2. 上海市岩土工程检测中心有限公司, 上海 200436
2. Shanghai Geotechnical Engineering Detecting Centre Co., Ltd., Shanghai 200436, China
地下水是我国自然资源的重要组成部分, 是保障经济社会可持续发展的重要战略资源[1].随着我国社会、经济和工农业的快速发展, 大量污废水排放会渗入地下水中, 极易造成地下水污染, 局部地区地下水污染形势严峻, 尤其是工业企业区域及周边, 三氮[2]、重金属[3]和有机物[4]等指标检出率高, 甚至出现超标现象[5, 6].
理化性质的改变不仅影响了地下水环境质量, 也会造成地下水微生物群落的演变.微生物是地下水污染演变的主要参与者, 一方面它可以指示地下水环境变化, 另一方面也可以对污染作出响应[7].微生物受到地下水环境因素变化影响后, 其群落结构和功能也会随之改变[8], 主要是利用自身调节作用来适应环境的变化.以有机污染物为主的地下水, 细菌会将有机物作为能量和营养物质, 通过生长代谢等一系列反应, 直接或间接将污染物转化为碳、水等物质, 从而改变其群落结构并达到降解污染的功能[9, 10].Amano等[11]研究显示, 大部分微生物能够净化地下水中的有机污染物.也有学者研究发现随着地下水有机污染物的增加, 地下水中的碳源种类也随之增加, 从而提升地下水中微生物多样性[12~14].然而, 以金属和无机污染物为主的地下水, 细菌群落结构和功能会呈现不同的情况.许霞等[15]研究表明, 工业园区地下水无机组分高的点位微生物多样性和丰富度较低.薛银刚等[16]研究常州某工业区地下水的微生物群落发现, 工业企业较少的点位的微生物群落丰富度和均匀度明显高于有污染源点位的, 原因是地下水受到了重金属污染.总体而言, 目前我国地下水环境质量主要关注常规化学指标和毒理学指标, 微生物指标仅涉及菌落总数和总大肠菌群; 对于工业企业地下水的研究也主要集中于污染评价和修复治理等方面, 地下水细菌群落多样性及其与环境因子相关性等方面的研究鲜见报道.另外, 以往地下水细菌群落多样性的研究主要是基于传统微生物测定方法[17~19], 存在操作繁琐和分辨率低等缺点, 而高通量测序技术(high-throughput sequencing)则克服了这些缺陷[20], 可以从不同层面对地下水微生物进行全面的解释[21].
本文选取上海市2个典型工业集聚区, 采集浅层地下水样品, 利用Illumina MiSeq高通量测序技术研究地下水细菌群落的多样性和组成结构, 并结合地下水三氮、重金属和有机物等指标分析, 探讨主导行业地下水细菌群落多样性特征及其与环境因子的关联性和响应机制, 以期为工业区地下水污染评价、风险管控和微生物修复治理工作提供理论支持.
1 材料与方法 1.1 典型工业区及采样点确定本研究选择上海市2个典型工业区, 其中工业区一(XH)面积8.78 km2, 工业区二(SJ)面积43.69 km2, 主要涉及石油加工-炼焦及核燃料加工、化学原料及化学制品制造、有色金属冶炼及压延加工、纺织、皮革毛皮、羽毛(绒)及其制品等行业类型, 按照主导行业分为石油化工业、金属制品业、纺织业和其他这4个类型(图 1).区域浅层地下水水位埋深在1.0 m左右, 丰枯季节随降水量和径流影响水位变化在0.5~1.0 m; 地层渗透性和富水性均较差, 渗透系数普遍小于0.5m·d-1, 单井涌水量普遍小于1.0m3·d-1.
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图 1 研究区域布点位置示意 Fig. 1 Location distribution of sampling sites |
工业区地下水监测布点以布设在污染风险较大的企业周边为主, 选择原则主要为3点:①企业原材料、中间产物和产品等以化工、金属制品和纺织等主导行业为主; ②企业存在危废储存仓库和污废水处理站优先选择; ③企业历史上发生过地下水污染事故和周边居民投诉等情况优先选择.依此, 2020年在2个工业区各筛选8个点位新建浅层地下水监测井, XH工业区监测井编号为XH-1~XH-8, SJ工业区监测井编号为SJ-1~SJ-8.其中, 纺织业:XH-1、XH-8、SJ-6和SJ-7共4个点位; 金属制品业:XH-2、XH-4、SJ-5和SJ-8共4个点位; 石油化工业:XH-3、XH-6、XH-7、SJ-3和SJ-4共5个点位; 其他行业:XH-5、SJ-1和SJ-2共3个点位.
