2023, Vol. 44
2. 南阳师范学院水资源与环境工程学院, 南阳 473061
2. School of Water Resources and Environmental Engineering, Nanyang Normal University, Nanyang 473061, China
伴随着塑料制品在日常生产生活中的大量使用, 微米级甚至纳米级的塑料颗粒随之产生并进入环境中.有学者在20世纪70年代撰写文章指出塑料碎片对生态环境的潜在危害, 目前微塑料污染已经成为全球要面对的一个新的问题和挑战[1].塑料垃圾在物理作用、生物降解和光降解等过程影响下逐渐分解为微小颗粒, 通常将直径小于5 mm的塑料颗粒称为微塑料[2], 种类主要包括聚乙烯(polyethylene, PE)、聚丙烯(polypropylene, PP)、聚苯乙烯(polystyrene, PS)和聚氯乙烯(polyvinyl chloride, PVC)等[3].陆地生态系统中的微塑料主要来源于农用地膜的降解[4], 中国作为世界上地膜覆盖栽培面积最大的国家, 其中聚乙烯地膜被广泛使用, 而土壤中的聚乙烯微塑料残留也显著增加, 带来了诸多污染问题[5].
有研究表明聚乙烯微塑料会干扰水-植物-沉积物系统的养分循环[6], 也会增加海水抗生素抗性基因种类与丰度, 造成污染[7].土壤中的聚乙烯微塑料会对农作物(如小麦等)的幼苗产生毒性, 影响其农艺形状[8], 对土壤理化性质也有显著影响[9], 并能改变土壤微生物群落结构, 导致土壤细菌群落演替差异加剧[3].聚乙烯中含碳量相对较高, 在土壤中残留会导致土壤碳氮比(C/N)增加, 影响微生物的固定, 产生不利影响[10].此外, 聚乙烯具有表面粗糙, 比表面积大和疏水性强等特点, 对疏水性有机污染物具有较强的吸附作用[11].被吸附的有机污染物会随微塑料在环境中迁移进入水体或植物体内[12], 从而造成潜在的环境和健康风险.虽然农田土壤中微塑料的环境生物学效应有诸多报道, 但关于其对作物根际土壤微生物影响的研究相对较少, 并且现有研究关注点在于微生物群落组成与变化趋势, 土壤微生物间相互作用和功能等仍不明确, 而土壤中微生物种类丰富, 功能多样, 与植物生长和抗逆息息相关[13], 研究微塑料对根际土壤微生态的影响是十分必要的.目前, 基于高通量测序技术的网络分析与FAPROTAX功能分析已广泛应用于土壤微生物互作、生态功能预测和关键菌群鉴定等方面[14~17], 可为本研究开展提供技术支撑.
棉花是我国重要的经济作物之一, 棉花质量水平对我国制造业及化工业的影响巨大, 逐渐成为我国国民经济的重要组成部分.地膜覆盖是我国农业应用最为广泛的农艺技术之一, 极大地促进了我国棉花产业的发展, 推动了我国棉花主产区的变化[18].聚乙烯地膜因其具有生产成本低、保持地表温度、保障粮食增产等优点, 被广泛运用[19], 其中高密度聚乙烯(HDPE)是农业地膜中最常使用的塑料.但随之而来的聚乙烯地膜塑料风化分解而成的微塑料污染问题也不容小觑.本研究检测高密度聚乙烯处理条件下对棉花生长和枯萎病发病率的影响, 并利用高通量测序技术与网络分析棉花根际细菌群落结构组成差异和互作关系, 通过FAPROTAX功能分析土壤细菌功能变化, 阐明聚乙烯微塑料改变细菌群落影响棉花生长与枯萎病发生的机制, 以期为评价聚乙烯生态风险以及后续污染土壤修复提供指导.
