2024, Vol. 45
2. 江西师范大学地理与环境学院, 鄱阳湖湿地与流域研究教育部重点实验室, 南昌 330022;
3. 中国科学院东北地理与农业生态研究所, 黑土区农业生态重点实验室, 哈尔滨 150081;
4. 黑龙江省农业科学院经济作物研究所, 哈尔滨 150086
, WANG Chun1 , LONG Yong3 , LIU Gui-hua2 , LI Chun-jie3 , FAN Guo-quan4 , YU Zhen-hua2,3
2. Key Laboratory of Poyang Lake Wetland and Watershed Research Ministry of Education, School of Geography and Environment, Jiangxi Normal University, Nanchang 330022, China;
3. Key Laboratory of Mollisols Agroecology, Northeast Institute of Geography and Agroecology, Chinese Academy of Sciences, Harbin 150081, China;
4. Crops Institute, Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences, Harbin 150086, China
微生物在自然环境中种类丰富且功能多样, 是联系大气圈、水圈、生物圈和岩石圈物质与能量交换的重要纽带, 为人类社会经济发展提供了重要的资源保障. 土壤微生物是地球上最重要的物质分解者, 是驱动地球元素化学循环的“引擎”, 参与土壤有机质形成和转化, 其组成和功能与土壤质量和元素的生物地球化学循环, 乃至人类健康息息相关[1 ~ 3]. 在湿地生态系统中, 土壤微生物不仅加速了湿地植被凋落物和有机质的分解、驱动湿地土壤氮和磷等营养元素的循环转化, 推动了湿地化学能量和信息的流动, 同时还参与了污染物降解与湿地环境修复等过程, 对维持湿地生态系统平衡与稳定起着重要作用[4 ~ 8].
鄱阳湖是我国最大的淡水湖, 湖泊湿地面积约2 700 km2, 是我国湿地生态系统中生物资源最丰富的地区之一, 也是我国公布的首批国家湿地保护地之一, 解析鄱阳湖湿地微生物多样性特征对于明晰微生物参与的湿地生物地球化学循环过程、保护长江流域生物多样性、解决湿地土壤重金属污染和水质污染等诸多挑战具有重要意义[9, 10]. 近年来高通量扩增子和宏基因组测序技术的飞速发展, 使得鄱阳湖湿地中微生物群落结构和丰度特征多样性被更多地认知[11 ~ 14]. 然而, 仅通过分子生物学手段未能直接获得菌株, 在一定程度上限制了对菌株生理功能和实际应用的开发, 不利于进一步获得能够调控和维持湿地土壤养分循环、湿地环境修复和湿地生态系统功能稳定的微生物种质资源. 目前对鄱阳湖湿地土壤微生物多样性研究主要集中在不同生境类型水文环境、不同地上植物和土壤物质循环等方面的特征[15 ~ 18], 对鄱阳湖湿地与其周边土壤可培养微生物的关注还不足. 因此, 若将分子生物学技术与可培养方法结合起来, 不仅有利于明确与邻近的外围土壤与湿地土壤环境中的微生物资源特征, 同时, 又可进一步解析可培养微生物菌株参与的湿地土壤养分循环过程, 为实现微生物功能菌株的定向调控和综合利用奠定基础.
据此, 本研究采集鄱阳湖湿地土壤和湿地外围周边土壤, 利用Illumina MiSeq高通量测序方法对比探究了两种土壤生境下土壤全部细菌和可培养细菌群落结构特征及网络关系, 并利用高通量qPCR功能基因芯片技术解析了可培养细菌中参与湿地土壤碳、氮、磷和硫转化的功能基因丰度. 本研究结果将明确湿地土壤不同于周边非湿地土壤的细菌群落结构特征, 揭示湿地可培养细菌多样性及其在湿地土壤养分循环中的作用, 以期为发掘和利用湿地土壤中可以调控和维持湿地土壤养分循环、促进鄱阳湖湿地生态系统功能稳定的菌种资源提供理论基础.
