2023, Vol. 44
2. 沈阳农业大学农学院, 沈阳 110866
, LIU Zhu1,2 , MENG Wei-wei1 , DAI Hong-cui1 , XU Jie1 , WANG Na1 , LIU Ling-yan1 , WANG Xu-qing1
, LIU Kai-chang1
2. College of Agriculture, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China
黄河流域是我国重要的粮食主产区, 在我国经济社会发展和生态安全方面具有举足轻重的地位.在以小麦-玉米周年种植制度为主的黄河下游冲积平原, 集约化种植导致耕地长期高负荷运转, 土壤肥力下降、耕层变浅、养分利用率降低和重金属污染等一系列土壤健康问题日益严重[1, 2].基于这一现状, 为坚守18亿亩耕地红线, 保障国家粮食安全, 更好地实施“藏粮于地、藏粮于技”战略, 实现节约地下水、保护生态环境的目标, 我国于2016年提出在部分地区探索试行耕地轮作休耕制度[3]; 且近年来, 中央一号文件连续提出健全耕地轮作休耕制度.这对提升我国耕地质量、促进农业提质增效、保障食品安全和维护生态健康具有重要意义.
土壤微生物是土壤的重要组成成分, 80%~90%的土壤相关功能由微生物调节, 在农田生态系统中起着关键作用, 可释放多种酶类, 参与土壤有机质降解、腐殖质合成和养分循环等生物化学过程, 被认为是最敏感的土壤质量生物学指标[4~6].土壤真菌作为土壤微生物的重要组成部分, 构成了大部分微生物生物量, 在土壤有机质的形成和分解、营养元素的循环和利用、土壤肥力的保持和提高、生态环境的改善和修复等方面起着至关重要的作用[7~9]; 且与细菌相比, 真菌能更好地降解复杂化合物[10]. 有研究表明, 土地利用类型[11~13]、作物种植制度[14~19]、地上植被种类[15~20]、农田耕作方式[18~22]、秸秆物料投入[22~24]和水肥管理措施[17, 24~26]等单种或多种因素均可通过改变土壤水、肥、气、热条件引起土壤微生物群落结构发生变化, 影响土壤真菌群落多样性和功能.然而, 关于轮作休耕如何影响土壤真菌群落结构特征的研究较为少见, 尤其是黄河下游冲积平原尚未见类似报道.因此, 本文基于田间轮作休耕定位试验, 研究黄河下游冲积平原农田土壤真菌群落结构及功能对不同轮作休耕方式的响应差异, 并结合土壤理化性状揭示其驱动因素, 通过阐明不同轮作休耕方式影响农田土壤肥力的微生态变化特性, 以期为促进黄河下游冲积平原农田生态自我修复和耕地质量提升, 推动黄河流域生态保护和高质量发展提供科学依据.
1 材料与方法 1.1 试验概况本试验设置于山东省济南市济阳区山东省农业科学院综合试验示范基地(116°58′E, 36°58′N).地处黄河下游冲积平原, 平均海拔20 m; 属暖温带半湿润季风气候, 四季分明, 光照充足, 雨热同期, 年均气温12.8℃, 年均无霜期195 d, 年均日照时数2 618 h, 年均降水量580 mm.供试土壤为潮土, 发育于黄河冲积母质, 表土质地砂壤.2017年10月至2018年6月种植济麦22, 冬小麦收获后始设长期轮作休耕定位试验.本定位试验初始时耕层(0~20 cm)土壤理化性状：ω(有机质)12.1 g·kg-1、ω(全氮)0.7 g·kg-1、ω(全磷)0.8 g·kg-1、ω(全钾)19.2 g·kg-1、ω(碱解氮)50.6 mg·kg-1、ω(有效磷)20.5 mg·kg-1和ω(速效钾)151.9 mg·kg-1, pH为8.0.耕作期冬小麦品种为济麦22, 夏玉米品种为登海605, 播前基施氮磷钾复合肥(15-15-15)750 kg·hm-2, 冬小麦拔节期、夏玉米大口期追施尿素225 kg·hm-2, 其他管理措施同传统耕作, 耕层深度均为20 cm, 秸秆还田; 休耕期无管理措施.