1 材料与方法 1.1 微塑料与供试土壤高密度聚乙烯(HDPE, 500目)购自东莞鑫淼新材料有限公司, 密度为0.941~0.960 g·cm-3, 结晶度为80%~90%, 软化点为125~135℃.实验土壤采集地点为河南省南阳市卧龙区的棉花种植基地(32°59′N, 112°32′E, 发生过枯萎病, 已1 a未种植棉花), 土壤类型为黄棕壤.所有土壤充分混匀后, 自然风干并过2 mm筛, 待用.理化性质：pH 6.7, ω(有机质)为16.1 g·kg-1, ω(总氮)为0.81 g·kg-1, ω(总磷)为0.47 g·kg-1, ω(总钾)为11.31 g·kg-1.
1.2 棉花种子处理棉花品种为金科棉98, 购自安徽瑞达金农业科技有限公司.将棉花种子置于装有无菌水的无菌培养皿中, 浸泡过夜后, 将种子转移至8%的NaClO中振荡消毒5 min, 随即用无菌水反复清洗5次, 置于湿润的无菌纱布上, 25℃避光萌发2 d.挑选萌发良好的种子接种至霍格兰营养液中, 以28℃、12 h光照, 18℃、12 h黑暗为一周期, 培养5 d待用.
1.3 HDPE对棉花生长和枯萎病发生的影响取过筛后的实验土壤装入盆钵中, 每盆1.0 kg, 土壤容重为1.21 g·cm-3.依据前期实验结果与前人研究[2], 当土壤中HDPE添加比例达到1%以上, 棉花生长受到抑制.因此, 本研究中设置HDPE处理土壤的添加量为1%, 混匀, 编号为PE-1, 另设添加等量无菌水为对照, 编号为CK.此外, 为明确土壤微生物在HDPE影响棉花生长和枯萎病发生过程中的作用, 将供试土壤灭菌处理, 并另行设置添加HDPE(编号为PE-1S)与无菌水处理(编号为CK-S).挑选在霍格兰营养液中培养且长势一致的棉花幼苗种植于上述4种不同处理土壤中, 置于温室中培养, 每天称重补水.
培养50 d后, 将各处理中的幼苗拔出, 测定棉花株高、根长、植株鲜重和植株干重, 并利用抖落法收集根际土, 每组样品设置6个重复.计算枯萎病发病率, 根据病害症状分为5个水平[20]. 0: 无叶片萎蔫; 1:＜25.0%的叶片枯萎; 2: 25.0% ~50.0%的叶片枯萎; 3: 50.0% ~75.0%的叶片枯萎; 4: >75.0%的叶片枯萎, 根据以下公式计算每个处理的发病指数：
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利用土壤DNA提取试剂盒(FastDNA® SPIN Kit for Soil, MP BiomedicalsTM)完成处理PE-1与CK根际土壤总DNA的提取, 提取方法参照说明书稍微改动：加均质化试剂之前, 先加入200 μL含100 mg·mL-1溶菌酶的磷酸缓冲液, 37℃水浴6 h, 再进行后续操作, 土壤DNA于-20℃保存.利用NanoDrop 2000微量紫外分光光度计测定DNA浓度与纯度.DNA样品寄送北京诺禾致源生物科技有限公司, 利用338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)对16S rRNA基因V3-V4区进行PCR扩增.利用AxyPrep DNAGel Extraction Kit(Axygen Biosciences, Union City, CA, USA)进行回收产物纯化, 2%琼脂糖凝胶电泳检测, 并用QuantusTM Fluorometer(Promega, USA)对回收产物进行检测定量.使用NEXTFLEX Rapid DNA-Seq Kit进行建库, 利用Illumina公司的NovaSeqPE250平台进行测序.