1 材料与方法 1.1 研究区域概况和土壤样品采集湿地土壤样品采集于南矶湿地野外综合试验站（28°53′51.46″~28°53′51.53″N, 116°19′36″~116°19′42.95″E）, 试验站属于亚热带季风湿润气候, 年平均气温为17.6℃, 年平均降水量为1 450~1 550 mm, 地势低洼, 水淹频繁, 其中淹水时间为3~5个月, 非淹水时间为7~9个月；土壤为草甸沼泽土, pH 5.0~5.6；主要植被是灰化薹草（Carex cinerascens）[19]. 湿地周边土壤取自与湿地有一条公路间隔的5~20 cm土壤. 土壤样品采集于2021年4月. 首先在湿地内选取18个采样点, 每两个样点之间的间距约20 m, 选取5~20 mm土层进行样品采集, 随机将每3个样点的土样混合均匀作为一次重复, 共计6次重复, 用同样的方法在湿地外围采集6次重复的周边土壤样品, 共计12份土壤样品（如图 1）. 采样地点和样点间距如图 1所示. 取样完成后, 将土壤样品置于封口袋中用冰盒运回实验室, 一部分置于4℃冰箱中保存用于菌株分离试验, 一部分置于-80℃冰箱中保存, 用于后续DNA提取等分子生物学试验.
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（a）样品采集地；（b）湿地土壤样品采集示意；（c）湿地周边土壤样品采集示意 图 1 土壤样品采集地点示意 Fig. 1 Diagram of soil sample collection site |
采用细菌通用培养基LB培养基（胰蛋白胨10 g·L-1, 酵母提取物10 g·L-1, NaCl 5 g·L-1, 琼脂粉15 g·L-1, pH 7.4）进行可培养细菌的分离. 为了获得更多可培养细菌, 将4℃冰箱保存的土壤样品, 按照经典的稀释平板法, 选取10-1~10-4稀释度涂布于1/10 LB固体培养基内, 每个稀释度3次重复, 将涂布完成的培养皿置于28℃培养箱中培养48 h. 培养结束后综合菌落形态、大小和颜色, 选取10-2稀释度平板用于土壤可培养细菌DNA提取. 首先用无菌刮板刮取平板上所有细菌菌落后, 将每个平板的菌体收集到1.5 mL无菌离心管中, 再用无菌水多次冲洗刮板和培养基表面, 将冲洗后的菌悬液置于50 mL无菌离心管离心收集菌体, 与上述1.5 mL无菌离心管中的菌体合并, 将每一份土壤样品收集的菌体都合并到一起进行后续DNA提取, 共计获得与土壤样品对应的可培养菌体样品12份. 利用Fast DNA SPIN Kit for Soil试剂盒（Qbiogene Inc., Carlsbad, CA, USA）提取土壤可培养细菌DNA和土壤微生物的总DNA, 具体操作按照试剂盒说明书进行. 利用1%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取质量, 使用紫外分光光度计（NanoDropTM 2000）测定DNA浓度和纯度. 将提取好的DNA样品放到-20℃冰箱保存备用.
1.3 PCR扩增和高通量测序采用细菌的通用引物338F和806R进行PCR扩增[20], 扩增前需在前端引物加上barcode序列以区分来源于不同样品的序列, 同时尽可能使用较低的循环数, 且不同样品扩增的循环数尽量保持一致. 25 μL扩增体系如下：5×FastPfu Buffer 5 μL, 2.5 mmol·L-1 dNTPs 2.5 μL, 正反向引物（5 μmol·L-1）各1.0 μL, FastPfu Polymerase 0.5 μL, BSA 0.25 μL, 模板cDNA 12.5 ng, 剩余体积用超纯水补齐. PCR样品寄送至上海美吉生物医药科技有限公司, 利用公司的Illumina MiSeq PE300平台标准流程进行测序. 试验过程中, 根据具体扩增效果进行调整或优化来提高测序质量, 方便为下游分析提供更多的群落结构信息.
