2023, Vol. 44
冬小麦是中国重要的粮食作物之一, 其产量占中国半干旱区农业生产的70%以上[1].关中地区地处陕西省中部, 是冬小麦主要粮食生产区.该地区属于资源型缺水地区, 降雨量较少且主要集中在夏季, 限制了农业生态系统中的养分循环和作物生长.而冬小麦生产中过量施用氮肥造成土壤氮素的大量盈余, 进而导致土壤结构恶化、肥料利用率下降和微生物活性降低等一系列问题[2, 3].
生物炭是生物质在完全或部分缺氧、相对温度较低的条件下经热解炭化产生的一类富碳物质[4, 5], 具有容重小、多孔、比表面积大、呈碱性和含有一定量矿质养分等特点, 具有优良的吸附特性和较强的抵抗土壤微生物分解的稳定性[6].近年来, 生物炭作为碳源、土壤改良剂以及肥料缓释载体备受重视[7, 8].已有多项研究表明, 生物炭对土壤理化性质有明显的改善, 可以提高土壤含水量、降低容重[9]和增加土壤有机碳含量, 同时对土壤养分的保持至关重要[10].此外, 生物炭对NH4+的强吸附可以减少氮的挥发[11], 提高氮素利用效率, 降低氮淋失[12].生物炭的高碳氮比可以抑制氮素微生物的转化和反硝化, 改变农田生态系统的氮循环, 有利于促进作物生长和提高产量[9, 13].因此, 将生物炭作为改良剂与氮肥配施, 有助于改善土壤结构、进而提高土壤肥料利用率.
土壤微生物作为重要的分解者, 在生态系统物质循环与能量流动中扮演着重要角色, 调控着碳和养分在土壤-植物-大气连续体(SPAC)之间的循环[14], 是联系植物和土壤的重要因素[15].此外, 由于土壤微生物对环境变化的敏感性, 土壤微生物的群落结构、组成和多样性可作为评价土壤质量和肥力的重要指标[16, 17].生物炭的添加改变了微生物的栖息地, 直接或间接地影响它们的代谢活动并改变了微生物群落的丰度和多样性[18].Xu等[12]基于短期的培养试验发现, 施用2%、4%和8%玉米秸秆生物炭增加潮土细菌多样性, 且与生物炭添加量呈正相关. Zhang等[19]在东北黑土单次施用10~50 t·hm-2玉米秸秆生物炭2 a后, 发现细菌和真菌Shannon指数均显著降低.生物炭对土壤微生物的影响差异较大, 这种差异性可能与土壤的类型、利用方式以及生物炭的种类、用量等有关[20].此外, 生物炭对土壤微生物群落结构的影响也会随着时间的推移而发生变化[21].由于添加到土壤中的生物炭非常稳定, 生物炭老化过程有望在生物炭-土壤系统中达到化学交换和生物活性的平衡, 因此“老化”的生物炭对土壤物理化学和生物特性的长期影响可能与“新鲜”的生物炭不同[18, 22].作物的生长季节是农业系统中土壤细菌群落结构变化的另一个驱动因素.在作物生育期内, 根系的生长发育以及与之相关的根系沉积变化, 即作物根系向土壤中渗出的无机碳, 可能会改变有机化合物的空间分布和质量, 从而影响细菌群落的动态变化[23, 24].然而, 大多数研究仅在整个作物生长的单一阶段进行采样, 只有少部分报道了不同生育时期的细菌群落对生物炭的响应.
虽然许多研究已经检验了生物炭对土壤特性和冬小麦作物生长的影响[25, 26], 但对于土壤微生物介导的冬小麦产量提高的机制仍不清楚.因此, 本试验基于7 a田间定位试验, 从土壤微生物角度研究不同施用量生物炭对冬小麦不同生育时期土壤特性、土壤细菌群落多样性和冬小麦生长的影响, 以期为生物炭在农田中的合理施用提供科学参考.
