2023, Vol. 44
2. 海南省环境科学研究院, 海口 571126
2. Hainan Provincial Academy of Environmental Sciences, Haikou 571126, China
微塑料是直径小于5 mm的塑料碎片[1], 通过陆地输入、大气沉降和海上活动(航运、旅游、海水养殖、渔业活动)等方式进入海洋环境[2~4], 是全球海洋生态系统中广泛存在的新兴污染物.受环境因素和当地污染事件的影响, 海水中微塑料的浓度变化很大[5], 在污染严重的沿海地区, 浓度可达150 n ·L-1[6].海洋中常见的微塑料类型主要为聚氯乙烯(polyvinyl chloride, PVC)、聚乙烯(polyethylene terephthalate, PE)和聚酰胺(polyamide, PA)等[7~9].微塑料可被浮游动物、双壳类、甲壳类和鱼类等海洋生物摄入[10, 11], 从而进入海洋食物链[12~15], 并在食物链中进行生物积累[16, 17].由于微塑料化学成分稳定, 被海洋生物摄取后难以消化[18], 造成一系列负面影响, 如胃肠道阻塞、炎症、组织损伤和生长受限等[13, 19].此外, 微塑料还可以作为其他污染物(如重金属、抗生素和持久性有机污染物)的载体[20~23], 还可能积聚病原细菌[24].由此可见, 微塑料作为新兴污染物会对海洋生物的生长和健康带来巨大的威胁和危害.
目前, 在世界范围内的一些珊瑚礁生态系统中已检测到微塑料, 如拉姆斯瓦拉姆珊瑚岛(Rameswaram Coral Island)[25]、大堡礁[26]、马尔代夫[27, 28]和南海[23, 29, 30], 因此, 微塑料会给珊瑚带来怎样的影响引起密切关注.相关研究表明珊瑚可摄食微塑料并包裹在珊瑚肠腔膜组织中[31], 微塑料颗粒可长时间滞留在珊瑚组织中, 对珊瑚的免疫系统和生长发育产生影响[32, 33].微塑料附着在触手或肠系膜丝上, 导致珊瑚白化和组织坏死[34], 显著增加珊瑚患病概率[35].微塑料还会降低珊瑚骨骼的生长速度, 影响珊瑚钙化[36].由此可见, 微塑料会对珊瑚的健康产生负面影响.然而, 目前有关微塑料对珊瑚影响的研究非常有限, 其造成影响的具体机制还不清楚.
众所周知, 在珊瑚共生体的表面黏液层、组织和骨架内都生活着大量的细菌和古菌[37, 38], 这些微生物对珊瑚的生长和健康起着重要作用[39].微生物是对环境变化做出响应的先行者, 在珊瑚礁生态系统中, 微塑料作为新的环境压力, 珊瑚共附生微生物是如何响应, 进而影响珊瑚本身的健康状态的, 这些仍是未知.因此, 本研究选用海洋环境中常见的微塑料PA, 利用高通量测序技术对微塑料暴露对小棒短指软珊瑚(Sinularia microclavata)共附生细菌多样性及其群落结构的影响进行分析, 对于弄清微塑料对珊瑚的影响机制至关重要, 以期为微塑料生态毒理学提供基础数据, 也为阐明珊瑚白化病害机制及珊瑚的保护提供新的视角.
1 材料与方法 1.1 样本采集珊瑚样本采自海南省三亚市西岛(18°15′N, 109°22′E)珊瑚礁区, 2 h内运回实验室并暂养在流通式水族箱内.暂养条件参考Liao等[8]和晁华等[40]的方法[水温(26.0±1.0)℃, 盐度(35.0±0.3)‰, 光暗比12 h ∶12 h, 水流循环2 000 L ·h-1], 暂养两周后, 待珊瑚状态恢复和适应环境后, 整个珊瑚被分成30个大小相等(2 cm2)的个体, 继续暂养4周, 待珊瑚状态恢复正常后开展后续实验.
1.2 微塑料暴露本研究选取海洋环境中常见的微塑料类型之一PA, 购于银能电镀材料有限公司(东莞, 中国).根据Liao等[8]的方法在实验组中添加PA, 微塑料浓度为300 mg ·L-1.为了使微塑料能悬浮于海水中, 实验周期内进行少量曝气.将30个珊瑚个体分别放置于对照组(未添加PA, 样品命名为DZ)和实验组(命名为PA)水族箱中, 且条件和暂养条件一致, 分别在第0、2、3和7 d从两个水族箱中随机挑选3个珊瑚个体(对照组命名为DZ0、DZ2、DZ3和DZ7, 实验组命名为PA2、PA3和PA7), 置于液氮中保存备用.
1.3 珊瑚共附生细菌高通量测序选用FastDNAⓇ Spin Kit for Soil(MP Biomedicals, 美国)试剂盒提取珊瑚样品DNA.采用通用引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)对16S rRNA基因V3~V4可变区进行PCR扩增.利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit(Axygen Biosciences, 美国)试剂盒对产物进行纯化, 用QuantusTM Fluorometer(Promega, 美国)检测试剂盒进行定量.利用MiSeq PE300平台(Illumina)进行高通量测序(上海美吉生物医药科技有限公司).
1.4 数据处理与分析生物信息在美吉实时交互平台(http://www.majorbio.com/)进行分析.利用Uparse[41]软件(http://drive5.com/uparse/, version 7.1)对序列进行聚类, 以97%的一致性将序列聚类成为操作分类单位(operational taxonomic unit, OTU).随后进行OTU分析、α-多样性分析、β-多样性分析、物种组成分析(在门水平上的群落组成分析和在属水平上的Circos样本与物种关系分析)、组间群落差异分析[线性判别分析(linear discriminant analysis, LDA)]和功能分析.利用R语言(version 3.3.1)进行主坐标分析(principal co-ordinates analysis, PCoA)和绘图; 对于Bray-Curtis距离的不相似性检验, 利用R语言vegan包进行ANOSIM分析和PERMANOVA分析, 利用RStudio进行MRPP分析.根据OTU的物种注释和丰度信息, 使用PICRUSt2软件(https://github.com/picrust/picrust2/)、微生物组分析工具BugBase(https://bugbase.cs.umn.edu/index.html)和FAPROTAX数据库(http://www.loucalab.com/archive/FAPROTAX)来进行相关功能预测.