1.4 高通量数据分析高通量数据分析基于美吉生物云平台（https://cloud.majorbio.com/）. 将序列同源性≥97%的序列归为同一类操作单元（OTU）, 完成Ace指数、Chao1指数和Shannon指数计算, 物种群落结构分析、样本比较分析. 采用R软件（version 3.2.5）vegan数据包基于bray-curtis距离进行PCoA分析. 使用R中的“igraph”包, 在Spearman相关的基础上保留出现超过30%的OTU用于网络构建. 使用交互式平台Cytoscape 3.7.1来识别模块（生态集群）并生成网络图及获得相关信息, 包括节点数（Number of nodes）、连线数（link）、平均连通度（Avg. number of neighbors）、图密度（network density）、网络异构性（network heterogenity）、平均路经长（average path length）、平均聚类系数（average clustering coeffience）和模块性（modularity）等.
1.5 可培养细菌功能基因丰度以可培养细菌总DNA为模板, 利用美格基因公司的高通量qPCR功能基因芯片技术进行功能基因的丰度检测. 用高通量自动微量加样设备分别将样品板和引物板试剂添加至高通量qPCR芯片的纳米孔中, 在SmartChip Real-Time PCR System中实行qPCR反应及荧光信号检测, 并自动生成扩增曲线和溶解曲线. 使用Canco软件获得各基因在各样本中的检出情况和Ct值（扩增循环数）, 并以16S rRNA作为内参对数据进行标准化, 得到每个基因在样本中的相对定量. 根据Roche仪器检测获得16S rRNA基因的绝对定量信息, 经过换算获得其它基因的绝对定量信息.
1.6 数据分析利用IBM Statistical Product and Service Solutions（SPSS）Statistics for Windows（Version 26）进行单因素ANOVA和Pearson相关性分析, 采用Duncan显著差异法分析处理间在P < 0.05水平上的差异显著性.
2 结果与分析 2.1 细菌群落α多样性通过对鄱阳湖湿地土壤全部细菌（包括可培养和不可培养细菌, AW）、湿地周边土壤全部细菌（AS）、湿地可培养细菌（CW）和湿地周边土壤可培养细菌（CS）进行测序分析, 每个样品平均获得32 662~43 737条序列, 共计877 379条有效序列. 基于最小序列数目对所有样品进行随机抽平后进行后续分析. 如表 1所示, 相同采样地点的土壤全部细菌群落的OTU数量是可培养细菌群落OTU数量的约20倍, 其α多样性指数也显著高于可培养细菌（P < 0.05）. 比较湿地土壤和湿地周边土壤细菌多样性, 虽然湿地土壤全部细菌（AW）群落的Shannon指数和湿地周边土壤全部细菌（AS）差异表现不显著, 但湿地周边土壤细菌群落的Ace指数和Chao 1指数分别显著高于湿地土壤细菌18.45%和18.35%；比较不同采样地点可培养细菌群落多样性指数, 湿地周边土壤可培养细菌（CS）Shannon指数显著高于湿地可培养细菌（CW）样品, 但不同取样地点的Ace指数和Chao 1指数差异不显著（P < 0.05）.