1 材料与方法 1.1 试验区概况和试验设计研究区域位于陕西省杨凌区西北农林科技大学农作物教学标本区(东经108°24′, 北纬34°20′), 海拔在521 m左右, 属暖温带季风性气候, 半干旱.年均气温在11~13℃之间, 无霜期210 d左右, 年均日照时数约2 196 h, 年均降雨量在500~700 mm间.试验区的土壤类型为塿土(其中黏粒36.5%, 粉粒61.1%, 砂粒2.4%). 0~20 cm的耕层土壤ω(有机质)为14.09 g·kg-1, ω(碱解氮)为51.22 mg·kg-1, ω(速效磷)为7.61 mg·kg-1, ω(速效钾)为150.06 mg·kg-1, 土壤pH值为7.58(水土比2.5∶1).
本试验设置4个处理, 分别是生物炭施用量为0 t·hm-2(B0对照)、5 t·hm-2(B1)、10 t·hm-2(B2)和20 t·hm-2(B3), 每一处理进行3次重复, 随机区组设计, 小区面积为5 m×5 m=25 m2.本试验所施用的生物炭购自河南三利新能源公司, 由小麦秸秆在500℃厌氧热解制备.于2011年10月冬小麦播前由旋耕机混翻施入土壤(0~20 cm), 2016年10月以相同施入量在冬小麦播种前补施一次.生物炭的基本理化性质如表 1所示.供试小麦品种为陕麦139, 于2017年10月23日播种, 播种量为225 kg·hm-2, 所施肥料：尿素为375 kg·hm-2 [ω(N)=46%]和磷酸二铵为300 kg·hm-2[ω(P2O5)=46%], 在播种前一次性施入.后茬作物为夏玉米.其他管理同当地常规管理方式, 处理间一致.
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表 1 第一次和第二次施用生物炭的基本理化性质 Table 1 Basic physical and chemical properties of biochar applied for the first and second time |
1.2 样品的采集和分析
分别于冬小麦扬花期(2018年4月26日)和成熟期(2018年6月5日), 在各试验小区内以五点取样法采集0~20 cm土层样品, 去除植物碎屑和碎石, 混合样品后放于冷藏箱内带回实验室分析测定.将过2 mm筛的土壤样品分为3个部分：一部分保存在-80℃下进行DNA提取和分析, 一部分保存在-20℃下进行硝、铵态氮测定, 其余自然风干用于测定土壤有机碳、全氮和pH.于两个生育时期在每个小区选取均匀连续两行20 cm植物样品, 并储存在纸袋中.生物量样品在105℃下杀青30 min, 然后在80℃下干燥至恒重, 以称量其干生物量.将干燥的植物样品磨碎, 采用凯氏定氮法测定全氮含量.土壤水分用烘干法测定、土壤全氮用凯式消煮法测定、土壤pH值用电位法测定、土壤有机质用重铬酸钾容量法测定、土壤硝态氮和铵态氮含量用流动分析仪测定.其中, 氮素吸收效率的计算公式为：
氮素吸收效率(NupE, kg·kg-1)=单位面积植株地上部总的氮积累量(kg·hm-2)/单位面积总施氮量(kg·hm-2)
1.3 16S rRNA基因序列及生物信息学分析土壤样品总DNA使用FastDNA® Spin Kit for Soil进行提取.提取的总DNA浓度和质量用分光光度计测定(NanoDrop2000, Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA), 再用带有barcode的特异引物扩增16S rDNA的V3+V4区.扩增引物序列为：341F：CCTACGGGNGGCWGCAG; 806R：GGACTA CHVGGGTATCTAAT.基因扩增产物送至广州基迪奥生物科技有限公司进行高通量测序(Illumina HiSeq PE250).土壤细菌高通量测序数据分析均是基于广州基迪奥生物科技有限公司所提供的Omicsmart在线分析系统(http://www.omicsmart.com)进行, 项目号为GDD3625-1.具体的数据分析软件和算法参考广州基迪奥生物科技有限公司官方网站提供的说明.