2 结果与分析 2.1 α-多样性和β-多样性分析微塑料暴露后, 小棒短指软珊瑚个体未出现死亡现象, 在外观上和对照组没有明显差别.高通量测序结果分析表明, 去除嵌合体后, 测序共获得优化序列994 977条, 平均序列长度423 bp.Sobs指数稀释曲线趋向平坦, 表明测序数据量合理, 检测到大多数细菌种类, 可以反映细菌多样性.
通过α-多样性分析可反映微生物群落的多样性(Shannon指数)、丰富度(Ace指数和Chao1指数)和覆盖度(Coverage指数).所有样本的Coverage指数均>0.99, 说明有效数据量充足, 测序结果能反映样本的真实性.微塑料暴露后, 实验组的Shannon指数和对照组相比, 除暴露第2 d的PA2组低于DZ2组外, 其余实验组均高于对照组; 实验组Ace指数和Chao1指数与对照组相比, 除微塑料暴露第2 d(PA2组和DZ2组相似)外, 其余实验组均高于对照组; 但各组间α-多样性无显著性差异(表 1).以上结果表明, 微塑料暴露对珊瑚共附生细菌群落α-多样性产生影响.从时间水平上来看, 微塑料暴露后第3 d和第7 d的珊瑚共附生细菌Shannon、Ace和Chao1指数均高于第2 d, 说明微塑料暴露后珊瑚共附生细菌α-多样性先降低, 后有上升趋势.
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表 1 微塑料暴露前后珊瑚共附生细菌群落α-多样性1) Table 1 The α-diversity of symbiotic bacterial community of coral before and after microplastic exposure |
通过β-多样性分析可反映样本间的细菌群落差异(图 1).由PCoA结果可知, 第一轴和第二轴累计解释59.62%的样本间群落组成差异, 其中PC1和PC2分别能解释40.81%和18.81%的细菌群落组成差异.组内3个平行样基本聚在一起, 重复性较高, 组间差异明显大于组内差异.对于实验组样本来说, 大部分聚集在右上和右下象限, 但在PC1维度上, PA2组的样品和其他样品不同, 说明微塑料暴露第2 d和其他暴露时间的细菌群落组成有差异.基于以上结果可知, 微塑料暴露前后珊瑚共附生细菌群落有差异, 且不同暴露时间的珊瑚共附生细菌群落也不同.
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图 1 微塑料暴露不同时间珊瑚共附生细菌群落PCoA分析 Fig. 1 PCoA analysis of symbiotic bacterial communities of coral at different microplastic exposure times |
对微塑料暴露不同时间后珊瑚共附生细菌群落间进行不相似性检验(表 2), 以便进一步验证珊瑚共附生细菌群落之间的差异是否显著.结果表明, 各处理组与对照组间的差异均不显著.
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表 2 珊瑚共附生细菌群落Bray-Curtis距离的不相似性检验 Table 2 Dissimilarity test of symbiotic bacterial community of coral based on Bray-Curtis distance |
2.2 珊瑚共附生细菌群落结构分析
微塑料暴露后珊瑚共附生细菌群落组成分析结果显示, 在所有样品中共检测到49个门、152个纲、363个目、634个科和1 390个属.不同样品在门水平上的细菌群落组成如图 2所示, 相对丰度>1%的细菌门有8个, 分别为：Proteobacteria(53.11% ~93.14%)、Firmicutes(1.32% ~19.91%)、Actinobacteriota(2.20% ~10.74%)、Bacteroidota(0.75% ~10.79%)、Chloroflexi(0.56% ~2.40%)、Cyanobacteria(0.26% ~2.33%)、Acidobacteriota(0.49% ~1.55%)和Deferribacterota(0.32% ~1.13%); 相对丰度 < 1%的细菌门有41个, 归为其他分类(others).由图 2可知, 微塑料暴露不同时间后, Proteobacteria在各组样本中都是优势类群, 但在各组内的相对丰度不同.微塑料暴露第2 d, 实验组中Proteobacteria相对丰度增加, 而Actinobacteriota、Bacteroidota、Chloroflexi和Acidobacteriota相对丰度降低.微塑料暴露第3 d, 和对照组相比, Chloroflexi在实验组中的相对丰度增加, Deferribacterota在实验组中的相对丰度降低.微塑料暴露第7 d, 实验组中Firmicutes、Actinobacteriota、Bacteroidota、Chloroflexi和Acidobacteriota的相对丰度较对照组显著增加, 但Cyanobacteria相对丰度降低.以上结果表明, 和对照组相比, 微塑料暴露导致珊瑚共附生细菌群落发生改变, 并且随着微塑料暴露时间的变化, 珊瑚共附生细菌群落也随之变化.