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表 1 湿地和周边土壤全部细菌及可培养细菌α多样性指数1） Table 1 The α-diversity index of total soil bacterial and culturable bacterial communities in wetland soil and wetland surrounding soil |
2.2 土壤细菌群落结构组成和β多样性分析
基于门（phylum）水平分析鄱阳湖湿地土壤细菌群落结构组成发现[图 2（a）], 湿地土壤（AW）和湿地周边土壤（AS）中共有的细菌优势菌门（相对丰度 > 10%）为变形菌门（Proteobacteria, 39.43%和23.44%）和酸杆菌门（Acidobacteriota, 22.25%和17.12%）, 且这两个优势菌门在湿地土壤中的相对丰度均显著高于湿地周边土壤（P < 0.05）, 此外, 在湿地周边土壤中的优势菌门还包括绿弯菌门（Chloroflexi, 18.55%）, 但在湿地土壤中Chloroflexi的相对丰度仅为4.77%. 同时, 在湿地土壤中发现的主要菌门（相对丰度 > 1%）还包括放线菌门（Actinobacteriota, 8.00%）、厚壁菌门（Firmicutes, 4.80%）、绿弯菌门（Chloroflexi, 4.77%）和热脱硫杆菌门（Desulfobacterota, 1.20%）；在湿地周边土壤中获得的主要菌门与湿地土壤相同, 但相对丰度均表现差异显著, 其中Actinobacteriota和Firmicutes的相对丰度分别降低了344%和300%, Desulfobacterota相对丰度增加了317%. 湿地土壤（CW）和湿地周边土壤（CS）可培养细菌群落的优势菌门中均含有Proteobacteria、Firmicutes和Actinobacteriota, 相对丰度分别为77.9%和85.6%、19.11%和11.52%、2.98%和2.86%. 其中, Proteobacteria和Firmicutes在不同地点土壤样品中相对丰度存在显著差异, 而Actinobacteriota相对丰度表现差异不显著（P < 0.05）.
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（a）门水平：a1. Proteobacteria, a2. Acidobacteriota, a3. Firmicutes, a4. Actinobacteriota, a5. Chloroflexi, a6. Desulfobacterota, a7. Others；（b）目水平：b1. Pseudomonadales, b2. Burkholderiales, b3. Bacillales, b4. Acidobacteriales, b5. Rhizobiales, b6. Micrococcales, b7. Anaerolineales, b8. Paenibacillales, b9. Others；AW表示湿地土壤全部细菌；AS表示湿地周边土壤全部细菌；CW表示湿地土壤可培养细菌；CS表示湿地周边土壤可培养细菌；不同小写字母表示不同采样地及不同方法获得的土壤细菌差异显著性（P < 0.05） 图 2 湿地土壤和周边土壤主要细菌在门和目水平上的相对丰度 Fig. 2 Relative abundance of dominant bacteria at phylum and order levels in wetland soil and wetland surrounding soil |
在目（order）水平上[图 2（b）], 湿地土壤（AW）中伯克氏菌目（Burkholderiales）、厌氧绳菌目（Anaerolineales）和酸杆菌目（Acidobacteriales）相对丰度最高, 分别为15.54%、6.45%和6.12%, 而湿地周边土壤（AS）的优势菌目（相对丰度 > 5%）为Burkholderiales、Acidobacteriales、假单胞菌目（Pseudomonadales）和根瘤菌目（Rhizobiales）, 相对丰度分别为11.97%、9.70%、8.67%和7.41%, 与湿地土壤差异显著（P < 0.05）. Pseudomonadales（76.79%）、芽孢杆菌目（Bacillales, 18.41%）、微球菌目（Micrococcales, 2.77%）和粘类芽孢杆菌目（Paenibacillales, 0.66%）是湿地可培养细菌（CW）的优势菌目；而湿地周边土壤（CS）细菌的优势菌目除Pseudomonadales（75.62%）、Bacillales（8.83%）、Micrococcales（2.72%）和Paenibacillales（2.30%）外, 还获得了伯克氏菌目（Burkholderiales, 6.08%）.