1.4 数据分析数据多组间的比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)和最小显著性差异(least significant difference)法, 用SPSS 23.0(IBM Crop, Chicago, IL, USA)软件处理分析数据.采用R语言中的VennDiagram包绘制土壤细菌OTUs组间比较的Venn图; 用Heatmap包和Psych包对样品细菌群落结构组成与理化因子进行相关分析作出热图; 使用Qiime软件计算各个样品的α多样性; 采用基于Bray-Curtis距离矩阵的非度量多维尺度分析(non-metric multidimensional scaling, NMDS)确定细菌群落β多样性差异; 采用冗余分析(redundancy analysis, RDA)阐明土壤细菌群落与土壤理化性质的关系.本研究保留了丰度大于0.2%的OTUs, 以解释细菌类群中OTUs之间的关系.使用R语言中的Psych包计算网络分析的成对相关系数矩阵.统计学上显著相关(使用Spearman系数、ρ、P＜0.05), ρ值＞0.6用于网络分析[27].使用Gephi 0.9.2进行网络可视化, 相关参数(节点和连接数、平均度、平均聚类系数和模块化)按照前人描述的方法计算[28].利用偏最小二乘路径模型(PLS-PM)研究了不同生物炭施用量下土壤理化性质、细菌群落与作物生长的关系.利用PLS-PM可以确定潜在变量(即生物炭施用量、生育时期、土壤参数、土壤细菌群落和作物生长指数)对观测变量的解释程度.路径系数和R2用于显示潜在变量之间关系的强度和方向, 并评估解释方差的比例.当提取的平均方差(AVE)大于0.5, 复合信度(CR)大于0.7时, 模型有效.土壤基础性质、作物生长数据处理和图表绘制利用Microsoft Excel 2021和Origin 2022软件.
2 结果与分析 2.1 施用生物炭对麦田土壤理化特性的影响施用生物炭显著影响了麦田土壤理化特性(P < 0.05, 表 2).冬小麦扬花期, 施用生物炭显著提高土壤有机碳、全氮和硝态氮含量, 其中B3处理最高, 较B0分别提高了112.08%、17.56%和226.61%.但是施用生物炭显著降低了土壤铵态氮含量, 各处理土壤铵态氮含量表现为：B0>B1>B2>B3, B3较B0降低了63.27%.施用生物炭提高了土壤含水量, 降低了土壤pH, 但是各处理间无显著差异.小麦成熟期, 施用生物炭显著提高了土壤含水量、有机碳、全氮和硝态氮含量, 其中B3处理最高, 较B0分别提高了13.67%、72.50%、26.61%和163.71%.施用生物炭显著降低了土壤铵态氮含量和土壤pH, 其中B3处理降幅最大.
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表 2 施用生物炭对土壤理化性质的影响1) Table 2 Effects of biochar application on soil physicochemical properties |
2.2 施用生物炭对冬小麦生长的影响
施用生物炭显著影响了冬小麦的生长和产量(P < 0.05, 表 3).冬小麦扬花期, 施炭各处理显著提高了氮吸收、氮素吸收效率和生物量, 其中B3处理最高, 较B0分别提高了27.67%、27.27%和16.06%.但B1、B2和B3之间无显著差异.冬小麦成熟期, 施用生物炭同样显著提高了氮吸收、氮素吸收效率和生物量, 其中B3处理最高, 较B0分别提高了17.77%、17.48%和14.40%.此外, 生物炭处理较对照提高了冬小麦产量(5.09%~15.80%), 仅B3处理达到了显著水平(P＜0.05, 表 3).