1.2 样品采集与前处理 1.2.1 样品采集地下水监测井于2020年7月建成, 成井深度为6 m, 并于同年8月(丰水期)、10月(平水期)和12月(枯水期)分3次采集地下水样品, 用于检测理化性质和细菌群落.采样前按规范进行监测井洗井, 后用贝勒管采集地下水, 每个点位采集水样10 L于4℃低温保存并及时送至实验室进行检测分析.
1.2.2 地下水细菌群落检测样品前处理地下水微生物检测前先用800目滤网进行初筛, 再用0.2 μm聚碳酸酯膜置于抽滤机上抽滤.考虑到地下水菌群含量较低, 每个地下水样品抽滤用量3~4 L, 以滤膜上可见明显覆盖物为止.抽滤完成后及时将滤膜置于无菌离心管中并-80℃保存, 及时送实验室检测分析.
1.3 检测分析方法理化指标:综合区域水文地质条件和筛选点位的主导行业类型, 选择三氮、重金属和有机物等19项指标进行检测分析, 检测方法参照《地下水质量标准》(GB 14848-2017)[22].
高通量测序:首先进行脱氧核糖核酸(DNA)提取和聚合酶链式反应(PCR)扩增, 采用E.Z.N.A.Ⓡ Soil DNA Kit(Omega Bio-Tek)试剂盒提取地下水滤膜样品中的微生物DNA, 采用NanoDrop2000紫外-可见分光光度计测定DNA纯度和浓度, 最后用1%琼脂凝胶电泳, 检测DNA完整性.使用338F (5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′) 和806R (5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′) 对16S rRNA基因V3-V4可变区进行PCR扩增, 先95℃预变性3 min, 然后72℃稳定延伸10 min, 最后4℃进行保存.将PCR产物混合后使用2%琼脂糖凝胶回收, 纯化PCR产物, 利用Illumina公司的MiSeq PE300平台进行测序, 使用fastp软件对原始测序序列进行质控, 使用FLASH软件进行拼接, 使用UPARSE软件97%的相似度对序列进行操作分类单元(OTU)聚类并剔除嵌合体, 最后将OTU按序列抽平作后续分析使用.
1.4 数据统计分析方法原始数据均值及标准差采用Excel 2020计算, 地下水理化性质、细菌多样性指数、细菌组间差异采用SPSS24单因素方差分析, 环境因子与细菌相关性采用皮尔逊(Pearson)相关性分析.
2 结果与讨论 2.1 地下水理化性质分析对照《地下水质量标准》(GB /T 14848-2017), 评价16个点位丰平枯3期地下水19项理化指标监测结果(表 1), 结果显示:2个工业区浅层地下水环境质量总体尚好, pH值无明显差异, 整体呈弱碱性, 硝酸盐氮(NO3--N)、铜(Cu)、锌(Zn)和铅(Pb)等8项指标达到Ⅰ类标准, 亚硝酸盐氮(NO2--N)、锑(Sb)和氯化物(Cl-)等4项指标达到Ⅱ类标准, 氨氮(NH4+-N)、铁(Fe)和锰(Mn)等4项指标相对较差; 石油化工业区域地下水的NH4+-N为Ⅴ类, Fe和Mn为Ⅳ类.从不同行业类型来看, 石油化工业区域地下水的NH4+-N显著高于纺织业、金属制品业和其他行业(P < 0.05), 分别高出64.49%、32.46%和113.91%, 与薛银刚等[16]研究的结果一致.纺织业总石油烃(TPH)浓度显著低于金属制品业、石油化工业和其他行业(P < 0.05), 分别降低69.86%、52.05%和89.04%; 石油化工业TPH浓度略低于金属制品业和其他行业, 但无明显差异(P>0.05), 可能是与纺织业和石油化工业区域地下水中石油烃降解菌富集, 因而地下水中TPH被得到有效降解有关[23].石油化工业区域地下水挥发酚浓度显著高于纺织业、金属制品业和其他行业, 分别高出1 566.67%、150.00%和25.00%, 可能是由于石油化工和炼焦等生产过程中地面渗漏和污水排放扩散等途径增加了地下水中挥发酚的浓度, 与刘娇等[24]研究的结果一致.金属制品业区域地下水重金属浓度普遍高于其他3种类型, 砷(As)浓度显著高于石油化工业和其他行业(P < 0.05), 分别高出49.26%和50.59%; 汞(Hg)浓度也显著高于石油化工业(P < 0.05).