在属（genus）水平, AW、AS、CW和CS分别有430、605、27和36个属. 湿地土壤和周边土壤主要细菌在属水平上的相对丰度如表 2所示, 湿地土壤（AW）细菌优势菌属（相对丰度 > 2%）主要集中在Sideroxydans（3.96%）、HSB_OF53-F07（2.54%）和Thiobacillus（2.04%）；而湿地周边土壤（AS）的优势菌属主要表现为Pseudomonas（8.50%）、Rhodanobacter（3.55%）、Bryobacter（2.62%）和Bacillus（2.52%）. 除Pseudomonas、Bacillus、Brevundimonas、Paenibacillus和Lysinibacillus外, 其余属的相对丰度均表现差异显著. 此外, 在湿地土壤和周边土壤中还检测到了大量的unclassified和norank细菌, 其相对丰度在湿地土壤中高于在周边土壤, 湿地土壤中检测到的Sideroxydans（3.96%）和RBG-16-58-14（1.01%）在周边土壤中未检测到. 但是在湿地土壤中的Others菌属占30.54%, 显著低于周边土壤（43.65%）. 对于可培养细菌, 湿地土壤（CW）和周边土壤（CS）中主要发现的属包括Pseudomonas和Bacillus, 其相对丰度在两种土壤中分别占比76.77%和75.62%, 16.46%和7.06%. 除此还发现少量的Brevundimonas、Paenibacillus、Cupriavidus、Lysinibacillus属以及尚未确定的菌属（unclassified）和其他菌属（Others）.
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表 2 湿地土壤和周边土壤细菌在属水平上的相对丰度/% Table 2 Relative abundance of dominant bacteria in wetland soil and wetland surrounding soil at genus level/% |
基于Bray_curits距离在OTU水平上进行细菌群落的PCoA分析（图 3）, 可以看出, PCoA1和PCoA2两者对鄱阳湖湿地及周边土壤细菌群落变异的解释度为63.82%. 不同样点分布较为分散, 表征微生物群落组间差异的ANOSIM和ADONIS参数也均体现为差异显著.
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图 3 湿地和周边土壤细菌及可培养细菌PCoA分析 Fig. 3 Principal coordinates analysis (PCoA) of total soil bacterial and the culturable bacterial communities in wetland soil and wetland surrounding soil |
如图 4所示, 对湿地土壤和周边土壤细菌群落的网络关系进行构建, 并在门水平上将节点以不同颜色进行区分. 网络参数分析可以看出, 各样品网络模块化指数均大于0.4, 表明细菌群落结构具有模块结构. AS细菌网络的节点数、连线数、平均连通度、网络密度、网络异构性和平均聚类系数均显著高于AW, 但AS细菌网络结构的平均路径长度和模块性相对较小（表 3）. 与AS相比, AW网络结构更为复杂. CW和CS的网络节点数和连线数均明显小于AW和AS.
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每个节点代表 1个OTU；不同颜色的节点表示不同细菌菌门 图 4 鄱阳湖湿地土壤和周边土壤细菌网络结构 Fig. 4 Network structures of bacterial community in wetland soil of Poyang Lake soil and wetland surrounding soil |
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表 3 鄱阳湖湿地土壤和周边土壤细菌群落网络参数 Table 3 Parameters of bacterial network in wetland soil of Poyang Lake soil and wetland surrounding soil |
2.4 湿地土壤和周边土壤可培养细菌功能基因丰度
通过比较湿地土壤和湿地周边土壤可培养细菌的功能基因丰度发现, CW和CS中参与C降解、C固定、N循环、P循环、S循环和甲烷代谢的功能基因丰度存在明显不同（图 5）, 各功能基因丰度总体呈现CW高于CS, 尤以参与N循环的nirS1基因、C降解的abfA、isoP和amyX基因表现最为突出；仅少数基因表现为CS高于CW, 如P循环功能基因phoD基因丰度在CS（8.5×106）中明显高于CW（1.4×106）, 编码S循环基因中的SoxY拷贝数在CS中略高于CW. 参与CW各循环的功能基因中, N循环功能基因平均拷贝数（2.76×106）最多, 其次为C固定基因（1.83×106）和P循环基因（7.45×105）, 拷贝数最多的基因为编码N循环功能中的nirS1基因（2.53×107）、UreC基因（2.18×107）和C固定功能中的acsE基因（6.27×106）；而在CS的功能基因中, 编码P循环基因平均拷贝数（1.40×106）最多, 其次为N循环基因（8.54×105）和C固定基因（7.98×105）, 拷贝数最多的基因为编码N循环功能中的UreC基因（1.28×107）、P循环功能中的phoD基因（8.45×106）和C固定功能中的acsE基因（1.75×106）.