2020年6月冬小麦收获后, 选取长期休耕(LF, 已连续休耕2 a)、冬小麦-夏休耕(WF, 季节性休耕)、冬休耕-夏玉米(FM, 季节性休耕)、冬小麦-夏玉米周年轮作(WM)这4个处理0~20 cm和20~40 cm土层的土壤, 每个处理3次重复, 共计12个小区、24个样本.田间自建气象站记录2020年6月1日降雨7.3 mm; 6月2日至取样(6月15日)期间无降雨且无灌溉[27].
1.2 样品采集2020年6月15日麦收后, 小区“S”形5点采集0~20 cm和20~40 cm土层土壤样品.同小区同土层样品混合, 部分样品直接装入铝盒测定土壤水分, 剩余用干冰保存并迅速带回实验室.剔去沙石、根系等杂质后, 部分鲜土样品转入无菌冻存管中, 储存于-80℃冰箱, 用于分析土壤真菌群落结构; 剩余样品自然风干后过0.25 mm和1 mm筛测定土壤理化性状.
1.3 测定方法土壤全氮(TN)采用凯氏定氮法, 土壤全磷(TP)采用氢氧化钠碱熔-钼锑抗分光光度法, 土壤全钾(TK)采用原子吸收火焰光度计法, 土壤碱解氮(AN)采用碱解扩散法, 土壤有效磷(AP)采用碳酸氢钠-钼锑抗分光光度法, 土壤速效钾(AK)采用醋酸铵-原子吸收火焰分光光度计法, 土壤有机碳(TOC)采用重铬酸钾氧化-外加热法.以上测定均参考鲍士旦[28]的方法进行.土壤含水率(SWC)采用重量分析法, pH采用电位法(水土比2.5 ∶1).
土壤真菌群落的18S rRNA测序土壤DNA提取使用DNA提取试剂盒(OMEGA, 美国), 提取方法参照说明书.利用1%琼脂糖凝胶电泳检测抽提基因组DNA的纯度和完整性.使用NanoDrop ND-2000分光光度计(NanoDrop, ND2000, Thermo Scientific, Wilmington)测定所提DNA的浓度与纯度.选用真菌18S通用引物0817F: 5′-TTAGCATGGAATAAT RRAATAGGA-3′, 1196R: 5′-TCTGGACCTGGTGA GTTTCC-3′进行扩增, 选用TransGen AP221-02试剂盒, 扩增体系为20 μL, 包括4 μL的5×FastPfu Buffer, 2 μL的2.5 mmol·L-1 dNTPs, 引物(5 μmol·L-1)各0.8 μL, 0.4 μL的FastPfu Polymerase和10 ng模板DNA.扩增条件为95℃解链2 min, 95℃ 30 s, 55℃ 30 s, 72℃ 30 s, 25个循环, 再72℃延伸5 min, 于ABI GeneAmpⓇ 9700型PCR仪上进行.每个样本3次重复, 将同一样本的PCR产物混合后用2%琼脂糖凝胶电泳检测, 回收扩增子, 依照AxyPrep DNA Gel Extraction Kit说明书进行纯化(Axygen Biosciences, Union City, U.S.), 再用QuantiFluorTM-ST(Promega, U.S.)进行定量.采用Illumina MiSeq测序平台标准流程进行双端测序.
1.4 数据处理经过QIIME(1.9.1)软件过滤、拼接、去除嵌合体后[29], 聚类为用于物种分类的OTU(operational taxonomic units), 并将所有样品进行抽平.采用RDP classifier贝叶斯算法对97%相似水平的OTU表示序列进行分类学分析[30], 置信度阈值为0.7, 选用Silva数据库, 得到分类学信息; 利用Mothur(Version 1.30.2)进行α多样性分析, 基于unifrace距离进行群落结构分析; 采用all-against-all策略, 阈值4.0, 进行LEfSe多级物种差异判别分析; 通过RDA分析样本分布和环境因子间的关系.使用Python 3.7进行真菌功能类群FUNGuild数据库[31]比对.通过R语言作图, 使用SPSS 26.0进行单因素方差分析(one-way analysis)和多重比较(LSD).
2 结果与分析 2.1 轮作休耕农田土壤真菌群落多样性分析 2.1.1 土壤真菌群落测序分析利用Illumina MiSeq平台测序结果显示, 24个土壤样本共获得有效序列1 743 320条, 经过优化筛选, 基于97%的相似性, 获得2 262 OTU, 划分为14门、34纲、75目、169科、309属和523种(表 1).其中, 0~20 cm土层包括土壤真菌13门, 低于包括14门的20~40 cm土层; 但0~20 cm土层包括的纲、目、科、属、种、OTU及有效序列数均高于20~40 cm土层.