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表 3 施用生物炭对作物生长和产量的影响1) Table 3 Effects of biochar application on crop growth and yield |
2.3 施用生物炭对土壤微生物群落多样性的影响 2.3.1 施用生物炭对土壤细菌群落组间OTUs的影响
构建Venn图以直观地展现组间OTUs数量组成的相似性、重叠情况以及特异性(图 1).在97%相似度水平上, 冬小麦扬花期4种不同施炭量下[图 1(a)], 共产生了8 120个OTUs, 共同的OTUs有4 114; 各处理拥有OTUs的数量表现为GB0>GB1>GB3>GB2; GB0、GB1、GB2和GB3特有的OTUs分别有606、394、488、441个, 分别占总OTUs数的7.46%、4.85%、6.01%、5.43%.冬小麦成熟期4种不同施炭量下[图 1(b)], 共产生了8 031个OTUs, 共同的OTUs有4 117; 各处理拥有OTUs的数量表现为MB0>MB1>MB3>MB2; MB0、MB1、MB2和MB3特有的OTUs分别有597、466、362和434个, 分别占总OTUs数的7.43%、5.80%、4.51%和5.40%.
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(a)扬花期土壤细菌组间OTUs比较, GB0、GB1、GB2和GB3分别表示扬花期的B0、B1、B2和B3处理; (b)成熟期土壤细菌组间OTUs比较, MB0、MB1、MB2和MB3分别表示成熟期的B0、B1、B2和B3处理, 下同 图 1 土壤细菌组间OTUs比较 Fig. 1 Comparison of OTUs between soil bacterial groups |
施用生物炭显著影响了土壤细菌群落α多样性(P < 0.05, 表 4).每个处理下的Coverage指数均高达96%, 表明测序结果能代表样品中的实际微生物.小麦扬花期, B2处理显著降低了Chao1、Shannon指数和Simpson指数, 较B0分别降低了6.55%、1.13%、0.04%, 说明施用生物炭10 t·hm-2后小麦扬花期土壤细菌菌群多样性降低.冬小麦成熟期, 3个施炭处理的土壤细菌群落α多样性与B0没有显著性差异(P＜0.05), 但B1和B3处理较B2处理显著提高了Shannon指数.
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表 4 施用生物炭对土壤细菌群落α多样性指数的影响1) Table 4 Effect of biochar application on α diversity index of soil bacterial community |
2.3.3 施用生物炭对土壤细菌群落β多样性的影响
基于OTUs丰度的非度量多维度分析如图 2所示.在小麦扬花期, 代表各个处理的点之间离散性略小, 分布于NMDS1轴的左侧.B2和B3处理与B0的空间距离较远, 与B1和B0沿NMDS2轴分离.在小麦成熟期, 代表各个处理的点离散性较大, 分布于NMDS1轴的右侧.同样B2和B3处理组与B0的空间距离较远, B1处理和B2处理距离近, 但4个处理沿NMDS1轴分离.说明高施用量的生物炭对土壤细菌群落结构影响更为明显, 而低施用量的生物炭与对照组细菌群落结构较为相似.
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图 2 基于Bray-Curtis距离的非度量多维度分析 Fig. 2 NMDS plot based on Bray-Curtis distance |
施用生物炭显著影响了土壤细菌群落组成(P < 0.05, 图 3).本试验中选择每个样本中相对丰度＞2%的前8个物种, 剩余的物种被统一分类到另一个类别, 而不能标注到这一水平的标签被归入未分类的类别.从门的分类水平来看, 所有处理的细菌群落组成基本相同, 只是组成比例即物种相对丰度分布存在显著差异(P < 0.05, 图 3), 检测到了变形菌门(Proteobacteria)占总数20.30%~26.41%; 酸杆菌门(Acidobacteria)占总数18.35%~21.38%; 浮霉菌门(Planctomycetes)占总数10.62%~16.84%; 芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)占总数11.34%~13.53%; 放线菌门(Actinobacteria)占总数9.57%~12.36%; 绿弯菌门(Chloroflexi)占总数4.96%~6.03%; 拟杆菌门(Bacteroidetes)占总数4.64%~6.02%和疣微菌门(Verrucomicrobia)占总数3.23%~4.38%, 丰度之和占到总细菌量的93.69%~94.54%.在小麦扬花期, 施加生物炭显著提高变形菌门(Proteobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidetes)的相对丰度, 其中B2处理提高幅度最高, 较B0分别提高了13.55%和15.04%; 且B2处理显著降低了酸杆菌门(Acidobacteria) 的相对丰度, 提高了芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)的相对丰度.在小麦成熟期, 施加生物炭显著提高浮霉菌门(Planctomycetes)的相对丰度(P < 0.05), 且浮霉菌门(Planctomycetes)的相对丰度随着生物炭量的增加呈上升趋势, B3处理较对照增加了45.8%, 但施加生物炭并没有增加变形菌门(Proteobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)的相对丰度, 甚至还有降低的趋势.