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图 2 微塑料暴露不同时间珊瑚共附生细菌群落组成(在门水平) Fig. 2 Symbiotic bacterial community composition (at the phylum level) of coral at different microplastic exposure times |
通过Circos样本与物种关系图可以反映微塑料暴露不同时间后珊瑚共附生细菌群落在属水平上的分布和各属在不同样本中的分布.微塑料暴露不同时间珊瑚共附生细菌群落在属水平上的分布如图 3所示, 相对丰度>1%的属共30个, 主要包括Ralstonia、Acinetobacter、Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia、Delftia、Pseudomonas、Bacteroides、Endozoicomonas、Lachnospiraceae_ NK4A136 _group、Paracoccus、Brevundimonas、Citrobacter、Reyranella、Trichococcus、Methyloceanibacter、Pelomonas、Blautia、Klebsiella、Comomamonas、Megamonas、Sphingomonas、Dyella、Corynebacterium、Candidatus_Competibacter、Geobacillus、Enterococcus、Mucispirillum和Ruegeria等; 相对丰度 < 1% 的属归为其他分类(others). 微塑料暴露第2 d, 对照组的珊瑚共附生细菌群落主要包括Ralstonia (59.45%)和Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia (5.57%), 实验组主要包括Ralstonia(76.98%)和Lachnospiraceae_ NK4A136 _group(5.00%), 且实验组Ralstonia的相对丰度高于对照组.微塑料暴露第3 d, 对照组的珊瑚共附生细菌群落主要包括Ralstonia(28.73%)、Acinetobacter(11.99%)和Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia(5.30%), 实验组的主要包括Acinetobacter(16.60%)和Delftia(10.57%).微塑料暴露第7 d, 对照组的珊瑚共附生细菌群落的主要类群同第3 d对照组类似, 也是包括Ralstonia(27.05%)、Acinetobacter(19.15%)和Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia(13.55%), 实验组的主要包括Ralstonia(16.51%)和Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia(5.03%). 由此可见, 微塑料暴露导致珊瑚共附生细菌在属水平上的群落组成也发生显著变化.从时间角度来看, 微塑料暴露后第2~7 d, 珊瑚共附生细菌随着暴露时间的加长, 群落组成发生变化.
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1. Ralstonia; 2. Acinetobacter; 3. Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia; 4. Delftia; 5. Pseudomonas; 6. Bacteroides; 7. Endozoicomonas; 8. Lachnospiraceae_ NK4A136 _group; 9. Paracoccus; 10. Brevundimonas; 11. Citrobacter; 12. Reyranella; 13. norank_f__Muribaculaceae; 14. Trichococcus; 15. norank_f__norank_o__Chloroplast; 16. Methyloceanibacter; 17. Allorhizobium-Neorhizobium-Pararhizobium-Rhizobium; 18. Pelomonas; 19. Blautia; 20. Klebsiella; 21. Comomamonas; 22. Megamonas; 23. Sphingomonas; 24. Dyella; 25. Corynebacterium; 26. Candidatus_Competibacter; 27. Geobacillus; 28. Enterococcus; 29. Mucispirillum; 30. Ruegeria 图 3 微塑料暴露不同时间珊瑚共附生细菌群落在属水平上的分布 Fig. 3 Distribution of symbiotic bacterial community composition (at the genus level) of coral at different microplastic exposure times |
通过线性判别分析(LDA)可比较微塑料暴露后对照组和实验组珊瑚共附生细菌的差异类群(图 4~6).由图 4可知, 微塑料暴露第2 d, 对照组和实验组之间珊瑚共附生细菌的差异类群共有4个细菌类群, 分别为2个纲、1个目和1个属; 对照组与实验组相比：α-Proteobacteria纲及其Rhizobiales目, Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia属在对照组中富集; 在实验组中观察到的差异类群为γ-Proteobacteria纲.微塑料暴露第3 d, 对照组和实验组珊瑚共附生细菌在目、科和属这3个分类水平上都存在着显著优势物种; 和实验组相比, 对照组中Burkholderiaceae科及其Ralstonia属、Burkholderiales目的相对丰度明显较高; 而Comamonadaceae科及其Delftia属, Pseudomonadales目及其Pseudomonadaceae科和Pseudomonas属, Enterobacterales目及其Enterobacteriaceae科在实验组中富集(图 5).微塑料暴露第7 d, 对照组和实验组之间珊瑚共附生细菌的差异类群共有8个细菌类群, 分别为3个门、3个纲和2个目; 对照组和实验组相比, Proteobacteria门及其γ-Proteobacteria纲在对照组中富集; 在实验组中观察到差异类群包括Firmicutes门, Bacteroidota门及其Bacteroidia纲、Bacteroidales目、Rhizobiales目和Thermoleophilia科(图 6).以上结果表明, 微塑料暴露导致珊瑚共附生细菌群落发生显著差异, 并且不同微塑料暴露时间下的差异细菌类群也不同.
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图 4 微塑料暴露第2 d对照组和实验组的珊瑚共附生细菌差异类群的LDA分析 Fig. 4 Comparison on different symbiotic bacterial populations of coral on 2nd day of microplastic exposure by linear discriminant analysis (LDA) |
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图 5 微塑料暴露第3 d对照组和实验组的珊瑚共附生细菌差异类群的LDA分析 Fig. 5 Comparison on different symbiotic bacterial populations of coral on 3rd day of microplastic exposure by Linear discriminant analysis (LDA) |
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图 6 微塑料暴露第7 d对照组和实验组的珊瑚共附生细菌差异类群的LDA分析 Fig. 6 Comparison on different symbiotic bacterial populations of coral on 7th day of microplastic exposure by linear discriminant analysis (LDA) |
通过PICRUSt功能预测分析, 获得六类一级功能层生物代谢通路, 分别为：代谢、环境信息处理、遗传信息处理、细胞过程、人类疾病和有机系统.KEGG二级通路显示, 共检测到46个二级功能基因, 和代谢相关的功能基因占比最大, 例如全局及概要图(37.92% ~39.44%)、碳水化合物代谢(7.87% ~8.99%)、氨基酸代谢(7.73% ~7.97%)、能量代谢(4.27% ~4.40%)、辅助因子和维生素代谢(3.95% ~4.12%)等, 但微塑料暴露后它们的相对丰度变化不大(图 7).在信号转导、细胞群落-原核生物、外源物质生物降解及代谢和细胞运动功能方面, 实验组中这些功能的相对丰度在微塑料暴露后第2 d高于对照组; 在暴露后第3 d和第7 d, 实验组中这些功能的相对丰度均低于对照组.由此可见, 微塑料暴露, 导致珊瑚共附生细菌群落部分潜在功能发生改变.