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表 1 土壤样本序列信息与真菌类别 Table 1 Sequence information and fungi classification of all soil samples |
在轮作休耕农田中, 0~20 cm和20~40 cm土层土壤真菌OTU数目分别为4 318和3 461, 共有的OTU数目分别为420和253(图 1).0~20 cm土层中[图 1(a)], LF、FM、WF和WM的OTU数目分别为1 222、914、1 007和1 175, 特有的OTU数目分别为262、125、156和209; 20~40 cm土层中[图 1(b)], 4个处理的OTU数目依次为：WM>WF>FM>LF, 与0~20 cm土层次序不同; LF、FM、WF和WM特有的OTU数目分别为153、136、220和296.与0~20 cm土层相比, LF、FM、WF和WM的20~40 cm土层土壤真菌OTU数目分别减少558、141、30和128; 20~40 cm土层中LF特有的OTU数目减少, FM、WF和WM则增加.
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图 1 土壤真菌群落OTU水平的Venn图 Fig. 1 Venn on OTU level of soil fungal community |
将24个样本按最小样本序列数抽平1次, 每个样本得到63 979条高质量序列. Coverage指数表明测序土壤样本OTU涵盖了土壤中99.8%以上的真菌[图 2(g)和2(h)], 说明测序覆盖度可以比较真实地反映土壤样本的真菌群落, 表示真菌群落丰富度与α多样性.
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*、**和***分别表示P≤0.05, P≤0.01和P≤0.001 图 2 土壤真菌群落α多样性 Fig. 2 The α diversity of soil fungal community |
0~20 cm土层中, FM土壤真菌群落的Shannon指数[图 2(a)]和Simpson指数[图 2(c)]均与LF、WF和WM产生显著性差异(P＜0.01); LF的Shannon指数显著高于WF(P＜0.05), 但两个处理均与WM差异不显著; 而LF、WF和WM的Simpson指数差异不显著.Chao1指数[图 2(e)]与Shannon指数表现出相同的变化趋势, 但差异显著性不同.其中, LF的Chao1指数最大, WM与LF差异不显著, 但均显著高于WF和FM(P＜0.05), WF又显著高于FM(P＜0.05).20~40 cm土层中, LF与WF土壤真菌群落的Shannon指数[图 2(b)]和Simpson指数[图 2(d)]差异不显著, 但两个处理的Shannon指数均显著高于FM和WM(P＜0.05), WM的Simpson指数则最高; LF的Chao1指数最小[图 2(f)], FM与LF差异不显著, 但均显著低于WF和WM(P＜0.05), WF又显著高于WM(P＜0.05).与0~20 cm土层相比, 20~40 cm土层4个处理土壤真菌群落的Shannon指数和Chao1指数均呈下降趋势; 但在Simpson指数中, LF和WF降低, FM和WM则升高.
2.2 不同轮作休耕农田土壤真菌群落结构特征 2.2.1 土壤真菌群落结构组成不同轮作休耕农田中, 0~20 cm和20~40 cm土壤真菌门水平上群落组成及主要优势菌门(相对丰度＞1%)相同, 主要包含子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)和被孢菌门(Mortierellomycota), 但相对丰度各异(图 3).其中, 0~20 cm土层[图 3(a)]3类真菌相对丰度分别为67.25%~83.45%、4.25%~24.36%和5.30%~10.23%, 总相对丰度为91.69%~96.91%, 未被分类真菌占2.63%~6.60%; 20~40 cm土层[图 3(b)]3类真菌相对丰度分别为73.14%~81.87%、2.46%~5.00%和9.03%~15.12%, 总相对丰度为91.67%~94.86%, 未被分类真菌占4.38%~7.58%. 0~20 cm土层中, WF和LF的子囊菌门相对丰度高于FM和WM, 担子菌门则低于FM和WM; 20~40 cm土层中, WF和WM的子囊菌门相对丰度高于LF和FM.与0~20 cm土层相比, 20~40 cm土层中FM和WM的子囊菌门相对丰度增加, 担子菌门相对丰度降低; LF和FM的被孢菌门相对丰度增加.