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不同小写字母表示同一生育时期的4个处理在5% 水平差异显著 图 3 施用生物炭对土壤细菌群落在门水平上相对丰度的影响 Fig. 3 Effect of biochar application on relative abundance of soil bacterial community at phylum level |
在门水平上, 对样品细菌群落组成与理化因子进行相关分析作出热图(图 4).其中, SWC和pH与拟杆菌门(Bacteroidetes)、变形菌门(Proteobacteria)、纤维杆菌门(Fibrobacteres)丰度呈显著正相关; 但与单糖菌门(Saccharibacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、广古菌门(Euryachaeota)丰度呈显著负相关(P < 0.05); SOC和TN与酸杆菌门(Acidobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)丰度呈显著负相关; 除pH外, 其他环境因子均与Parcubacteria的相对丰度呈显著相关; 硝、铵态氮与衣原体门(Chlamydiae)丰度呈显著相关(P < 0.05).
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NH4+-N: 铵态氮, NO3--N: 硝态氮, SOC: 有机碳, TN: 全氮, SWC: 土壤含水率; pH: 酸碱度; *表示P＜0.05, **表示P < 0.01, ***表示P < 0.001 图 4 土壤细菌群落相对丰度与环境因子相关分析热图 Fig. 4 Spearman correlation heatmap of environmental factors and relative abundance of soil bacterial community |
此外, 使用RDA分析以比较所有土壤样品中的细菌群落结构(门水平), 并确定影响群落结构的主要环境因子(图 5).RDA分析中环境轴共解释54.28%的细菌群落结构变化.与NMDS图相同, 细菌群落分别随生物炭处理和采样日期沿RDA1和RDA2轴分离.在所有的环境因子中, 土壤NO3-(r=0.373 2, P=0.006)和TN(r=0.448 4, P=0.001)相对接近RDA1轴, 表明这两个环境变量在细菌群落随施炭量的变化中发挥关键作用.此外, SWC(r=0.625 3, P=0.001)和SOC(r=0.439 5, P=0.003)相对接近RDA2, 表明这两个变量在细菌群落随生长阶段的变化中起重要作用.
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不同颜色或形状的点表示不同处理的样本组; 红色箭头表示环境因子, 环境因子箭头的长短可以表示环境因子对于物种数据的影响程度(解释量)的大小; 环境因子箭头间的夹角表示正、负相关性(锐角：正相关, 钝角：负相关, 直角：无相关性) 图 5 不同生物炭施用量下细菌群落(门水平)和环境因子关系的RDA排序 Fig. 5 RDA ordination plot based on the relationship between bacterial community (phylum level) and environmental factors under different biochar application rates |
为说明B0、B1、B2和B3处理的土壤细菌群落共现和生态位分配情况, 构建了共现网络(图 6).细菌共现网络的拓扑特征如表 5所示, 其在节点数和连接数、平均度、平均聚类系数和模块化程度上存在差异.虽然不同处理下细菌网络的正相关环节均高于负相关环节, 但B1和B3处理下正相关与负相关的比例有所降低.B2处理的连接数、平均度和平均聚类系数均高于B0处理, 而B1处理则相反.此外, 所有施炭处理模块化程度都高于B0处理.