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图 7 微塑料暴露不同时间珊瑚共附生细菌PICRUSt功能预测(二级功能层) Fig. 7 PICRUSt function prediction of symbiotic bacterial community of coral at different microplastic exposure times (secondary functional layer) |
BugBase分析可以预测环境样本中原核微生物的表型, 其中表型类型包括革兰氏阳性、革兰氏阴性、生物膜形成、致病性、移动元件含量、氧需求(包括好氧、厌氧、兼性厌氧)和氧化胁迫耐受七大类.微塑料暴露前后不同珊瑚样本的微生物表型分布如图 8所示, 所有珊瑚样本的共附生细菌表型主要是生物膜形成和革兰氏阴性表型.从整体来看, 珊瑚共附生微生物的革兰氏阴性表型的相对丰度高于革兰氏阳性; 微塑料暴露后, 对照组和实验组革兰氏阴性表型的相对丰度变化不大, 但是革兰氏阳性表型的相对丰度变化在暴露后第3 d和第7 d变化较大.对生物膜形成表型来说, 微塑料暴露前后的相对丰度变化不大.在致病性表型方面, 微塑料暴露后第2 d和3 d, 在实验组中的相对丰度均高于对照组, 但暴露第7 d其相对丰度降低.在氧需求表型方面, 所有珊瑚样品的共附生微生物表型均以好氧型细菌为主; 微塑料暴露后, 对照组和实验组好氧和兼性厌氧表型的相对丰度变化不大, 但是厌氧表型变化显著; 在暴露后第2 d和第7 d, 在实验组中的相对丰度高于对照组, 第3 d, 呈相反趋势.在氧化胁迫耐受表型方面, 除PA3以外, 实验组较对照组均有不同程度的上升.
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图 8 微塑料暴露不同时间珊瑚共附生细菌BugBase表型预测 Fig. 8 BugBase phenotype prediction of symbiotic bacterial community of coral at different microplastic exposure times |
FAPROTAX功能预测结果表明, 在TOP20的功能中, 化能异养、好氧化能异养、芳香化合物降解、动物寄生虫或共生体和人类病原体是微塑料暴露前后所有珊瑚样本中共附生细菌的主要功能[图 9(a)].从FAPROTAX功能预测的组间差异分析(只显示显著性差异)来看[图 9(b)], 组间差异显著(P < 0.05)的功能共9种：动物寄生虫或共生体、尿素分解、烃类降解、芳香烃降解、甲基营养、亚硝酸盐氨化、甲醇氧化、固氮和叶绿体, 说明微塑料暴露导致珊瑚共附生细菌与宿主的共生关系、碳和氮的循环及光合作用等功能发生显著变化.其中, 微塑料暴露后, 尿素分解、烃类和芳香烃降解功能的变化趋势相同, 在微塑料暴露第2 d和3 d中实验组相对丰度均低于对照组, 且呈下降趋势; 微塑料暴露第7 d开始上升, 且实验组相对丰度高于对照组.对于动物寄生虫或共生体和人类病原体功能在微塑料暴露后的相对丰度, 实验组均低于对照组.在微塑料暴露第2 d, 实验组中和氮循环相关的氮呼吸、硝酸盐呼吸和亚硝酸盐呼吸等功能的相对丰度均低于对照组; 第3 d和7 d, 在实验组和对照组中的相对丰度变化不大.
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(a)FAPROTAX功能预测图; (b)组间差异分析(只显示显著性差异功能) 图 9 微塑料暴露不同时间珊瑚共附生细菌FAPROTAX功能预测 Fig. 9 FAPROTAX function prediction of symbiotic bacterial community of coral at different microplastic exposure times |
目前关于微塑料对珊瑚影响的研究, 主要集中于微塑料对珊瑚的摄食、生长发育、应激能力、免疫系统和共生虫黄藻密度等方面的影响, 结果表明微塑料污染已经对珊瑚健康带来了新的威胁, 而珊瑚共附生微生物对于珊瑚的能量供给、物质转化和生理健康至关重要.然而, 对于微塑料污染会对珊瑚共附生微生物带来怎样的影响？微生物作为第一道缓冲带, 如何通过种群更替和分布变化等来应对微塑料污染？进而对珊瑚又带来怎样的影响？针对这些重要的科学问题, 目前还未见研究报道.本研究在微塑料暴露下, 从微生物的角度探究微塑料对珊瑚共附生细菌多样性、群落结构及其功能的影响, 有助于更加深入地认识微塑料对珊瑚造成危害的具体机制, 为微塑料的生态毒理学提供理论依据.
本研究中, 微塑料暴露后珊瑚共附生细菌α-多样性发生变化(先降低, 后上升), 说明微塑料这种环境压力对珊瑚共附生细菌多样性产生影响.环境的变化会导致珊瑚共附生细菌多样性的变化, 例如Yu等[42]指出高纬度珊瑚共生细菌丰富度和多样性在不同季节均有显著变化, Chao1指数和Ace指数显示夏季群落丰富度最高, 春季最低, Shannon指数显示夏季群落多样性最高, 春季最低; Lu等[43]发现珊瑚微生物组成和多样性均受到温度的影响, 进行冷处理时, 珊瑚微生物群落的Simpson指数范围为(0.09±0.02)~(0.32±0.09), Chao1指数范围为(506.5±73.41)~(328.4±33.39).Woo等[44]发现来自不同地理位置(中国台湾、日本和韩国)的Scleronephthya gracillimum软珊瑚样本的细菌多样性明显不同, Shannon指数为0.92~2.67.在本研究中, Shannon指数为1.65~4.99, Ace指数为368.27~1 133.50, Chao1指数为369.70~1 140.10, 本研究与上述研究的α-多样性均存在差异, 这可能与研究的珊瑚种类和环境压力不同有关, 但是环境因子确实对珊瑚共附生细菌多样性产生影响.