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a1.子囊菌门, a2.担子菌门, a3.被孢菌门, a4.未被分类真菌, a5.其他; b1.子囊菌门, b2.被孢菌门, b3.未被分类真菌, b4.担子菌门, b5.其他 图 3 土壤真菌群落门水平的相对丰度与优势门分布 Fig. 3 Relative abundance of soil fungal community at phylum level and distribution of dominant phyla |
不同轮作休耕方式使0~20 cm和20~40 cm土壤真菌群落在OTU水平上基于unweighted unifrac距离算法的PCoA分析产生差异(图 4).在0~20 cm土层[图 4(a)], 以主成分PC1和PC2为坐标轴构建二维坐标系的PCoA分析中, PC1和PC2能够分别解释23.52%和22.04%的群落组成差异, 累计达45.56%; 在20~40 cm土层[图 4(b)], PC1和PC2能够分别解释29.53%和16.67%的群落组成差异, 累计达46.20%.从图 4可以看出, 同一处理的样本相互聚集, 说明处理内样本间相似性高; 而处理间分离, 则说明不同处理间土壤真菌群落存在差异.与0~20 cm土层相比, 20~40 cm土层4种方式在PCoA分析的二维坐标系内均发生顺时针位移.其中, LF沿PC2轴正移, FM沿PC1轴负移, WF沿PC2轴负移, WM沿PC1轴正移.
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图 4 土壤真菌群落OTU水平的PCoA分析 Fig. 4 PCoA on OTU level of soil fungal community |
为确定与不同轮作休耕方式相关的特定真菌类群, 采用all-against-all策略, 使用线性判别分析(LDA)效应大小(LEfSe), 比较LF、FM、WF和WM中0~40 cm土层的真菌群落, LEfSe的LDA阈值为4.0(图 5).图 5中从内到外不同的圆圈分别表示门、纲、目、科和属的分类; 不同颜色节点表示在对应土壤中显著富集, 且对组间差异存在显著影响的真菌类群; 淡黄色节点表示在不同土壤中均无显著差异, 或对组间差异无显著影响的真菌类群; 节点的大小表示相对丰度.
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图 5 土壤真菌的LEfSe多级物种差异判别分析(从门到属) Fig. 5 LEfSe analysis from phylum to genus level of soil fungal community |
在0~20 cm土层中[图 5(a)], 63个真菌进化枝在统计学上有显著差异(P＜0.05), LF、FM、WF和WM中分别包含9、16、22和16个.其中, 在真菌门分类水平上, WF中子囊菌门(Ascomycota)、FM中担子菌门(Basidiomycota)和WM中被孢菌门(Mortierellomycota)的相对丰度具有显著优势; 在属分类水平上, LF中Ceratobasidium, FM中Sarocladium、Cladosporium、Alternaria、Oidiodendron、Coprinopsis和Coprinellu, WF中Fusicolla、Clonostachys、Plectosphaerella和Cyphellophora, WM中Chaetomium、Conocybe、Solicoccozyma和Mortierella的相对丰度具有显著优势.在20~40 cm土层中[图 5(b)], 49个真菌进化枝在统计学上有显著差异(P＜0.05), LF、FM、WF和WM中分别包含16、9、12和12个.其中, 在真菌门分类水平上, FM中被孢菌门的相对丰度具有显著优势; 在属分类水平上, LF中Trichothecium和Alternaria, FM中Fusarium、Acremonium、Metarhizium和Mortierella, WF中Chaetomium和Penicillium, WM中Fusicolla和Solicoccozyma的相对丰度具有显著优势.
2.3 不同轮作休耕农田土壤真菌群落的功能注释利用FUNGuild数据库对不同轮作休耕土壤真菌群落的营养类型进行比对.结果如图 6所示, 不同轮作休耕农田的土壤真菌群落均以腐生营养型(saprotroph)、腐生-共生营养型(saprotroph-symbiotroph)、病理-腐生-共生营养型(pathotroph-saprotroph-symbiotroph)和病理营养型(pathotroph)为主要营养类型, 这4种营养类型的相对丰度均大于5%, 总相对丰度达66.83%~82.80%(0~20 cm)和66.21%~74.60%(20~40 cm); 而共生营养型(symbiotroph)仅在0.11%~0.21%(0~20 cm)和0.19%~0.33%(20~40 cm)之间.与0~20 cm土层相比, 20~40 cm土层中, 腐生营养型、病理-腐生-共生营养型、病理-腐生营养型和病理-共生营养型的平均相对丰度降低; 共生营养型相对丰度的变幅最大, 更易受土层深度影响, 其次是病理-共生营养型.