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表 1 地下水样品的理化指标和类别1) Table 1 Physical and chemical properties and categories of groundwater samples |
2.2 地下水细菌多样性和群落结构分析 2.2.1 地下水细菌OTU水平分析
2个工业区16个地下水样点细菌高通量测序共获得序列5 801 221条, 测序平均长度为372 bp.在97%分类水平下, 不同行业类型的OTU分别为纺织业729、金属制品业4 180、石油化工业5 593和其他行业4 151.将OTU进行Venn图分析(图 2), 以描述不同行业地下水细菌群落结构的差异, 结果表明4种行业类型差异较大.4种行业共有的OTU为1 631个, 占总OTU的18.52%.各行业特有OTU从大到小为:石油化工业>纺织业>金属制品业>其他行业, 石油化工业最高, 达1 578, 占总OTU的17.92%; 其他行业特有OTU数目最低, 为591, 占总OTU的6.71%.金属制品业和石油化工业共有OTU为427个, 占总OTU的4.85%; 纺织业和其他行业共有OTU较低, 为337个, 占总OTU的3.83%, 表明金属制品业和石油化工业细菌群落同源性较高[25].
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图 2 细菌OTU水平Venn图 Fig. 2 Venn diagram of bacteria OTU level |
采用α多样性指数来分析不同行业地下水细菌群落多样性和丰富度[26], 如表 2所示.Coverage指数均在99%以上, 无显著性差异, 表明样本测序深度合理, 测序结果接近真实情况.地下水细菌群落多样性Shannon指数分析结果表明, 各行业排序为:纺织业>其他行业>石油化工业>金属制品业.细菌群落丰富度Ace指数和Chao指数分析结果可知, 各行业排序为其他行业>纺织业>石油化工业>金属制品业.有研究表明, 纺织业废水中有机物浓度高, 能为细菌生长繁殖提供良好的生存条件, 这可能是其地下水细菌多样性最高的原因[27]; 金属制品业地下水细菌多样性和丰富度均为最低, 这可能是由于金属制品业区域地下水金属浓度较高抑制了细菌的生长繁殖[28].
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表 2 α多样性指数 Table 2 The α diversity index |
2.2.3 地下水细菌群落主成分分析(PCA)
采用主成分分析法来表征不同行业类型之间细菌群落结构的差异性和相似性, 结果如图 3所示.纵轴解译度较低, 为4.25%, 而横轴解释度较高, 达8.60%.横轴看纺织业、金属制品业和其他行业类型样本点距离较近, 说明这3种行业群落组成更加相似.纺织业和其他行业的地下水样本均集中在第1、3象限, 金属制品业和石油化工业的样本均在第2、4象限分散开, 表明其他行业与纺织业的地下水细菌群落结构较为相似, 金属制品业和石油化工业则存在差异.总体而言, 不同行业类型地下水细菌群落结构的相似或差异, 可能是受到地下水理化指标类型和浓度差异的影响.
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图 3 不同行业类型地下水细菌群落PCA图 Fig. 3 PCA diagrams of groundwater bacteria communities in different industries |
将OTU进行物种注释后, 共检测到65个细菌门, 将相对丰度低于0.5%的门合并为others, 得到门水平相对丰度, 如图 4所示.变形菌门丰度最高, 其不同行业类型相对丰度依次为:石油化工业(86.18%)>金属制品业(82.14%)>其他行业(81.32%)>纺织业(80.05%).石油化工业变形菌门相对丰度最高可能与其地下水含氮水平较高相关, 因为变形菌门对含氮或有机物污染废水具有降解作用, 与刘莹等[29]研究的结论一致.其次的优势菌门包括拟杆菌门(Bacteroidota)、厚壁菌门(Firmicutes)、放线菌门(Actinobacteriota)、Desulfobacterota、蛭弧菌(Bdellovibrionota)和CPR超级杆菌(Patescibacteria)等, Kadnikov等[30]研究发现地下水中厚壁菌门、绿弯菌门、变形菌门和拟杆菌门为主要优势菌门, 其中厚壁菌门占比最高, 主要是由地下水环境因子差异所造成.CPR超级杆菌则广泛存在于地下水和湖泊沉积物中, 可以很好地适应地下水环境[31].
