌/细菌可以用来描述土壤微生物群落结构的变化和评估群落结构的稳定性^{[30, 31]}. 有研究表明, 真菌丰富度对于细菌群落组成产生抑制作用, 促使细菌所表征的群落随机性下降, 真菌所表征的群落稳定性增加^[32]. 本研究中真菌/细菌为0.13~0.32, 说明本研究区土壤微生物中细菌占据绝对优势. 但是随着油松林的演替, 真菌/细菌显著升高, 真菌在群落组成和相对丰度上都发生了明显的变化[表 3、图 2（a）和图 3（a）]. 可见随着演替的进行, 微生物群落结构逐渐趋于稳定. 这可能与不同林龄土壤中微生物可利用的有机质基质不同相关. 在较年幼的林地中, 植物根系生长迅速, 小分子的根系分泌物如有机酸和糖类等相对较多^[33], 这些物质更有利于细菌的繁殖^{[34, 35]}. 随着演替的进行, 存在更多的根部木质组织和凋落的枯枝落叶等以纤维素为主要成分的有机质物质^[36], 真菌胞外酶降解这些物质并积极响应凋落物分解^[37], 使得真菌生长迅速, 真菌/细菌增大. 相关分析表明, 土壤TN、SOM和AHN与真菌总量显著正相关, NO₃^--N含量与真菌/细菌显著正相关. 可见, 土壤有机质和氮是促进真菌总拷贝数增加的主要影响因子, 本研究的结果与Jing等^[38]和Simonm等^[39]的研究相符.

与10 a和20 a油松林土壤相比, 油松林土壤真菌Alpha多样性在30 a时显著下降（图 1）. 相关分析表明, 真菌Alpha多样性与土壤TP和TK呈显著正相关. 本研究区域土壤缺磷富钾, 演替30 a油松林土壤TP的限制导致了真菌多样性和丰富度的降低. 这与Ren等^[40]研究的结果不一致, 其结果表明次生演替150 a左右的油松林土壤微生物多样性不受TP的影响；推测由于本研究中油松林次生演替林龄跨度较短（仅为30 a）, 油松幼林受到生长基质理化性质的限制更强, 而长时间演替的成熟林则存在更多的凋落物分解, 因此造成演替早期和后期真菌群落受到理化因子影响的差异. 与真菌相比, 本研究区土壤细菌多样性对油松林次生演替不敏感. 本研究表层土壤真菌和细菌拷贝数显著高于亚表层, 这与Helgason等^[41]在土壤剖面微生物分布研究的结果相吻合. 多数情况下, 表层和亚表层土壤微生物多样性无显著差异, 演替20 a时, 真菌Chao1指数和细菌Pielou_e指数均表现为亚表层高于表层. 这可能是由于演替早期, 油松生长迅速, 细根的伸长区在亚表层产生大量根系分泌物, 为土壤微生物提供丰富多样的碳源^[42], 促进细菌和真菌多样性提高.

植物凋落物与根系分泌物会影响SOM及土壤养分状况, 进而对微生物群落结构产生影响. 本研究中, 门和属水平上, 不同林龄及土层深度的油松林土壤真菌中, 子囊菌门（红菇属）和担子菌门（青霉菌属）相对丰度较高；细菌则是放线菌门（红色杆菌属）、变形菌门（慢生根瘤菌属）和酸杆菌门（Subgroup_6目下未定名属）占优势. 这与黄土高原地区土壤微生物群落分布特征的研究结果相符^[43].

子囊菌门和担子菌门在土壤养分循环中能够有效降解难分解有机质^[44], 有助于维持群落的稳定并通过降解枯落物中的纤维素维持自身营养, 起着提升土壤肥力的作用, 在森林生态系统中占据着主要优势^[45]. 其中红菇属和青霉菌属相对丰度较高, 随演替变化相异；红菇属相对丰度随演替显著增加（由0.02%增至29.78%）, 而青霉菌属相对丰度急剧降低（由10.18%降至0.64%）. 这说明, 红菇属真菌对TP限制反应较敏感, 而青霉菌属不受其限制. TP如何影响红菇菌属和青霉菌属的相对丰度变化, 有待于进一步研究. 此外, 变形菌门具有很强的固氮能力, 对于凋落物分解具有很强的作用, 在土壤营养累积方面可产生一定的影响^{[46, 47]}, 本研究变形菌门中慢生根瘤菌属相对丰度随演替显著上升, 与土壤氮素的积累显著相关. 酸杆菌门对于贫瘠土壤有着很强的耐受性^[48], 在针叶林演替中占据着较高丰度^[49], 本研究中酸杆菌门相对丰度随着演替显著增加, 证实了酸杆菌门在针叶林演替中起显著作用. 属水平下细菌总体丰度较低, 酸杆菌门中Subgroup_6目下未定名属丰度变化与土壤TP显著正相关, 与土壤有机质和氮素呈负相关, 其分类学特征和生态意义有待于进一步研究.

（1）人工油松林演替有效改善了土壤养分状况. 30 a人工油松林土壤中SOM、TN、NH₄⁺-N和NO₃^--N均显著高于10 a和20 a, 而TP和TK含量随演替年限逐渐降低.

（2）不同林龄油松林土壤真菌的优势门为子囊菌门、担子菌门和被孢菌门, 细菌的优势门为放线菌门、变形菌门、酸杆菌门、绿弯菌门和芽单胞菌门.

（3）油松林土壤微生物中细菌总量较真菌多, 占绝对优势. 真菌和细菌拷贝数均随林龄增加显著增加. 演替30 a的油松林土壤真菌和细菌拷贝数相较于10 a的拷贝数, 分别增长了6.61倍和2.55倍.

（4）随着林龄的增加, 土壤真菌多样性显著下降. 青霉菌属相对丰度大幅下降21.07%, 而红菇属相对丰度增加14.2%；油松林土壤细菌多样性和群落结构总体变化较小, 慢生根瘤菌属相对丰度随油松林演替增幅较小, 仅增加3.03%.

（5）人工油松林在演替过程中, 其土壤细菌和真菌生物量、红菇属相对丰度与SOM和TN呈显著正相关关系, 土壤真菌多样性和青霉菌属相对丰度与TP呈显著正相关关系.

（6）综上, 本研究区域整体处于磷限制状态. 人工油松林30 a演替过程中, 土壤碳氮逐渐积累, 而土壤总磷含量进一步降低, 共同导致了土壤微生物群落结构的改变. 其中, 真菌多样性和真菌中红菇属对土壤磷限制最为敏感. 本研究结果可为该区域植被恢复和土壤肥力保育提供科学参考.