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图 6 土壤真菌群落的营养类型 Fig. 6 Trophic mode of soil fungal community |
在0~20 cm土层[图 6(a)], 4个处理中未区分营养类型(unclassified)的相对丰度在11.41%~25.66%之间, 腐生营养型在FM中最高, 腐生-共生营养型和病理-腐生-共生营养型在LF中最高, 病理营养型在WF中最高; LF中病理-腐生-共生营养型(30.47%)相对丰度最高, FM、WF和WM则是腐生营养型最高(40.89%、23.59%和30.15%).在20~40 cm土层[图 6(b)], 4个处理中未区分营养类型的相对丰度在20.71%~29.72%之间, 腐生营养型在WF中最高, 腐生-共生营养型和病理-腐生-共生营养型在FM中最高, 病理营养型在LF中最高; LF中病理营养型(23.55%)的相对丰度最高, FM中病理-腐生-共生营养型(26.36%)最高, WF和WM中则腐生营养型(28.55%和27.56%)均最高.
2.4 不同轮作休耕农田土壤真菌群落的环境效应为分析造成不同轮作休耕土壤真菌群落产生差异的关键影响因子, 对土壤真菌群落结构和土壤理化性质进行冗余分析(图 7).图 7(a)中RDA1和RDA2分别能够解释89.46%和8.58%的变异量, 图 7(b)中RDA1和RDA2分别能够解释土壤群落门水平上63.31%和28.33%的变异量, 可以分别反映出0~20 cm和20~40 cm土层土壤环境因子对土壤真菌群落结构影响的98.04%和91.64%.
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(a)和(b)中蓝色箭头表示优势菌门, 红色箭头表示土壤环境因子, 红蓝线的长短表示环境因子和优势菌门对土壤真菌群落影响程度的大小; SWC表示土壤含水率, TOC表示有机碳, TN表示全氮, TP表示全磷, TK表示全钾, AN表示碱解氮, AP表示有效磷, AK表示速效磷, C/N表示碳氮比.(c)和(d)中色块的颜色表示相关性R值, 红色表示正相关, 蓝色表示负相关; *、**和***分别表示P < 0.05、P < 0.01和P < 0.001 图 7 土壤真菌群落门水平的RDA与Spearman分析 Fig. 7 Spearman and RDA on phylum level of soil fungal community |
置换检验结果显示, 在0~20 cm土层[图 7(a)]中, TOC(r2=0.852 0, P＜0.05)、TN(r2=0.857 4, P＜0.05)、TP(r2=0.761 8, P＜0.05)、AN(r2=0.893 0, P＜0.05)和SWC(r2=0.663 4, P＜0.05)为主要影响真菌群落变化的环境因子.在20~40 cm土层[图 7(b)]中, TOC(r2=0.490 7, P＜0.05)、TP(r2=0.829 2, P＜0.05)、TK(r2=0.545 9, P＜0.05)、AN(r2=0.580 8, P＜0.05)、AP(r2=0.884 5, P＜0.05)、AK(r2=0.506 5, P＜0.05)、pH(r2=0.826 5, P＜0.05)和C/N(r2=0.562 4, P＜0.05)为主要影响真菌群落变化的环境因子.也就是说, 土壤TOC、TP、AN和SWC同是显著影响0~40 cm土层真菌群落变化的主要环境因子.
Spearman相关性分析发现, 0~20 cm土层[图 7(c)]的主要优势菌门子囊菌门与SWC、TP极显著负相关(P＜0.001), 担子菌门与SWC、TP则极显著负相关(P＜0.001), 被孢菌门与AN(P＜0.01)、TOC(P＜0.01)、TN(P＜0.01)、AP(P＜0.05)、pH(P＜0.01)显著正相关; 20~40 cm土层[图 7(d)]的子囊菌门与TP(P＜0.05)、pH(P＜0.01)呈显著正相关, 被孢菌门与SWC、TN之外的已知环境因子均呈显著负相关(P＜0.05), 担子菌门与TP(P＜0.05)呈显著负相关.