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4种生物炭处理下土壤细菌群落中OTUs(相对丰度大于0.2%)的关系; 每个点表示一个在97%相似水平聚类的OTU; 连接表示统计上显著性(P＜0.05)与斯皮尔曼相关系数大于0.6; 每个节点的大小与连接数成正比, 每个节点都在门水平上被标记; B0表示未施用生物炭处理, BC表示施用生物炭处理; B1、B2和B3分别表示施用生物炭5、10和20 t·hm-2 图 6 土壤细菌群落共现网络分析 Fig. 6 Soil bacterial community co-occurrence network analysis |
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表 5 生物炭处理下冬小麦土壤共现网络的拓扑性质 Table 5 Topological properties of co-occurrence networks obtained in winter wheat soils under biochar treatments |
2.7 偏最小二乘路径建模
PLS-PM结果如图 7所示, 生物炭处理(B0、B1、B2、B3)、生育时期(扬花期、成熟期)、土壤理化性质(SWC、pH、SOC、TN、NO3--N、NH4+-N)和细菌群落(细菌群落β多样性)对小麦生长(生物量、氮吸收和氮素吸收效率)有直接和间接的影响.不同施炭量处理和采样时期分别解释了冬小麦生长总方差的98.2%, 土壤理化性质(SWC、pH、SOC、TN、NO3--N和NH4+-N)总方差的94.3%和细菌群落β多样性总方差的89.1%(图 7).此外, 生物炭显著影响(P＜0.05)土壤理化性质(通径系数=0.935), 且大于生育时期对土壤理化性质的影响(通径系数=0.262).作物生育时期对细菌群落β多样性(通径系数=-1.090)和作物生长(总生物量、总氮积累、氮素吸收效率; 通径系数=1.074)的影响均大于生物炭处理.细菌群落对作物生长的直接影响(通径系数=0.077)小于土壤理化性质的直接影响(通径系数=-0.090).
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实箭头和虚线箭头分别表示正相关和负相关; 箭头线上数值表示路径系数; 箭头的宽度与路径系数的强度成正比; 方差解释比例用R2表示 图 7 偏最小二乘路径模型 Fig. 7 Partial least squares path modeling |
本试验利用高通量测序技术, 在基因多样性的水平上研究了施用生物炭对土壤细菌群落多样性的影响.结果表明, 施用生物炭减少了小麦扬花期和成熟期土壤细菌OTU数量, 且处理间特有的OTU数量均表现为下降, 说明生物炭可以使土壤细菌群落间的特异性降低, 这可能是因为土壤微生物对土壤pH、有机碳等较为敏感, 土壤微生物为适应土壤环境的改变而调整自身的群落结构, 导致适应性较强或喜好这种环境的微生物得以保留.Chao1指数在处理组与对照组间无显著性差异, 这与乔光等[29]研究的结果相似.本研究发现, 施用生物炭5 t·hm-2和20 t·hm-2提高了Shannon指数和Simpson指数, 说明生物炭的确可以增加土壤微生物多样性及物种丰富度, 这与以往的试验结果一致[9, 30].而施用生物炭10 t·hm-2显著降低了冬小麦扬花期Shannon指数, 可能是由于生物炭在一定程度上改善了土壤微环境, 为某类细菌生长提供有利条件, 引起细菌群落个体大小或数量差异增大, 群落均匀度降低, 进而导致多样性指数减小, 乌英嗄等[31]和Li等[32]研究中也发现类似的结果.α多样性的结果表明施用生物炭可以显著影响微生物的多样性, 但由于土壤微生物间复杂的关系, 比如存在对养分的竞争等, 使得生物炭对样本间的差异影响处于动态变化.
3.2 土壤细菌群落结构对施用生物炭的响应在本研究中发现生育时期对土壤细菌群落的影响强度大于生物炭处理(图 7), 但在同一生育时期中, 仍能发现生物炭对土壤细菌群落的影响, 且冬小麦不同生育时期土壤细菌群落对其具体响应不同(图 2), 这与前人的研究结果一致[33~35].说明细菌的丰度、群落结构等会因环境、季节和温度等因素的变化而表现不同[36, 37].有研究表明, 施加生物炭会改变土壤性质, 这无疑会改变细菌群落结构[38, 39].生物炭具有孔隙率高、比表面积大等物理特性, 可以改善土壤的通气性和保水性能, 从而为土壤细菌提供更好的栖息地, 使其免受捕食者的攻击[37].此外, 生物炭添加后土壤的化学性质也可以解释细菌群落的变化[40].本研究发现施加生物炭提高了土壤水分、有机碳、全氮和硝态氮含量(表 2), 且大多数改变的环境因子与细菌群落显著相关(图 4和图 5).Yao等[22]也报道了类似的结果, 指出生物炭处理的土壤细菌群落与对照不同, 且与pH、全碳、全氮和全磷高度相关.因此, 土壤理化性质的改变可能会导致微生物因资源竞争而发生群落结构变化[22].在本研究中, PLS-PM的结果显示生物炭对于土壤细菌群落的间接影响要大于直接影响.