1.5 高通量测序数据分析NovaSeq测序得到的原始数据(raw data), 存在一定比例的干扰数据(dirty data), 为了使信息分析的结果更加准确、可靠, 需对原始数据进行拼接、过滤, 得到有效数据(clean data), 再进行嵌合体过滤, 得到可用于后续分析的有效数据(effective tags).为研究各样本的物种组成, 对所有样本的有效数据(effective tags), 以97%的一致性(identity)进行OTUs(operational taxonomic units)聚类, 并对OTUs的序列进行物种注释.根据物种注释结果, 选取不同样本在门(phylum)和属(genus)水平相对丰度较高的物种, 生成物种相对丰度柱形累加图, 以便直观查看各样本在不同分类水平上, 相对丰度较高的物种及其比例.基于OTU进行α多样性分析(Chao1、Shannon、ACE和Simpson指数等), 反映微生物群落的丰富度和多样性. QIIME计算β多样性距离矩阵, 利用R语言(version 3.3.1)通过UPGMA(unweighted pair-group method with arithmetic mean)算法构建树状结构, 并进行PCoA(principal co-ordinates analysis)统计分析, 可视化呈现不同样本群落组成的差异程度.利用T-test检验, 分析属水平下组间的具有显著差异的物种(P＜0.05).土壤细菌功能预测通过FAPROTAX软件完成, 分析不同样品中生物化学循环功能.通过对样本进行相关性指数(斯皮尔曼相关系数, Spearman)计算, 得到物种相关系数矩阵后, 去除相关性系数小于0.6的连接, 过滤掉节点自连接, 去掉节点丰度小于0.005%的连接, 从而得到网络图, 并通过计算网络直径(network diameter)、模块化(modularity)、聚类系数(clustering coefficient)、图形密度(graph density)、平均度数(average degree)和平均路径长度(average path length)等属性, 获得不同样品的网络信息.
2 结果与分析 2.1 HDPE对棉花生长及枯萎病发生的影响将HDPE施加于棉花种植土壤中, 对棉花生长和枯萎病发生的影响如表 1所示(PE-1和CK).供试土壤种植棉花50 d, 添加无菌水处理的枯萎病发病率为25.0%, 而添加HDPE处理的发病率达到33.3%, 发病率提高33.2%.枯萎病的发生也影响棉花的生长, 对比根长和植株鲜重2项生长指标, HDPE处理的棉花均显著弱于无菌水处理, 抑制率分别为47.8%和12.8%, 而株高和植株干重2项指标对比中, 无菌水处理的棉花长势也优于HDPE处理, HDPE的抑制率达到8.5%和23.3%.测定不同处理土壤理化性质, 无菌水处理土壤pH为6.6, ω(有机质)为17.30 g·kg-1, ω(总氮)为0.90 g·kg-1, ω(总磷)为0.44 g·kg-1, ω(总钾)为10.88 g·kg-1.而HDPE处理土壤pH为6.4, ω(有机质)为14.80 g·kg-1, ω(总氮)为0.78 g·kg-1, ω(总磷)为0.43 g·kg-1, ω(总钾)为10.36 g·kg-1, 表明HDPE有使土壤发生酸化的趋势, 降低土壤中有机质含量、氮、磷和钾等营养元素含量, 影响土壤肥力.
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表 1 棉花枯萎病发病率和棉花生长情况(50 d)1) Table 1 Disease incidences and growth of cotton(50 d) |
此外, 将供试土壤灭菌并添加HDPE, 再种植棉花幼苗, 培育50 d, 结果如表 1所示(PE-1S和CK-S).HDPE和无菌水处理无菌土壤, 棉花枯萎病发病率均为16.7%, HDPE处理的棉花各项生长指标和无菌水处理不存在显著差异, 表明HDPE可通过改变土壤微生物群落结构, 影响棉花生长和枯萎病发生.后续则针对PE-1和CK条件下细菌群落结构的变化进行分析.
2.2 土壤细菌群落α、β多样性与ANOSIM/Adonis分析群落组成差异土壤细菌群落α多样性指数分析结果如表 2所示, HDPE处理土壤的细菌群落结构丰富度指数(ACE、Chao1)和多样性指数(Shannon)均低于添加无菌水处理的土壤, 其中ACE指数和Chao1指数的差异达到显著水平(P＜0.05), 表明HDPE的添加降低了棉花根际土壤细菌丰富度和多样性.