在本研究中, Ralstonia是珊瑚共附生细菌群落的优势类群, 已有研究表明Ralstonia是珊瑚共生细菌群落的类群之一, 和珊瑚其他共生生物体共同组成了珊瑚共生体[45]; 但本研究中Ralstonia的相对丰度变化较大, 特别是在实验组中, 微塑料暴露第2 d时, Ralstonia的相对丰度为76.98%, 高于对照组, 但到暴露第7 d时, 实验组的相对丰度为16.51%, 低于对照组, 可见, 微塑料暴露使优势类群Ralstonia的相对丰度发生变化, 总体呈下降趋势, 说明微塑料暴露对细菌类群与珊瑚的共生关系产生影响. Acinetobacter类群在本研究珊瑚共附生细菌群落中的相对丰度也较高. Acinetobacter被认为是珊瑚的第一道有效防线[46, 47]; 从本研究中Acinetobacter类群的相对丰度变化来看, 微塑料暴露第3 d该类群为实验组(16.60%)的优势类群, 但是到暴露第7 d时, 其在实验组中的相对丰度降为4.89%, 可见, 随着微塑料暴露时间的加长, Acinetobacter类群的相对丰度降低, 说明微塑料暴露后导致参与珊瑚防御体系的细菌类群遭到破坏.此外, 在本研究中Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia在珊瑚共附生细菌群落中的相对丰度为第三, 但在各样品中的变化不大.文献[48]指出Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia是机会致病菌且有抗生素耐药性, Daniels等[49]曾在患病的珊瑚样本中发现Burkholderiaceae的存在, 且mRNA序列丰度较高.根据报道, Delftia具有降解聚乙烯[50]和外源物的能力[51], 在本研究中, 微塑料暴露第3 d时Delftia的相对丰度高达10.57%, 成为优势类群之一, 可见微塑料暴露可引起降解外源物相关微生物相对丰度的变化.
在本研究中, 微塑料暴露前后所有样品的珊瑚共附生细菌群落均以Proteobacteria占优势(53.11% ~93.14%).Yu等[42]对广西涠洲岛石珊瑚共生细菌的研究表明, 春季、秋季和冬季的优势门均为Proteobacteria, 分别占95.42%、80.13%和93.75%, 夏季的优势门为Bacteroidota, 占49.68%, 但Proteobacteria仍为第二大优势门, 占35.71%; Lu等[43]对恒温和非恒温培养条件下的软珊瑚Sarcophyton trocheliophorum进行快速冷却处理, 结果显示非恒温培养条件下的对照组和实验组共生细菌群落优势门均为Tenericutes(54.76%和55.86%, 相对丰度, 下同)和Proteobacteria(25.68%和27.59%), 而恒温培养条件下的对照组优势门为Tenericutes(36.3%)、Firmicutes(23.53%)和Protebacteria(15.24%), 实验组优势门为Protebacteria(53.21%)和Bacteroidetes(38.06%); Woo等[44]对来自中国、日本和韩国的软珊瑚Scleronephthya gracillimum细菌群落结构进行比较分析, 结果显示γ-Proteobacteria在3个区域的样本中均占主导地位; Proteobacteria是来自深海、热带和冷水环境石珊瑚的典型优势门[52, 53], 基于以上研究可知, Protebacteria是珊瑚共附生细菌群落的核心优势类群, 对珊瑚基本生命的维持是必需的.属于Actinobacteriota的Microbacterium awajiense、Rhodococcus jostii、Mycobacterium vanbaalenii和Streptomyces fulvissimus能够降解微塑料聚合物, 可显著减小PE微塑料的尺寸[54]; Bacteroidota常定殖在微塑料表面[55], 并且可利用多种聚合物[56], 在本研究中, 微塑料暴露第7 d, 与对照组相比, 实验组Actinobacteriota和Bacteroidota的相对丰度显著增加, 推测Actinobacteriota和Bacteroidota这两个类群相对丰度的增加可能与PA的添加有关.
微塑料暴露后, 珊瑚共附生细菌必需的代谢途径, 如氨基酸代谢、碳水化合物代谢和能量代谢等相对丰度变化不大, 说明PA的添加并没有影响珊瑚共附生细菌群落基本的代谢功能.然而, 微塑料PA暴露第3 d和第7 d后, 珊瑚共附生细菌的信号转导、外源物质生物降解及代谢和细胞运动均低于对照组; Ziegler等[37]曾报道珊瑚可以通过调整共附生细菌群落来快速地适应环境压力, 但是本研究结果表明微塑料暴露后, 珊瑚共附生细菌群落的信号转导功能相对丰度降低, 信号转导是与环境信息处理相关的功能, 其相对丰度的降低, 说明微塑料的添加导致珊瑚共附生微生物的环境信息处理能力减弱, 进而无法快速适应环境的变化.微塑料含有稳定剂、阻燃剂和增塑剂等各种化学添加剂, 外源物质生物降解及代谢功能相对丰度降低, 即对这些有毒有害物质的降解代谢能力降低; 细胞运动与细胞向营养物质运动和躲避有毒物质以适应多变的环境有关, 细胞运动功能相对丰度降低, 即对有毒有害物质的躲避能力下降, 因此微塑料的添加导致珊瑚共附生细菌对有毒有害物质的降解能力和躲避能力下降, 一定程度上影响其相关代谢功能, 这与已有报道一致[57, 58].
FAPROTAX功能组间差异检验表明, 动物寄生虫或共生体功能的相对丰度在微塑料暴露后均显著低于对照组(P < 0.05).对于健康的珊瑚而言, 珊瑚与共附生微生物之间处于互利共生的状态, 但对环境扰动敏感[59], 因而微塑料会带来新的环境压力, 引起动物寄生虫或共生体功能的相对丰度下降.此外, 氮循环相关的氮呼吸、硝酸盐呼吸和亚硝酸盐呼吸等功能的相对丰度在微塑料暴露第2 d急剧下降, 之后又恢复到正常水平, 说明微塑料的添加影响珊瑚共附生细菌参与氮循环的相关功能.已有研究报道硝酸盐还原细菌在能量利用、维护生态系统的功能和减缓珊瑚白化方面发挥了作用[60]; Ralstonia可与珊瑚宿主共生, 具有固氮功能[45]; 与珊瑚共生的反硝化菌参与的反硝化作用是珊瑚中相对活跃的代谢途径[61], 这些都表明珊瑚共附生细菌在氮循环中发挥着重要作用[62].