优势物种在很大程度上决定了土壤微生物群落的生态结构和功能结构, 了解群落在各个水平的物种组成情况能对群落结构的形成、改变以及生态影响等进行有效地解读.本研究发现土壤细菌群落在门水平上组成变化不大, 但结构发生了较显著变化(图 2和图 3), 与Nielsen等[34]和Chen等[41]的研究结果一致, 变形菌门(Proteobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、浮霉菌门(Planctomycetes)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)、放线菌门(Actinobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和疣微菌门(Verrucomicrobia)占优势.以上门通常在土壤中皆可被发现[42], 并被认为是大多数土壤类型的优势菌门.Ren等[43]的研究结果发现在富有机质环境中, 变形菌门(Proteobacteria)对土壤养分的循环至关重要.拟杆菌门(Bacteroidetes)成员表现出共生属性, 在高碳供应的土壤中高度富集[44].施用生物炭显著提高了小麦扬花期的变形菌门和拟杆菌门的相对丰度, 这与前人研究结果一致[11, 22].Chen等[41]在施用玉米秸秆生物炭条件下发现放线菌门、变形菌门和芽单胞菌门均明显富集, 但显著降低了酸杆菌门(Acidobacteria)的相对丰度.酸杆菌门(Acidobacteria)多属于寡营养类群, 施加生物炭后改善了土壤养分状况, 虽然未达到富营养状态, 但是与未添加生物炭处理相比, 土壤环境发生了改变, 养分水平的改善使得其他门类的细菌生长得到促进, 从而导致酸杆菌这类菌的相对丰度占比下降[30].绿弯菌门(Chloroflexi)可以忍受极端的土壤环境, 并可能与其他生物竞争活性碳[45].在本研究中, 生物炭的施用导致冬小麦成熟期绿弯菌门的相对丰度降低, 这可能是由于增加了土壤养分含量和添加生物炭改善了土壤环境[46].浮霉菌门(Planctomycetes)是一类水生细菌, 一般在土壤中占较小的比例, 而在本研究中发现其相对丰度达到10.62%~16.84%, 并且施用生物炭显著提高了小麦成熟期土壤中浮霉菌门(Planctomycetes)的相对丰度.此外, 本研究发现冬小麦成熟期土壤的变形菌门(Proteobacteria)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)和拟杆菌门(Bacteroidetes)相对丰度要低于扬花期, 而土壤中放线菌门(Actinobacteria)的相对丰度随着冬小麦的生长而显著增加(图 3).因此, 门分类水平上相对丰度的时间变化也部分反映了作物的生长特征.综上, 通过施加不同施用量的生物炭处理, 冬小麦不同生育时期的土壤细菌门水平的相对丰度在一定程度上发生改变.由于作物在生长过程中的气候、土壤条件的不同, 总有一部分微生物的生长会受到抑制, 也必然促进一些微生物的生长[36].低施用量的生物炭处理(B1)对门水平的相对丰度影响较小, 中高施用量的生物炭处理(B2和B3)可以显著改变变形菌门、酸杆菌门和拟杆菌门等门的相对丰度.