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表 2 不同土壤样品细菌群落α多样性指数分析1) Table 2 The α diversity analysis of bacterial community in different soil samples |
HDPE处理的棉花根际细菌群落由54个门, 472个属组成, 无菌水处理土壤样品中细菌由55个门, 492个属组成, HDPE处理土壤细菌门和属组成数量均少于无菌水处理土壤, 其主要组成如图 1和图 2所示.门水平上(>1%)主要由: 放线菌门(Actinobacteriota, PE-1：38.7%, CK：41.3%)、变形菌门(Proteobacteria, PE-1：35.1%, CK：33.0%)、厚壁菌门(Firmicutes, PE-1：6.6%, CK：8.1%)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes, PE-1：3.1%, CK：2.6%)、绿弯菌门(Chloroflexi, PE-1：1.7%, CK：1.8%)、拟杆菌门(Bacteroidota, PE-1：1.5%, CK：1.8%)、酸杆菌门(Acidobacteriota, PE-1：1.4%, CK：1.7%) 和蓝藻门(Cyanobacteria, PE-1：1.2%, CK：0.8%)组成.HDPE的添加降低了放线菌门、厚壁菌门、绿弯菌门、拟杆菌门和酸杆菌门的相对丰度, 但变形菌门和蓝藻门的相对丰度有所提高.属水平上, 共有27个属相对丰度超过0.5%, 包括: 鞘脂单胞菌属(Sphingomonas, PE-1：12.9%, CK：12.0%)、类诺卡氏菌属(Nocardioides, PE-1：12.6%, CK：12.3%)、大理石雕菌属(Marmoricola, PE-1：2.9%, CK：2.8%)、诺尔氏菌属(Knoellia, PE-1：2.6%, CK：3.0%)、芽单胞菌属(Gemmatimonas, PE-1：2.5%, CK：2.0%)、马赛菌属(Massilia, PE-1：1.6%, CK：2.8%)和嗜甲基菌属(Methylophilus, PE-1：1.4%, CK：0.9%)等.结果表明HDPE对棉花根际土壤细菌组成中主要属的相对丰度均有影响, 降低诺尔氏菌属和马赛菌属等的相对丰度, 但提高了其他主要属的相对丰度, 如鞘脂单胞菌属、类诺卡氏菌属和芽单胞菌属等.
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图 1 不同土壤细菌属水平的相对丰度 Fig. 1 Relative abundance of bacterial community at genus level in soil with different treatments |
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图 2 不同土壤细菌门水平的相对丰度 Fig. 2 Relative abundance of bacterial community at phylum level in soil with different treatments |
利用UPGMA、PCoA和ANOSIM/Adonis分析分组差异情况, 结果如图 3所示.PCoA结果表明PE-1和CK样品分布在两个不交叉的区域内, 并且类似结果同样出现在UPGMA分析中, PE-1和CK样品分布在不同的两支上, 表明两者细菌群落存在差异.根据ANOSIM/Adonis分析结果, 可知HDPE处理对细菌群落结构的改变达到显著水平(P＜0.05).