3 讨论 3.1 轮作休耕农田土壤真菌群落比较土壤真菌作为土壤微生物区系的重要成员, 与其他微生物一起参与土壤生态系统中物质循环和能量流动[9, 32].由于黄河下游冲积平原农田植物覆被不同加之轮作休耕方式的各异, 导致不同处理农田土壤环境存在区别, 土壤基本理化性状和养分含量产生差异, 进而使土壤微生物多样性和丰富度发生改变[27].本研究发现, 连续2 a休耕使耕层(0~20 cm)土壤真菌群落丰富度和多样性增加, 而冬小麦-夏休耕则使冬小麦收获后深层(20~40 cm)土壤真菌丰富度和多样性增加.这可能是因为连续2 a休耕导致耕层土壤温度比有作物遮蔽的土壤高, 雨水蓄积量比冬小麦-夏玉米轮作农田大, 为真菌生长提供丰富的能量和水分条件并形成良好的生长环境[33, 34].深层土壤与耕层产生的差异可能是受地上作物种类、秸秆还田、肥料施用和农田耕翻的综合影响[18~24].在夏季休耕期间, 还田的前茬冬小麦秸秆腐解积累了丰富的有机质, 为土壤微生物的生长和繁殖提供了充足的有机营养, 在休耕翻地后再次种植冬小麦及所施肥料的配合下促进了土壤真菌的活动和繁殖, 进而改变了土壤真菌丰度及其多样性[35, 36].本研究中, 深层(20~40 cm)土壤真菌群落多样性低于耕层(0~20 cm), 进一步验证了真菌α多样性随着土壤深度的增加而减少[37, 38].当然, 这可能与本试验条件下耕层土壤的活力及肥力更高也有关.耕层土壤中作物根系分布较深层密度大且范围广, 使土壤通透性增加, 活力增强, 营养元素的循环代谢更高效, 且部分肥料的投入也使土壤肥力提升.另外, 耕层土壤较深层更容易受到人为扰动等因素的影响, 人为扰动对土壤真菌群落的影响可能在较长时间内持续存在[39].
土壤真菌群落结构与群落多样性密切相关, 同样受到多种因素的影响[16], 各种因素或多或少地使土壤微环境发生变化, 导致真菌群落组成和丰度产生差异, 从而形成了多样而又各异的真菌群落特征[15, 33, 40].本研究发现, 不同轮作休耕农田土壤真菌群落表现为菌门组成相似, 但相对丰度各异.4个处理虽然设于同一农田地块中, 但地上植被和土壤性状的变化, 使根系微环境产生变化, 形成了多样的真菌群落.这既反映了土壤真菌群落结构的宿主特异性, 同时也印证了不同植物对土壤真菌群落结构具有主动选择性[41, 42].即使在相同土壤生境中, 不同植物也具有不同的根系微环境和真菌群落结构[43].本研究中, 不同休耕轮作模式下真菌群落结构主要优势菌群保持稳定, 都以子囊菌门丰度最高, 这一结果与前人的研究结果一致[40, 44, 45].这可能是因为子囊菌门可以利用更多的资源, 更好地抵御环境压力从而来提高它们在土壤中的优势地位[46]; 而且子囊菌门是土壤中主要的分解者[47, 48], 能够分解土壤中木质素和角质素等难降解的有机质, 是养分循环和能量流动的主要驱动力[49].Hannula等[50]也认为, 随着时间的推移, 土壤真菌群落更加稳定, 很大一部分变化可以用植物种类以及它们是草还是杂草来解释; 植物群落和植物物种特异性效应驱动着土壤真菌群落.
任何环境因素的变化都可能在一定程度上改变土壤真菌群落结构, 掌握土壤真菌群落多样性的影响因素对促进农田生态系统的平衡和健康至关重要[6, 7, 11, 31]; 利用RDA分析农田土壤真菌群落信息, 可直观地展现出环境因素对该农田土壤真菌群落结构的影响.本研究中TOC、TP、AN和SWC是主导土壤真菌群落结构产生变化的主要因子.这与南丽丽等[18]报道黄土高原半干旱区轮作休耕下土壤真菌群落的主要影响因子为有机碳和pH等存在差异.休耕、秸秆还田和肥料投入影响了植物残体的分解过程, 改变了土壤有机碳的累积, 导致土壤真菌群落结构组成产生变化, 这与本研究基本一致; 但本研究中土壤pH的变化并不明显, 对土壤真菌群落的影响也不显著.有研究发现, 土壤养分在环境中存在的形态及含量可能影响真菌对碳、氮和磷的利用, 这也解释了为何不同形态的碳、氮和磷是土壤真菌多样性的关键限制因素[9, 51~53]; 同时, 也可能是本研究中碳氮磷形态产生差异的原因.另有研究表明, 土壤含水率是影响真菌群落的重要因素之一, 含水率的增加有利于微生物对养分的利用[34], 但含水率高, 又会导致土壤通气性差, 好氧真菌生长受到抑制[54], 可见不同的土壤真菌对含水率的反映不同[13].这与本研究结果, SWC是影响0~40 cm土层真菌群落变化的主要环境因子相一致.目前, 关于环境因子对土壤真菌群落的影响, 不同地域或不同学者得出的结论不同[9, 11~13, 18~22].因此, 不同轮作休耕农田土壤真菌群落结构特征对环境因子的响应有待深入研究.