4 结论(1) 珊瑚共附生细菌群落α-多样性随微塑料暴露时间的不同先降低后上升.
(2) 微塑料暴露使珊瑚共附生细菌群落发生显著变化, 且暴露不同时间的细菌群落也不同, 使Proteobacteria、Chloroflexi、Firmicutes、Actinobacteriota、Bacteroidota和Acidobacteriota的相对丰度增加.
(3) 微塑料暴露后珊瑚共附生细菌的优势类群主要包括Ralstonia、Acinetobacter和Delftia.
(4) 微塑料暴露后菌群的信号转导、细胞群落-原核生物、外源物质生物降解及代谢和细胞运动功能降低, 致使共附生细菌与宿主的共生关系、碳和氮的循环及光合作用功能发生显著变化.
| [1] | Thompson R C, Olsen Y, Mitchell R P, et al. Lost at sea: where is all the plastic?[J]. Science, 2004, 304(5672): 838. DOI:10.1126/science.1094559 |
| [2] | Eriksen M, Lebreton L C M, Carson H S, et al. Plastic pollution in the world's oceans: more than 5 trillion plastic pieces weighing over 250, 000 tons afloat at sea[J]. PLoS One, 2014, 9(12). DOI:10.1371/journal.pone.0111913 |
| [3] | Lebreton L C M, van der Zwet J, Damsteeg J W, et al. River plastic emissions to the world's oceans[J]. Nature Communications, 2017, 8(1). DOI:10.1038/ncomms15611 |
| [4] | Min K, Cuiffi J D, Mathers R T. Ranking environmental degradation trends of plastic marine debris based on physical properties and molecular structure[J]. Nature Communications, 2020, 11(1). DOI:10.1038/s41467-020-14538-z |
| [5] | Critchell K, Lambrechts J. Modelling accumulation of marine plastics in the coastal zone; what are the dominant physical processes?[J]. Estuarine, Coastal and Shelf Science, 2016, 171: 111-122. DOI:10.1016/j.ecss.2016.01.036 |
| [6] | Chae D H, Kim I S, Kim S K, et al. Abundance and distribution characteristics of microplastics in surface seawaters of the Incheon/Kyeonggi coastal region[J]. Archives of Environmental Contamination and Toxicology, 2015, 69(3): 269-278. DOI:10.1007/s00244-015-0173-4 |
| [7] |
李汶璐, 王志超, 杨文焕, 等. 微塑料对沉积物细菌群落组成和多样性的影响[J]. 环境科学, 2022, 43(5): 2606-2613. Li W L, Wang Z C, Yang W H, et al. Effects of microplastics on bacterial community composition and diversity in sediments[J]. Environmental Science, 2022, 43(5): 2606-2613. DOI:10.13227/j.hjkx.202109135 |
| [8] | Liao B L, Wang J J, Xiao B H, et al. Effects of acute microplastic exposure on physiological parameters in Tubastrea aurea corals[J]. Marine Pollution Bulletin, 2021, 165. DOI:10.1016/j.marpolbul.2021.112173 |
| [9] |
邵媛媛, 张帆, 梁庆霞. 陆地-海洋生态系统微塑料污染现状研究[J]. 生态环境学报, 2020, 29(10): 2118-2129. Shao Y Y, Zhang F, Liang Q X. Research on microplastic pollution in terrestrial-marine ecosystems[J]. Ecology and Environmental Sciences, 2020, 29(10): 2118-2129. DOI:10.16258/j.cnki.1674-5906.2020.10.023 |
| [10] | Galloway T S, Cole M, Lewis C. Interactions of microplastic debris throughout the marine ecosystem[J]. Nature Ecology & Evolution, 2017, 1(5). DOI:10.1038/s41559-017-0116 |
| [11] | Wright S L, Thompson R C, Galloway T S. The physical impacts of microplastics on marine organisms: a review[J]. Environmental Pollution, 2013, 178: 483-492. DOI:10.1016/j.envpol.2013.02.031 |
| [12] | Devriese L I, van der Meulen M D, Maes T, et al. Microplastic contamination in brown shrimp (Crangon crangon, Linnaeus 1758) from coastal waters of the Southern North Sea and Channel area[J]. Marine Pollution Bulletin, 2015, 98(1-2): 179-187. DOI:10.1016/j.marpolbul.2015.06.051 |
| [13] | Sun X X, Li Q J, Zhu M L, et al. Ingestion of microplastics by natural zooplankton groups in the northern South China Sea[J]. Marine Pollution Bulletin, 2017, 115(1-2): 217-224. DOI:10.1016/j.marpolbul.2016.12.004 |
| [14] | Tanaka K, Takada H. Microplastic fragments and microbeads in digestive tracts of planktivorous fish from urban coastal waters[J]. Scientific Reports, 2016, 6. DOI:10.1038/srep34351 |
| [15] | Van Cauwenberghe L, Janssen C R. Microplastics in bivalves cultured for human consumption[J]. Environmental Pollution, 2014, 193: 65-70. DOI:10.1016/j.envpol.2014.06.010 |
| [16] | Bejgarn S, Macleod M, Bogdal C, et al. Toxicity of leachate from weathering plastics: an exploratory screening study with Nitocra spinipes[J]. Chemosphere, 2015, 132: 114-119. DOI:10.1016/j.chemosphere.2015.03.010 |
| [17] | Hamlin H J, Marciano K, Downs C A. Migration of nonylphenol from food-grade plastic is toxic to the coral reef fish species Pseudochromis fridmani[J]. Chemosphere, 2015, 139: 223-228. DOI:10.1016/j.chemosphere.2015.06.032 |
| [18] | Xiao B H, Li D D, Liao B L, et al. Effects of microplastics exposure on the Acropora sp. antioxidant, immunization and energy metabolism enzyme activities[J]. Frontiers in Microbiology, 2021, 12. DOI:10.3389/fmicb.2021.666100 |
| [19] | Wang W F, Ge J, Yu X Y. Bioavailability and toxicity of microplastics to fish species: a review[J]. Ecotoxicology and Environmental Safety, 2020, 189. DOI:10.1016/j.ecoenv.2019.109913 |
| [20] | Lu L, Luo T, Zhao Y, et al. Interaction between microplastics and microorganism as well as gut microbiota: a consideration on environmental animal and human health[J]. Science of the Total Environment, 2019, 667: 94-100. DOI:10.1016/j.scitotenv.2019.02.380 |