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图 3 不同土壤样品UPGMA和PCoA分析 Fig. 3 UPGMA and PCoA analysis in soil with different treatments |
FAPROTAX功能预测HDPE处理土壤共得到70种功能, 少于无菌水处理的土壤功能数量(74种).以相对丰度前20的功能种类作图并比较相对丰度, 结果如图 4所示, 主要功能包括化学异养(chemoheterotrophy, PE-1：26.8%, CK：25.6%)、需氧化学异养(aerobicchemoheterotrophy, PE-1：20.5%, CK：21.0%)、芳香族化合物降解(aromatic compound degradation, PE-1：6.9%, CK：6.9%)、发酵(fermentation, PE-1：2.7%, CK：3.4%)、硝酸盐还原(nitrate_reduction, PE-1：1.8%, CK：2.3%)、尿素分解(ureolysis, PE-1：1.8%, CK：2.1%)、甲基营养(methylotrophy, PE-1：3.1%, CK：1.2%)、甲醇氧化(methanol oxidation, PE-1：3.1%, CK：1.2%)、光营养(phototrophy, PE-1：0.7%, CK：0.4%)、光自养(photoautotrophy, PE-1：0.7%, CK：0.4%)、有氧光合自养(oxygenicphotoautotrophy, PE-1：0.7%, CK：0.4%)、几丁质分解(chitinolysis, PE-1：0.3%, CK：0.4%)、氮呼吸(nitrogenrespiration, PE-1：0.1%, CK：0.2%)、硝酸盐呼吸(nitraterespiration, PE-1：0.1%, CK：0.2%)和木聚糖分解(xylanolysis, PE-1：0.1%, CK：0.2%)等, 其中HDPE处理后化学异养、甲基营养和甲醇氧化等功能的相对丰度高于无菌水处理, 而好氧化学异养、发酵、硝酸盐还原和尿素分解等功能的相对丰度低于无菌水处理.
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*表示HDPE处理土壤中相对丰度小于无菌水处理的功能种类 图 4 不同土壤样品细菌功能预测 Fig. 4 Prediction of bacterial function in different soil samples |
通过R软件对两种处理土壤进行T-test物种差异分析, 结果如图 5所示.两种土壤中共有12个属存在显著差异(P＜0.05), 其中HDPE处理土壤中有5个属, 无菌水处理土壤中有7个属.HDPE处理土壤中存在显著差异的物种有甲基杆菌属(Methylobacillus)、鞘氨醇杆菌属(Sphingosinicella)、Methylotenera、MM2和TM7a, 主要分布在变形菌门.无菌水土壤中存在显著差异的物种有马赛菌属(Massilia)、拉姆利氏杆菌属(Ramlibacter)、Ellin6067、芽生球菌属(Blastococcus)、Haliangium、克里布所菌属(Kribbella)和Subgroup_10, 主要分布在变形菌门、粘菌门、放线菌门和酸杆菌门.
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图 5 T-test分析不同土壤中的差异菌属 Fig. 5 The T-test analysis of differential bacteria in soils |
以Spearman为相关性指标类型, 设置显著性阈值0.05, 相关性阈值0.6, 最大物种数目100构建网络, 结果如图 6所示.无菌水处理(CK)的土壤细菌网络图中显著相关的总连接数(total links)为621个, 正相关(positive links)412个, 负相关(negative links)209个, HDPE处理(PE-1)总连接数625个, 其中正相关399个, 负相关226个.CK网络的图形密度(graph density, 0.052)和平均度(average degree, 10.5)与HDPE网络一致, 而网络直径(diameter, PE-1：12, CK：20)、模块化(modularity, PE-1：0.402, CK：0.458)和平均路径长度(average path length, PE-1：4.057, CK：5.127)大于HDPE网络, 聚类系数(clustering coefficient, PE-1：0.578, CK：0.560)则小于HDPE网络.