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图 4 不同行业类型地下水中细菌的相对丰度(门水平) Fig. 4 Relative abundance of bacteria in groundwater of different types of industries (phylum level) |
本研究共检测到1 321个细菌属, 将相对丰度低于1%的属合并为others, 得到属水平相对丰度, 如图 5所示.纺织业优势菌属为unclassified_ f_Comamonadaceae、红细菌属、弯曲杆菌属和Gallionella等, 分别占细菌总数的19.16%、8.47%、6.16%和4.99%.金属制品业的优势菌属为unclassified_ f_Comamonadaceae、Ralstonia、弯曲杆菌属和Malikia等, 分别占细菌总数的20.99%、12.50%、10.69%和8.62%.有研究表明, Ralstonia可以降解苯酚等有机物, 对重金属也有一定耐受性[32, 33], 且是一种典型的砷氧化菌和铁氧化菌[34].Ruprecht等[35]研究表明, Malikia和hcgl_clade是好氧反硝化菌, 可以对污染物浓度变化作出响应, 并且在营养丰富的条件下进行硝酸盐还原.石油化工业的优势菌属为弯曲杆菌属、unclassified_ f_Comamonadaceae、Sulfuritalea和Ralstonia等, 分别占细菌总数的18.07%、15.24%、5.76%和5.57%, 其中Sulfuritalea可实现石油烃类厌氧降解[36].其他行业中优势菌属为Novosphingobium、unclassified_ f_Comamonadaceae、弯曲杆菌属和脱氯单胞菌属(Dechloromonas)等, 分别占细菌总数的11.26%、11.11%、9.96%和5.60%.噬氢菌属在4组样本中均有检出, 其常存在于石油烃或其他有机物浓度较高的地下水中, 可降解多种有机污染物[37].
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图 5 不同行业类型地下水中细菌的相对丰度(属水平) Fig. 5 Relative abundance of bacteria in groundwater of different types of industries(genus level) |
地下水环境因子与细菌群落门水平相关性分析结果如图 6所示.结果显示, 纺织业地下水中显著影响细菌群落结构的环境因子为NO2--N、Sb、Hg、TPH和Fe等(P < 0.05), 金属制品业为NO2--N、As、Hg、TPH、Mn和Cl-等(P < 0.05), 石油化工业为NH4+-N、As、TPH、SO42-和Fe等(P < 0.05); 其他行业为NO2--N、Se、TPH、Cl-等(P < 0.05).变形菌门和拟杆菌门受环境因子影响较大, 在纺织业和石油化工业, As与变形菌门呈正相关, 可能是由于变形菌门对As有较高抗性, 可在高As地下水环境中正常生长[38].同时, 变形菌门中有许多细菌还可利用碳源快速生长[39, 40], 这也是变形菌门丰度最高的原因之一. 纺织业和石油化工业地下水NH4+-N浓度较高, 相较于金属制品业和其他行业, 细菌群落结构存在较大差异.本研究表明不同行业类型地下水理化性质不同, 会直接影响细菌群落结构, 这与Ji等[41]研究的结果一致.
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红色箭头表示环境因子, 蓝色箭头表示细菌, 红点表示样本组 图 6 地下水环境因子与细菌门水平的相关性RDA图 Fig. 6 RDA diagram of correlation between environmental factors in groundwater and bacteria in phylum level |
地下水环境因子与细菌群落属水平相关性分析结果如图 7所示.与地下水三氮和有机指标相关的多为硝化菌、反硝化菌和有机物降解菌等.纺织业和石油化工业Sulfuritalea与NO3--N和NO2--N均呈极显著负相关(P < 0.01), 与NH4+-N呈显著正相关(P < 0.05).Sampaio等[42]研究表明, Sulfuritalea可在厌氧条件下降解石油烃类污染物, 而NH4+-N作为营养物质, 可以刺激石油降解菌的生长而加速石油烃的降解.纺织业弯曲杆菌属与TPH呈极显著正相关(P < 0.01), 与挥发酚呈极显著负相关(P < 0.01); 红细菌属与TPH呈显著负相关(P < 0.05), 与挥发酚呈极显著正相关(P < 0.01), 红细菌属在有氧条件下具有较强的代谢能力, 从而降解有毒有害物质.金属制品业中噬氢菌属与NO2--N呈显著正相关(P < 0.05), 其他行业噬氢菌属与NH4+-N、NO3--N、NO2--N均呈显著正相关(P < 0.05).噬氢菌属是一种反硝化菌属, He等[43]研究发现, 该菌属常存在于硝酸盐浓度较高的地下水中, 能通过反硝化作用降低硝酸盐浓度.金属制品业Ralstonia与TPH呈显著负相关(P < 0.05), 与挥发酚呈显著正相关(P < 0.05).