| [21] | Hartmann N B, Rist S, Bodin J, et al. Microplastics as vectors for environmental contaminants: exploring sorption, desorption, and transfer to biota[J]. Integrated Environmental Assessment and Management, 2017, 13(3): 488-493. DOI:10.1002/ieam.1904 |
| [22] | Lo H S, Xu X Y, Wong C Y, et al. Comparisons of microplastic pollution between mudflats and sandy beaches in Hong Kong[J]. Environmental Pollution, 2018, 236: 208-217. DOI:10.1016/j.envpol.2018.01.031 |
| [23] | Huang Y J, Yan M T, Xu K H, et al. Distribution characteristics of microplastics in Zhubi Reef from South China Sea[J]. Environmental Pollution, 2019, 255. DOI:10.1016/j.envpol.2019.113133 |
| [24] | Viršek M K, Lovšin M N, Koren Š, et al. Microplastics as a vector for the transport of the bacterial fish pathogen species Aeromonas salmonicida[J]. Marine Pollution Bulletin, 2017, 125(1-2): 301-309. DOI:10.1016/j.marpolbul.2017.08.024 |
| [25] | Vidyasakar A, Neelavannan K, Krishnakumar S, et al. Macrodebris and microplastic distribution in the beaches of Rameswaram Coral Island, Gulf of Mannar, southeast coast of India: a first report[J]. Marine Pollution Bulletin, 2018, 137: 610-616. DOI:10.1016/j.marpolbul.2018.11.007 |
| [26] | Jensen L H, Motti C A, Garm A L, et al. Sources, distribution and fate of microfibres on the Great Barrier Reef, Australia[J]. Scientific Reports, 2019, 9(1). DOI:10.1038/s41598-019-45340-7 |
| [27] | Imhof H K, Sigl R, Brauer E, et al. Spatial and temporal variation of macro-, meso- and microplastic abundance on a remote coral island of the Maldives, Indian Ocean[J]. Marine Pollution Bulletin, 2017, 116(1-2): 340-347. DOI:10.1016/j.marpolbul.2017.01.010 |
| [28] | Saliu F, Montano S, Garavaglia M G, et al. Microplastic and charred microplastic in the Faafu Atoll, Maldives[J]. Marine Pollution Bulletin, 2018, 136: 464-471. DOI:10.1016/j.marpolbul.2018.09.023 |
| [29] | Ding J F, Jiang F H, Li J X, et al. Microplastics in the coral reef systems from Xisha Islands of South China Sea[J]. Environmental Science & Technology, 2019, 53(14): 8036-8046. |
| [30] | Zhang L L, Zhang S P, Wang Y H, et al. The spatial distribution of microplastic in the sands of a coral reef island in the South China Sea: comparisons of the fringing reef and atoll[J]. Science of the Total Environment, 2019, 688: 780-786. DOI:10.1016/j.scitotenv.2019.06.178 |
| [31] | Hall N M, Berry K L E, Rintoul L, et al. Microplastic ingestion by scleractinian corals[J]. Marine Biology, 2015, 162(3): 725-732. DOI:10.1007/s00227-015-2619-7 |
| [32] | Allen A S, Seymour A C, Rittschof D. Chemoreception drives plastic consumption in a hard coral[J]. Marine Pollution Bulletin, 2017, 124(1): 198-205. DOI:10.1016/j.marpolbul.2017.07.030 |
| [33] | Tang J, Ni X Z, Zhou Z, et al. Acute microplastic exposure raises stress response and suppresses detoxification and immune capacities in the scleractinian coral Pocillopora damicornis[J]. Environmental Pollution, 2018, 243: 66-74. DOI:10.1016/j.envpol.2018.08.045 |
| [34] | Reichert J, Schellenberg J, Schubert P, et al. Responses of reef building corals to microplastic exposure[J]. Environmental Pollution, 2018, 237: 955-960. DOI:10.1016/j.envpol.2017.11.006 |
| [35] | Lamb J B, Willis B L, Fiorenza E A, et al. Plastic waste associated with disease on coral reefs[J]. Science, 2018, 359(6374): 460-462. DOI:10.1126/science.aar3320 |
| [36] | Chapron L, Peru E, Engler A, et al. Macro- and microplastics affect cold-water corals growth, feeding and behaviour[J]. Scientific Reports, 2018, 8(1). DOI:10.1038/s41598-018-33683-6 |
| [37] | Ziegler M, Grupstra C G B, Barreto M M, et al. Coral bacterial community structure responds to environmental change in a host-specific manner[J]. Nature Communications, 2019, 10(1). DOI:10.1038/s41467-019-10969-5 |
| [38] | Erler D V, Farid H T, Glaze T D, et al. Coral skeletons reveal the history of nitrogen cycling in the coastal Great Barrier Reef[J]. Nature Communications, 2020, 11(1). DOI:10.1038/s41467-020-15278-w |
| [39] | Zhang F, Jonas L, Lin H Z, et al. Microbially mediated nutrient cycles in marine sponges[J]. FEMS Microbiology Ecology, 2019, 95(11). DOI:10.1093/femsec/fiz155 |
| [40] |
晁华, 申玉春, 刘丽. 氮磷对珊瑚过氧化氢酶和超氧化物歧化酶活性的影响[J]. 中国农学通报, 2016, 32(17): 12-19. Chao H, Shen Y C, Liu L. Nitrogen and phosphorus affecting activities of catalase and superoxide dismutase in coral[J]. Chinese Agricultural Science Bulletin, 2016, 32(17): 12-19. |
| [41] | Edgar R C. UPARSE: highly accurate OTU sequences from microbial amplicon reads[J]. Nature Methods, 2013, 10(10): 996-998. DOI:10.1038/nmeth.2604 |