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a1. CDH, a2. abfA, a3. exg, a4. mnp, a5. gmGDH, a6. glx, a7. gam, a8. amyX, a9. manA, a10. chiA, a11. xylA, a12. exoPG, a13. pox, a14. naglu, a15. isoP, a16. apu, a17. amyA, a18. lig, b1. rbcL, b2. korA, b3. acsE, b4. accA, b5. mct, b6. cdaR, b7. aclB, b8. acsA, b9. acsB, b10. pccA, b11. smtA, b12. frdA, c1. narG, c2. nasA, c3. nirS2, c4. nirK1, c5. UreC, c6. nosZ1, c7. amoB, c8. nxrA, c9. napA, c10. nirS1, c11. nirS3, c12. nirK2, c13. gdh, c14. nifH, c15. niK3, c16. nosZ2, c17. hzsB, c18. amoA2, c19. hao, d1. phnK, d2. ppk3, d3. phoD, d4. bpp, d5. pqqC, d6. ppx, d7. phoX, e1. dsrB, e2. SoxY, e3. dsrA, e4. apsA, e5. YedZ, f1. pmoA, f2. emGDH, f3. mmoX, f4. mxa；a13、a14、c2、c8、c18、c19、d7和e1在CW和CS中的相对丰度 < 8×103 copies·μL-1 图 5 参与湿地土壤和湿地周边土壤碳氮磷硫循环的可培养细菌功能基因丰度 Fig. 5 Functional genes abundance of culturable bacteria involved in C/N/P/S cycling in wetland soil of Poyang Lake and surrounding soil |
湿地是介于水生和陆生生态系统之间的一种特殊生态系统, 微生物在湿地生态系统中发挥着重要的作用. 为了探明鄱阳湖湿地土壤微生物多样性和群落结构特征, 本研究选取湿地周边土壤为对照, 所选取的湿地外围周边土壤属于陆生生态系统, 与湿地土壤生态环境差异较大. 从研究结果看, 鄱阳湖湿地土壤细菌群落的Ace指数和Chao1指数显著低于湿地周边土壤, 在属水平上相对丰度表现较低的Others在湿地周边土壤中也显著高于湿地土壤. 可见, 湿地土壤的细菌多样性没有周边土壤丰富. 同时, 从土壤细菌的网络结构分析也可以看出, 湿地土壤的细菌网络结构比周边土壤更为单一. 陈伟等[21]对青藏高原不同类型草地生态系统土壤可培养细菌多样性进行研究发现, 不同类型生态系统细菌多样性变化与相邻生态系统的差异性符合物种-区域的关系, 即微生物应对不同系统间的环境异质性表现出了特定的环境偏好. 本研究结果表明, 环境异质性的偏好同样也会影响湿地土壤的细菌多样性. 也有研究表明, 这种特异性的微生物群落可能是受湿地土壤的淹水频率驱动而形成的[22, 23].