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(a)纺织业, (b)金属制品业, (c)石油化工业, (d)其他行业; a1.TPH, a2.As, a3.NO3--N, a4.SO42-, a5.Mn, a6.Ni, a7.Sb, a8.高锰酸盐指数, a9.NO2--N, a10.Cl-, a11.Fe, a12. NH4+-N, a13.Se, a14.Cu, a15.Zn, a16.挥发酚, a17.pH, a18.Pb, a19.Hg; A1. unclassified_ f_Comamonadaceae, A2. Rhodobacter, A3. Curvibacter, A4. Gallionella, A5. Sulfuritalea, A6. Novosphingobium, A7. Reyranella, A8. Hydrogenophaga, A9. Sideroxydans, A10. Methylotenera; b1.pH, b2.Hg, b3.Fe, b4.Cu, b5.挥发酚, b6. NH4+-N, b7.Mn, b8.NO2--N, b9.Zn, b10.NO3--N, b11.Cl-, b12.Se, b13.SO42-, b14.Sb, b15.高锰酸盐指数, b16.Pb, b17.As, b18.TPH, b19.Ni; B1. unclassified_ f_Comamonadaceae, B2. Ralstonia, B3. Curvibacter, B4. Malikia, B5. Dechloromonas, B6. Sphingomonas, B7. Novosphingobium, B8. Hydrogenophaga, B9. Sediminibacteriun, B10. Pedobacter; c1.NO2--N, c2. pH, c3.Sb, c4.Zn, c5.Ni, c6.SO42-, c7.NO3--N, c8.Fe, c9.Hg, c10.Mn, c11.Cl-, c12.Se, c13.NH4+-N, c14.As, c15.TPH, c16.挥发酚, c17.Pb, c18.高锰酸盐指数, c19.Cu; C1. Curvibacter, C2. unclassified_ f__Comamonadaceae, C3. Sulfuritalea, C4. Ralstonia, C5. Methyloparacoccus, C6. Gallionella, C7. Novosphingobium, C8. unclassified_ f__Rhodobacteraceae, C9. Rhodobacter, C10. Reyranell; d1. pH, d2.挥发酚, d3.Se, d4.Cl-, d5.Pb, d6.Cu, d7.Fe, d8.Hg, d9.SO42-, d10.Mn, d11.TPH, d12.NH4+-N, d13.Zn, d14.As, d15.NO3--N, d16.NO2--N, d17.高锰酸盐指数, d18.Ni, d19.Sb; D1. Novosphingobium, D2. unclassified_ f__Comamonadaceae, D3. Curvibacter, D4. Dechloromonas, D5. Methylocystis, D6. Hydrogenophaga, D7. Gallionella, D8. Sulfuritalea, D9. Reyranella, D10. Sediminibacterium; *表示显著性相关(P < 0.05), **表示极显著性相关(P < 0.01), ***表示极显著性相关(P < 0.001); 红色表示正相关, 蓝色表示负相关, 白色表示无相关性 图 7 地下水环境因子与属水平细菌的相关性Heatmap图 Fig. 7 Heatmap of correlation between environmental factors in groundwater and bacteria in genus level |
与地下水金属指标相关的多为铁氧化菌、砷还原菌和硝酸盐还原菌等.有研究表明, 噬氢菌属在特定环境中可参与重金属氧化还原过程, 对地下水重金属迁移转化过程起到一定作用[44]. Gallionella在纺织业地下水中与Pb、Se和Cu等呈极显著正相关(P < 0.01), 但在石油化工业地下水中与As和Pb呈极显著负相关(P < 0.01).金属制品业Malikia与Zn和As呈极显著正相关(P < 0.01), 与Hg呈极显著负相关(P < 0.001). Sphingomonas是金属制品业特有优势菌属, 柯添添[45]研究发现, Sphingomonas是一种耐As微生物, 与Hg呈极显著正相关(P < 0.001), 与Zn和As呈显著负相关(P < 0.05).纺织业中Sulfuritalea与As、Ni和Sb等呈显著负相关(P < 0.05), 与Pb和Hg呈显著正相关(P < 0.05).
3 结论(1) 纺织业地下水细菌多样性最高, Shannon指数达3.14, 金属制品业地下水Shannon指数和Ace指数均最低, 分别为2.42和960.46.纺织业和石油化工业有机物浓度较高, 能促进细菌生长繁殖, 而金属制品业地下水中金属物质抑制了细菌的生长繁殖.
(2) 工业区地下水中变形菌门丰度最高, 占比为80.05%~86.18%, 其次依次为拟杆菌门、厚壁菌门、放线菌门.石油化工业和金属制品业地下水细菌群落结构差异较大, 主要受两者地下水环境因子差异所影响.
(3) 与地下水三氮和有机物相关的多为硝化菌、反硝化菌和有机物降解菌等, 其中Sulfuritalea可有效降解石油烃类污染物; 与地下水重金属相关的多为铁氧化菌和砷还原菌等, 其中噬氢菌属对地下水重金属迁移转化起到一定作用.
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