| [42] | Yu X P, Yu K F, Liao Z H, et al. Seasonal fluctuations in symbiotic bacteria and their role in environmental adaptation of the scleractinian coral Acropora pruinosa in high-latitude coral reef area of the South China Sea[J]. Science of the Total Environment, 2021, 792. DOI:10.1016/j.scitotenv.2021.148438 |
| [43] | Lu H, Asem A, Li W D, et al. Influence of temperature changes on symbiotic Symbiodiniaceae and bacterial communities' structure: an experimental study on soft coral Sarcophyton trocheliophorum (Anthozoa: Alcyoniidae)[J]. Journal of Tropical Ecology, 2021, 37(6): 253-262. DOI:10.1017/S0266467421000109 |
| [44] | Woo S, Yang S H, Chen H J, et al. Geographical variations in bacterial communities associated with soft coral Scleronephthya gracillimum[J]. PLoS One, 2017, 12(8). DOI:10.1371/journal.pone.0183663 |
| [45] | Ainsworth T D, Krause L, Bridge T, et al. The coral core microbiome identifies rare bacterial taxa as ubiquitous endosymbionts[J]. The ISME Journal, 2015, 9(10): 2261-2274. DOI:10.1038/ismej.2015.39 |
| [46] | Fragoso Ados Santos H, Duarte G A S, da Costa Rachid C T, et al. Impact of oil spills on coral reefs can be reduced by bioremediation using probiotic microbiota[J]. Scientific Reports, 2015, 5. DOI:10.1038/srep18268 |
| [47] | Leite D C A, Salles J F, Calderon E N, et al. Coral bacterial-core abundance and network complexity as proxies for anthropogenic pollution[J]. Frontiers in Microbiology, 2018, 9. DOI:10.3389/fmicb.2018.00833 |
| [48] | Rhodes K A, Schweizer H P. Antibiotic resistance in Burkholderia species[J]. Drug Resistance Updates, 2016, 28: 82-90. DOI:10.1016/j.drup.2016.07.003 |
| [49] | Daniels C A, Baumgarten S, Yum L K, et al. Metatranscriptome analysis of the reef-building coral Orbicella faveolata indicates holobiont response to coral disease[J]. Frontiers in Marine Science, 2015, 2. DOI:10.3389/fmars.2015.00062 |
| [50] | Peixoto J, Silva L P, Krüger R H. Brazilian Cerrado soil reveals an untapped microbial potential for unpretreated polyethylene biodegradation[J]. Journal of Hazardous Materials, 2016, 324: 634-644. |
| [51] | Patil N K, Kundapur R, Shouche Y S, et al. Degradation of plasticizer di-n-butylphthalate by Delftia sp. TBKNP-05[J]. Current Microbiology, 2006, 52(5): 369-374. DOI:10.1007/s00284-005-5258-2 |
| [52] | Kellogg C A, Lisle J T, Galkiewicz J P. Culture-independent characterization of bacterial communities associated with the cold-water coral Lophelia pertusa in the northeastern Gulf of Mexico[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2009, 75(8). DOI:10.1128/AEM.02357-08 |
| [53] | Robertson V, Haltli B, McCauley E P, et al. Highly variable bacterial communities associated with the octocoral Antillogorgia elisabethae[J]. Microorganisms, 2016, 4(3). DOI:10.3390/microorganisms4030023 |
| [54] | Lwanga E H, Thapa B, Yang X M, et al. Decay of low-density polyethylene by bacteria extracted from earthworm's guts: a potential for soil restoration[J]. Science of the Total Environment, 2018, 624: 753-757. DOI:10.1016/j.scitotenv.2017.12.144 |
| [55] | Xu X Y, Wang S, Gao F L, et al. Marine microplastic-associated bacterial community succession in response to geography, exposure time, and plastic type in China's coastal seawaters[J]. Marine Pollution Bulletin, 2019, 145: 278-286. |
| [56] | Bauer M, Kube M, Teeling H, et al. Whole genome analysis of the marine Bacteroidetes 'Gramella forsetii' reveals adaptations to degradation of polymeric organic matter[J]. Environmental Microbiology, 2010, 8(12): 2201-2213. |
| [57] |
陈玉芳, 闫振华, 张燕, 等. 城市水体微塑料垂向分布下附着细菌群落结构和功能响应[J]. 环境科学, 2022, 43(6): 3088-3096. Chen Y F, Yan Z H, Zhang Y, et al. Community structure and microbial function responses of biofilms colonizing on microplastics with vertical distribution in urban water[J]. Environmental Science, 2022, 43(6): 3088-3096. |
| [58] | Kisand V, Valente A, Lahm A, et al. Phylogenetic and functional metagenomic profiling for assessing microbial biodiversity in environmental monitoring[J]. PLoS One, 2012, 7(8). DOI:10.1371/journal.pone.0043630 |
| [59] | Bourne D G, Morrow K M, Webster N S. Insights into the coral microbiome: underpinning the health and resilience of reef ecosystems[J]. Annual Review of Microbiology, 2016, 70: 317-340. |
| [60] | Semenova E M, Ershov A P, Sokolova D S, et al. Diversity and biotechnological potential of nitrate-reducing bacteria from heavy-oil reservoirs (Russia)[J]. Microbiology, 2020, 89(6): 685-696. |
| [61] | Tilstra A, El-Khaled Y C, Roth F, et al. Publisher correction: denitrification aligns with N2 fixation in Red Sea corals[J]. Scientific Reports, 2020, 10(1). DOI:10.1038/s41598-020-59353-0 |
| [62] | Bulan D E, Wilantho A, Krainara P, et al. Spatial and seasonal variability of reef bacterial communities in the upper Gulf of Thailand[J]. Frontiers in Marine Science, 2018, 5. DOI:10.3389/fmars.2018.00441 |