有学者对我国高原湿地、内陆湿地和滨海湿地的细菌群落研究发现, 在不同湿地中变形菌门、酸杆菌门、拟杆菌门、绿弯菌门、厚壁菌门和放线菌门等均表现为优势菌门[24 ~ 26]. 本研究采用了高通量测序方法对鄱阳湖湿地土壤细菌群落进行研究也获得了相似的结果. 可见, 从微生物群落结构看, 鄱阳湖湿地土壤表现出了典型的湿地土壤细菌群落结构特征. 变形菌门、酸杆菌门、放线菌门、厚壁菌门、绿弯菌门和热脱硫杆菌门在鄱阳湖湿地土壤和湿地周边土壤中均被发现, 且不同菌门在不同土壤环境中相对丰度均表现差异显著（P < 0.05）. 其中, 变形菌门和酸杆菌门属于两个土壤采集地点的优势菌门. 变形菌门是细菌中最大的一个门, 在多种生态系统中广泛分布, 如在高寒、高温、高酸的土壤或是人体肠道中均有被发现, 且扮演着重要的生态角色, 不仅参与着环境中的碳、氮和硫等物质循环, 而且在污水处理、生物固氮和调节肠道菌群等方面也发挥着重要的作用[27]. 值得一提的是, 在本研究中湿地土壤中表现丰度较高且与湿地周边土壤有显著差异的属Sideroxydans（3.96%）和Thiobacillus（硫杆菌属, 2.04%）均隶属于变形菌门、γ变形菌纲（Gammaproteobacteria）、伯克氏菌目（Burkholderiales）, Sideroxydans和Thiobacillus均属于环境中常见的功能菌属, Sideroxydans与固氮紧密相关[28, 29], Thiobacillus在脱硫反硝化和除臭中发挥着重要作用, 在城市黑臭水体沉积物中常作为优势菌属出现[30, 31], Sideroxydans和Thiobacillus在湿地生态系统中发挥的具体功能有待于进一步研究. 酸杆菌门是土壤环境中仅次于变形菌门的第二大菌门, 其数量占土壤细菌总数量的20%, 甚至高达50%以上[32, 33], 具有降解植物残体多聚物、参与光合作用和单碳化合物代谢等多种生态功能[32]. 从本研究可以看出, 在湿地土壤这一特殊生态类型中酸杆菌门的相对丰度仍较高, 且高于周边陆地生态系统. 绿弯菌门和热脱硫杆菌门在湿地土壤中的相对丰度显著低于湿地周边土壤. 研究发现, 绿弯菌门和热脱硫杆菌门与环境中的降雨量或硫酸盐浓度等因素有关[34]. 因此, 湿地周边土壤绿弯菌门和热脱硫杆菌门相对丰度的增加可能与其含水量和盐含量的差异有关. 在属水平上, 湿地周边土壤中的优势菌属Pseudomonas（8.50%）、Rhodanobacter（3.55%）、Bryobacter（2.62%）和Bacillus（2.52%）的相对丰度均显著高于在鄱阳湖湿地土壤中表现的丰度, 周边环境中的部分优势菌属为植物促生菌[35 ~ 37], 可在植物生长过程中发挥着合成IAA、解盐、降解乙烯等多种促生作用. 在湿地土壤中unclassified和norank细菌菌属相对丰度显著高于湿地周边土壤. 可见, 湿地环境具有更多的未知菌属有待进一步研究和开发. 综上, 湿地土壤因其特殊的生境已经逐渐演替成了与周边土壤分布完全不同的细菌菌群结构.
为了获得并利用土壤环境中的功能菌株, 目前仍然多采用传统的可培养方法, 即通过连续稀释将不同稀释度的土壤悬液均匀地涂布于固体培养基上, 待微生物生长繁殖形成肉眼可见的菌落后, 根据菌落的大小、形态、颜色等特点逐一挑取并培养. 但是可培养方法有一定的局限性, 一是在连续稀释的过程中, 数量上占弱势的微生物极可能被遗漏[38], 二是在从培养基挑取单菌落的过程中, 往往操作者会根据主观判断造成对部分菌株的忽视, 进而会失去部分菌落资源. 为了全面了解可培养微生物的分类和功能信息, 进一步有针对性地获得可培养功能细菌提供依据, 李凯凯等[38]采用无菌水多次冲洗培养基表面, 再提取水溶液中的总DNA后进行高通量测序的方法. 