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红色连线表示正相关, 蓝色连线表示负相关 图 6 不同土壤中的细菌网络分析 Fig. 6 Network analysis of bacteria in soil with different treatments |
通过计算物种的总连接数, 推断不同处理条件下细菌网络中的关键菌群.无菌水处理的土壤中, 连接数最高的有: 空洞菌属(Cavicella, 总连接数：26, 正相关：19, 负相关：7), 毛梭菌属(Lachnoclostridium, 总连接数：26, 正相关：19, 负相关：7), 原囊粘菌属(Archangium, 总连接数：26, 正相关：5, 负相关：21), 链霉菌属(Streptomyces, 总连接数：24, 正相关：6, 负相关：18), 拟普雷沃氏菌属(Alloprevotella, 总连接数：23, 正相关：15, 负相关：8), 芽生球菌属(Blastococcus, 总连接数：23, 正相关：8, 负相关：15), 无杆菌属(Agathobacter, 总连接数：21, 正相关：14, 负相关：7), 另枝杆菌(Alistipes, 总连接数：21, 正相关：14, 负相关：7), 副杆菌属(Parabacteroides, 总连接数：21, 正相关：14, 负相关：7), 普雷沃菌属(Prevotella, 总连接数：21, 正相关：14, 负相关：7)等, 主要分布在变形菌门、厚壁菌门、黏菌门、放线菌门和拟杆菌门.而HDPE处理土壤细菌网络中连接数最高的有: Caenimonas(总连接数：27, 正相关：19, 负相关：8), 拉姆利氏杆菌属(Ramlibacter, 总连接数：27, 正相关：19, 负相关：8), 假诺卡氏菌属(Pseudonocardia, 总连接数：25, 正相关：17, 负相关：8), Qipengyuania(总连接数：25, 正相关：17, 负相关：8), 水杆菌属(Aquabacterium, 总连接数：24, 正相关：17, 负相关：7), Bryobacter(总连接数：24, 正相关：17, 负相关：7), 空洞菌属(Cavicella, 总连接数：24, 正相关：17, 负相关：7), 副杆菌属(Parasegetibacter, 总连接数：24, 正相关：17, 负相关：7), 红球菌属(Rhodococcus, 总连接数：24, 正相关：16, 负相关：8), 嗜甲基菌属(Methylophilus, 总连接数：24, 正相关：15, 负相关：9)等, 主要分布在变形菌门、酸杆菌门、拟杆菌门和放线菌门.结合网络参数, HDPE处理减弱了棉花根际细菌间的相互作用, 减少正相关连接数, 增加负相关连接数, 网络结构更为简单, 并造成网络关键菌群发生显著变化.
3 讨论 3.1 HDPE胁迫下棉花根际土壤细菌群落组成差异根际微生物组被认为是植物的“第二大基因组”, 在污染物毒理和修复过程中起着至关重要的指示作用.聚乙烯微塑料对植物生长、土壤理化性质和微生物群落结构的影响已有报道, 但聚乙烯微塑料尤其是HDPE对植物根际土壤微生物组(如细菌群落)的影响却鲜有报道.有研究表明土壤细菌群落与植物土传病害和生长之间有着重要的关联[3].本研究中高通量测序结果表明HDPE处理土壤样品细菌由54个门, 472个属组成, 门和属组成数量均少于无菌水处理土壤, 并且丰富度的指数(ACE、Chao1)和多样性的指数(Shannon)均低于无菌水处理土壤.正常情况下, 微生物群落多样性和丰富度指数越高, 群落结构越复杂, 稳定性越好[21], HDPE则会影响细菌群落的组成和结构, 这与Shi等的研究一致[22].HDPE处理也导致根际土壤中12个属存在显著差异, HDPE处理显著降低了马赛菌属(Massilia)、拉姆利氏杆菌属(Ramlibacter)、芽生球菌属(Blastococcus)、Haliangium和克里布所菌属(Kribbella)等的相对丰度, 推测原因是聚乙烯中所含的增塑剂、稳定剂等有害物质释放到土壤中, 使细菌生长活动受抑[23].而HDPE可显著提高土壤中甲基杆菌属(Methylobacillus)、鞘氨醇杆菌属(Sphingosinicella)和Methylotenera等的相对丰度.土壤中高分子量聚乙烯微塑料由于分子链较大不能直接穿过细胞膜进入微生物体内, 经过一系列的非生物因素如光、温度以及生物因素等的作用下, 逐步转化成小分子, 经过降解的小分子或者乙烯单体被细菌菌体细胞吸收降解, 促进其生长[24].对棉花根际土壤中相对丰度前30的细菌进行潜在功能分析, 发现菌群分布在不同门水平下, 并且功能多样化.类诺卡氏菌属(Nocardioides)具有生物防治特性[25], 鞘脂单胞菌属(Sphingomonas)具有植物促生特性[26], 马赛菌属(Massilia)具有降解污染物特性[27], 拉姆利氏杆菌属(Ramlibacter)可用于生产具有特定功能的酶[28]等, 表明棉花根际土壤也是分离功能菌株的良好资源.此外, 甲基杆菌属、鞘氨醇杆菌属和Methylotenera属菌株已被证实具有污染物降解功能[29~32], HDPE对该菌群有明显的富集作用, 可为聚乙烯塑料降解菌群的分离提供指导.