3.2 轮作休耕农田土壤真菌功能分析真菌较细菌拥有更为复杂的生活与进化史, 在土壤中存在多种营养方式, 根据营养方式可将真菌分为病理营养型、腐生营养型和共生营养型这3种类型, 同时存在多种复合营养型.本研究结果发现, 冬小麦收获后的0~20 cm土层中, 冬休耕-夏玉米、冬小麦-夏休耕和冬小麦-夏玉米这3个种植过小麦或玉米的处理以腐生营养型为主, 其中冬休耕-夏玉米中相对丰度最高; 而长期休耕则以病理-腐生-共生营养型为主.出现这种不同的原因, 一方面可能是因为腐生营养型真菌可以分解植物残体和动物粪便等有机质, 使其能够被植物吸收利用[7, 55, 56], 而玉米和小麦秸秆的还田增加了有机质含量, 促使腐生营养型真菌相对丰度增加; 另一方面可能是因为不同处理使土壤理化性状发生变化, 导致土壤真菌营养类型发生改变.已有研究发现, 当土壤环境发生变化时, 部分真菌可以迅速改变自身的营养类型, 以对抗因环境变化带来的不利影响[56, 57].在20~40 cm土层中, 冬休耕-夏玉米、冬小麦-夏休耕和冬小麦-夏玉米这3个处理土壤真菌主要以腐生营养型和病理-腐生-共生营养型方式为主; 而长期休耕中病理营养型的真菌相对丰度最高.这可能是因为长期休耕农田以一年生草本植物为主, 其根系分布的深度和范围小于冬小麦, 使20~40 cm土层休耕土壤中的根系分泌物种类和含量降低, 导致土壤真菌功能营养方式的相对丰度产生变化; 而且本试验条件下, 冬休耕-夏玉米处理在20~40 cm土层中病理营养型的真菌相对丰度仅次于长期休耕处理.另外, 本研究的两个土层中仍分别有11.41%~25.66%和20.71%~29.72%的土壤真菌功能未被解析出来, 这可能是因为FUNGuild功能比对是基于已有文献和数据, 仅在一定程度上解析了真菌的功能[17], 一些OTU仍无法被解析到定义的功能群中, 复杂的土壤真菌群落功能仍有待深入研究.
4 结论冬小麦收获后, 不同轮作休耕土壤真菌群落门水平上的结构组成相似, 均以子囊菌门、担子菌门和被孢菌门为主, 但相对丰度各异; 连续2 a休耕使耕层土壤真菌群落丰富度和α多样性增加, 而冬小麦-夏休耕则使冬小麦收获后深层土壤真菌丰富度和α多样性增加; 相同处理内样本间β多样性相似性高, 不同处理间则存在差异; TOC、TP、AN和SWC是主导0~40 cm土层土壤真菌群落结构产生变化的主要因子.不同土层不同轮作休耕方式间土壤真菌群落营养类型的相对丰度不同, LF耕层土壤以病理-腐生-共生营养型真菌为主, 深层土壤中则以病理营养型真菌的相对丰度最高, 而种植过小麦或玉米的处理(冬休耕-夏玉米、冬小麦-夏休耕和冬小麦-夏玉米)在两个土层均是腐生营养型真菌的相对丰度最高.由此可见, 不同休耕方式改变了土壤真菌群落结构、多样性及营养类型, 连续2 a休耕增加了深层土壤病理营养型真菌的相对丰度, 但季节性休耕可用于调控集约化种植的农田土壤微生态环境, 促进农田土壤生态系统健康和谐, 推动黄河流域生态保护和高质量发展.
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