本研究为了获得尽可能更多的菌体, 在可培养细菌菌体的收集上对前人所用的方法进行了综合. 同时, 鉴于有研究表明土壤环境中的绝大部分微生物可能处于“寡营养”生活状态[38], 为了不丢失“寡营养”细菌的信息, 本研究将细菌通用LB培养基进行了“寡营养”处理, 培养过程中选用了1/10的LB培养基, 发现可培养法富集的细菌OTU数量约为土壤全部细菌数量的5%, 而在获得的可培养细菌中, 除了常见的且广泛应用的Pseudomonas和Bacillus外, 在湿地周边土壤中还获得了Brevundimonas（短波单胞菌属）、Paenibacillus（多粘类芽孢杆菌）和Cupriavidus（贪铜菌）, 这3个菌种在环境治理和农业等领域也有应用[39 ~ 42], 但本研究中这3种菌属在湿地土壤全部细菌或是湿地周边土壤全部细菌相对丰度中表现并不突出（均 < 0.3%）. 可见, 将高通量测序数据与传统的可培养方法结合更能全面、准确地反映土壤环境中的微生物特征. 本研究测序结果也发现酸杆菌门是丰度较高的门, 但其在可培养细菌中所占比例并不高, 再次印证了酸杆菌门虽在湿地土壤或周边土壤中广泛存在, 但具有难培养或不可培养的特点[32]. 但为了获取更多的微生物菌种资源, 未来可优化获取可培养细菌的方法, 定向富集或筛选多样性更为丰富的特异微生物菌种, 开展更多关于湿地土壤环境中菌株生理特征、元素循环功能的研究.
进一步对湿地和周边土壤可培养细菌参与主要元素循环的功能基因丰度进行分析发现, 与可培养细菌多样性研究结果相反, 除极少几个功能基因外, 绝大多数功能基因在湿地中的丰度均明显高于周边土壤, 佐证了湿地土壤和周边土壤可能具有不同的养分循环过程. 其中, 参与C固定的功能基因丰度高于C降解的功能基因丰度, 但同时湿地参与甲烷代谢的功能基因丰度也较高. 因此, 目前湿地和周边土壤有机碳积累过程是否大于消耗过程还尚未可知. 参与氮循环的功能基因中, 与氮矿化过程相关的UreC基因和反硝化过程相关的nirS1基因在湿地土壤中远高于周边非湿地土壤, 上述两个基因参与的氮循环过程均与氮的损耗有关, 表明湿地土壤比非湿地土壤可能会有更多的氮消耗. 张杰等[43]的研究也表明, 与不同年限围垦土壤相比, 湿地土壤总氮含量最低. 参与P循环的phoD基因丰度在周边土壤中明显高于湿地土壤, phoD基因是碱性磷酸酶基因家族3种类型之一, 也被认为是土壤中最重要的碱性磷酸酶基因, 其编码的碱性磷酸酶驱动土壤中有机磷矿化并可释放生物有机磷, 因此, 该基因也可以作为监测生态系统中编码碱性磷酸酶细菌多样性和分布的标记基因[44]. 参与S循环的功能基因主要有SoxY和YedZ, 两者在湿地土壤和非湿地土壤中丰度差异不明显. 日后可进一步对可培养菌株进行分离纯化, 开展关于菌株生理功能、靶标基因和基因组学分析, 完善可培养细菌数据库, 从基因水平揭示其对元素循环所发挥的具体作用, 并将其应用到农业生产和环境修复等.
4 结论（1）湿地土壤细菌群落结构多样性低于周边土壤, 两种土壤生境下细菌群落结构组成存在一定差异, 湿地土壤的优势菌门为变形菌门和酸杆菌门, 优势菌目为伯克氏菌目、厌氧绳菌目和酸杆菌目, 且相比较周边土壤, 湿地土壤网络结果较简单.
（2）采用可培养方法获得的两种土壤生境下细菌群落多样性差异不明显, 优势菌门中均含有变形菌门、厚壁菌门和放线菌门, 其中, 变形菌门和厚壁菌门在不同生境土壤样品中相对丰度存在显著差异, 而放线菌门相对丰度表现差异不显著.
（3）大部分参与土壤C/N/P/S循环的功能基因在湿地中的丰度均明显高于在周边土壤的丰度, 预示了湿地土壤和周边土壤具有不同的养分循环过程.
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