3.2 HDPE胁迫影响棉花根际土壤细菌网络与功能土壤细菌群落的变化必然导致土壤菌群功能的改变, 了解土壤菌群功能有助于土壤改良与修复.基于FAPROTAX预测细菌群落功能已有相关报道[33].本研究HDPE处理土壤中, 相对比例前20的细菌功能中, 有12种功能相对比例低于无菌水处理, 如硝酸盐还原和尿素分解功能.硝酸盐还原功能可将土壤中硝酸盐还原为铵态氮, 减少土壤氮的流失, 尿素分解则是通过细菌作用将尿素分解成氨之后才可被植物吸收利用, HDPE破坏土壤相关细菌功能, 间接导致棉花生长受阻.在复杂的土壤环境中, 细菌往往不是单一存在或独立作用, 而是菌群间的复合作用[34].Network网络分析可以获得物种在环境样本中的共存在关系, 得到物种在同一环境下的相互作用的情况, 进一步解释样本间表型差异的形成机制[35].网络中正相关可表示细菌间的共生关系, 负相关表示细菌间存在竞争或者捕食关系[17].本研究中的网络分析可知, HDPE处理土壤改变了棉花根际土壤细菌网络结构, 减少正相关连接数, 增加负相关连接数, 网络结构更为简单, 因此在HDPE胁迫下, 土壤中关键细菌菌群发生变化.无菌水处理土壤中的关键菌群如原囊粘菌属(Archangium)、链霉菌属(Streptomyces)和芽生球菌属(Blastococcus)具有潜在生物防治或者促生功能[36~39], 而HDPE处理土壤中关键菌群转变为具有潜在污染物降解功能的菌群, 如假诺卡氏菌属(Pseudonocardia)、水杆菌属(Aquabacterium)、红球菌属(Rhodococcus)和嗜甲基菌属(Methylophilus)等[40~44], 这些菌群在维持生态系统稳定, 棉花根际土壤功能发挥中起着至关重要的作用.此外, 可将细菌网络与物种差异分析相结合, 有针对性地分离HDPE降解菌, 例如嗜甲基菌属(Methylophilus)在HDPE处理土壤中相对丰度(1.42%)高于无菌水处理(0.80%), 其在HDPE处理土壤细菌网络中占据重要地位, 为潜在的HDPE降解菌株, 并且原位土壤分离的菌群与土著微生物之间形成稳定的互作关系, 更有利于降解菌群的存活.该功能菌群分离思路已在相关研究中有所报道[45], 也可为本研究后续功能菌株分离提供保障.
4 结论(1) NovaSeq测序结果显示HDPE处理降低棉花根际土壤细菌在门和属水平上的组成数量, 主要由放线菌门、变形菌门、厚壁菌门等54个门, 鞘脂单胞菌属、类诺卡氏菌属和大理石雕菌属等472个属组成.
(2) 结合α多样性指数、UPGMA与PCoA分析可知, HDPE处理降低根际细菌群落的丰富度与多样性, 并显著改变细菌群落结构.T-test物种差异分析显示HDPE处理显著提高根际土壤中甲基杆菌属、鞘氨醇杆菌属等5个属的相对丰度, 其可能与HDPE降解有关.
(3) FAPROTAX功能预测显示HDPE胁迫减少土壤细菌功能种类.Network网络分析表明HDPE处理减弱了棉花根际土壤细菌间的相互作用, 减少正相关连接数, 增加负相关连接数, 简化网络结构, 改变关键菌.
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