3.3 施用生物炭改变了土壤细菌间的相互作用本研究使用网络分析来阐明施用生物炭对土壤微生物群落内的相互作用.共发生网络为理解微生物丰度的模式提供了另一条途径, 而不是简单地比较平均丰度的差异.微生物网络拓扑特征的主要变化能够反映微生物群落的变化[41].Herren等[47]的研究认为具有更多边数和节点的网络能显示微生物间更为复杂的关系.在本研究中, B2处理的连接数要多于B0处理, 而B1处理的连接数要少于B0处理.说明施用特定生物炭后, 微生物群落的复杂性增强, 而施用低施用量的生物炭则降低了微生物群落的复杂性.微生物组间负相关越高, 说明微生物间的拮抗作用越强[48].生物炭处理增加了负相关比例, 说明生物炭处理后微生物获取基质的竞争力增强[49].Ratzke等[50]指出微生物往往在低营养浓度的环境中大量共存, 而高营养浓度则导致物种间负相互作用增多.施用生物炭引起的OTU间正相关比例减少可能与土壤养分水平的提高有关.B2和B3处理的平均度高于未施生物炭处理, 而B1处理显示出相反的结果.说明中高施用量生物炭处理下的微生物群落连通性较好.前人研究表明生物炭应用于农田土壤后, 微生物群落的复杂性增加.这反映在生物炭处理的节点数、连接数、平均聚类系数和模块化的增加[51, 52].模块化是微生物网络的固有特征, 它代表了微生物之间的相互作用, 如资源分配、生境异质性、系统发育相关性或生态位重叠, 所以对于微生物群落的稳定性和恢复力至关重要[53].由于模块在土壤中不同物质的循环中发挥着特定的作用, 添加生物炭可以为土壤细菌群落提供更复杂的有机物, 从而使网络变得更加复杂[52, 54].
3.4 施用生物炭对冬小麦生长和产量的影响本研究发现施用生物炭处理较对照显著提高了氮吸收和氮素吸收效率, 且生物炭对冬小麦扬花期生长促进作用要明显高于成熟期.此外, 施用生物炭提高了冬小麦的生物量(2.67%~16.06%)和产量(5.09%~15.80%), 随施用量的增加呈上升趋势.首先, 生物炭的优良特性能够改善土壤结构, 其多孔结构可以增加土壤孔隙度, 改善土壤通气状况, 降低土壤容重和增强保水性[22].其次, 生物炭自身携带大量营养物质并且可以吸附土壤中的营养物质, 减少养分的流失并延缓释放, 提高养分的有效性和利用效率[55].另外, 施入生物炭也可以促进微生物生长繁殖, 提高微生物活性, 进而影响作物的生长[56, 57].在本研究中, PLS-PM的结果显示生物炭通过改变土壤理化性质对作物生长的间接促进作用大于通过改变细菌群落的间接促进作用(图 7).一项Meta分析结果表明[58], 与对照相比, 生物炭施用量在1~10 t·hm-2范围内, 作物产量对生物炭的正效应最大; 而≥ 20 t·hm-2会降低正效应, 可被认为是过量的.过量的生物炭会积累挥发性物质和有毒或有害物质, 导致N固定、微生物活性降低和养分吸收降低, 抑制植物生长[59].此外, Zhang等[55]在进行长达6 a的田间定位试验时发现与＜3 a相比, 施用生物炭＞3 a对作物产量的影响更显著, 这表明生物炭对作物产量的影响随着时间的推移表现出一定的累加效应[60].
4 结论施用生物炭7 a后, 仍可以有效改善土壤理化性质(尤其是SOC和TN), 提高了土壤养分有效性.土壤养分及理化性质的改变, 促进了土壤细菌群落的变化.变形菌门的相对丰度在生物炭施加后显著上升, 而酸杆菌门的丰度显著下降.生物炭作用过程中发现土壤NO3--N和TN是影响细菌群落结构的关键因子.适量施用生物炭(如本研究施用10~20 t·hm-2)可增加土壤细菌群落间的相互作用.此外, 细菌群落对作物生长特性的直接影响小于其他潜在变量.生物炭通过改变土壤理化特性和细菌群落结构促进冬小麦生长和提高氮素吸收效率, 其生物量、氮吸收和产量随着施用量的增加有上升趋势.
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