2022, Vol. 43
, WU Xue-jiao , LI Xiao-zhe , CHEN Zhao-jin , YAO Lun-guang , ZHANG Jun , PANG Fa-hu , HAN Hui
由于不合理的采矿和农业废弃物的随意处置等, 大量的镉(Cd)等重金属进入农田, 造成土壤重金属含量超标[1, 2].重金属在土壤中会随着土壤-植物系统进入到作物中, 再通过食物链积累到人体中, 严重威胁人类的健康[3~5].我国北方地区是小麦主产区, 近年来“镉麦”事件的不断曝光, 引起了全社会对小麦重金属超标问题的广泛担忧[6, 7].目前, 有效阻控作物富集土壤重金属的途径主要包括：低积累重金属品种的培育, 叶面阻控剂的喷施、原位钝化修复技术和农艺调控技术等[8~11].其中原位钝化是目前研究较多、效果较好的一种修复方法, 其核心思路就是通过钝化剂的施加, 使重金属固定在土壤中, 减少重金属的流动性, 进而阻控作物对重金属的吸收[12].重金属固定植物促生细菌是一类研究较多的具有固定重金属和阻控作物吸收重金属的微生物, 这类细菌吸附固定重金属的机制主要有细胞壁的表面吸附、胞内富集、胞外吸附螯合、生物沉淀和氧化还原等[13, 14].此外, 重金属固定植物促生细菌还能够产生铁载体、生长素和脱落酸等物质, 促进作物生长、提高作物抗逆性和改善土壤质量[15, 16], 这也是微生物钝化剂相比化学钝化剂具有的最大优势.
当植物受到环境胁迫时, 可诱导体内某些蛋白质的表达, 来抵抗外界的环境胁迫[17].功能微生物可以调节植物根系中的蛋白质表达, 以阻止重金属进入根系[18].蛋白质组学技术已经成为应用于研究植物生长、种子发育和抵抗胁迫机制的重要手段.Li等[19]研究表明重金属抗性植物促生细菌Pseudomonas sp. TLC 6-6.5-4的接种显著提高了玉米根系与植物发育和应激反应相关的蛋白质的表达, 降低了玉米对Cu的吸收.笔者实验室筛选到1株产多胺细菌Enterobacter bugandensis YX6, 能够分泌精胺和亚精胺、钝化固定Cd和阻控空心菜对Cd的吸收[20].然而, Cd胁迫下菌株YX6对小麦吸收Cd和根系蛋白质表达的影响还不清楚.因此, 本文通过水培试验研究了菌株YX6对小麦根系和叶片生长、Cd吸收和抗氧化酶活性以及Cd在小麦根系中亚细胞分布的影响, 利用非标记蛋白质组学分析了Cd胁迫下菌株YX6对小麦根系蛋白质表达的影响, 以期为阐明产多胺细菌消减小麦Cd吸收的分子机制和保障小麦安全生产提供理论依据和技术途径.
1 材料与方法 1.1 供试菌株和小麦菌株Enterobacter bugandensis YX6来自于南水北调中线水源区水安全协同创新中心实验室.郑麦7698(Triticum aestivum L.)购自于南阳市种子站, 为河南地区常规小麦品种.
1.2 小麦水培试验选取籽粒饱满的小麦种子若干, 先用无菌去离子水冲洗3次, 然后用5%乙醇溶液消毒3 min, 最后用无菌去离子水冲洗3次, 铺于湿纱布上, 28℃催芽24 h.小麦种子发芽后, 选择20粒大小相同的种子, 移栽到花盆中(直径15 cm, 高30 cm).花盆的上层装有1.0 kg石英砂, 下层含有1.8 L霍格兰营养液.水培试验共有4种处理：①未经Cd处理且未接种菌株YX6的小麦(CK); ②用3 mg·L-1 Cd处理的小麦(Cd); ③接种菌株YX6的小麦(YX6); ④含有3 mg·L-1 Cd并且接种菌株YX6的小麦(YX6+Cd).每个处理做3个重复.小麦幼苗培养14 d后, 添加Cd母液, 使培养液中的Cd浓度为3 mg·L-1, 同时接种菌株YX6.首先制备菌株YX6的细菌悬浮液(D600=108CFU·mL-1).采用浸根的方式进行接种, 即把小麦根放入到细菌菌悬液中, 浸泡2 h.为了让小麦持续地受到Cd胁迫, 每周更换营养液后会继续添加Cd母液, 使Cd初始浓度为3 mg·L-1.所有的植物都生长在温室中, 温室的室温保持在(25±2)℃.从第1次添加Cd开始算, 40 d后进行收获处理.
1.3 小麦样品收获和菌株YX6的定殖检测用剪刀把小麦的茎叶和根分开.为了去除吸附在小麦组织表面的Cd, 使用EDTA-2Na(0.01 mol·L-1)溶液浸泡样品10 min, 再用去离子水冲洗3遍.为了检测菌株YX6在小麦根上定殖的情况, 取部分新鲜小麦根研磨成糊状物, 进行梯度稀释, 涂于含有400 mg·L-1 Cd的产多胺筛选培养基[15], 28℃下培养3 d, 数出菌落数.在平板上随机挑取一定数量的菌落, 采用细菌DNA提取试剂盒提取各个菌株的DNA, 然后使用通用引物27F(5′-AGAGTTT GATCCTGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTT GTTACGACTT-3′)进行16S rRNA基因扩增, 扩增产物送到上海生工进行测序, 得到每个菌株的种属信息.选取一定量的小麦根和叶, 用电子秤测量鲜重和干重.称取烘干后的植物样品0.200 g, 粉碎机粉碎后放到聚乙烯坩埚中, 加入3 mL的盐酸和9 mL的硝酸, 在通风橱中加盖浸泡过夜.第2 d放在电热板上, 120℃低温加热, 使样品初步分解, 4 h后打开盖子, 升温至160℃进行消解和赶酸, 直至内容物为透明黏稠状为止.若消解不彻底, 再加入3 mL硝酸和1 mL盐酸, 重复上述消解过程.最后用去离子水进行定容, 过0.22 μm滤膜后进行Cd含量测定.使用电感耦合等离子体发射光谱仪(Inductively coupled plasma atomic emission spectrometry, ICP-AES)测定小麦叶和根的Cd含量.同时采用国家标准参比物质(植物：GBW-08501)进行质量控制, 标样测定结果均在允许误差范围内, 回收率在97.3%~98.9%.用抗氧化酶试剂盒测定新鲜小麦根和叶的超氧化物歧化酶(SOD)活性和过氧化物酶(POD)活性.
1.4 小麦样品中多胺含量的测定将2 g新鲜小麦根或叶加到含有60 mL 80%甲醇溶液中, 用研磨棒研磨成匀浆, 4℃下振动24 h, 并过滤.滤液在旋转蒸发干燥器中蒸发至原始体积的一半, 然后添加10 mL石油醚并均匀混合样品, 去除甲醇溶液并浓缩以获得水溶液.通过高效液相色谱法测定小麦叶或根中的精胺和亚精胺的含量[21].
1.5 小麦根中Cd的亚细胞分布测定参考Wu等[22]的方法测定不同处理下小麦根中Cd的亚细胞分布.将0.5 g在液氮中冷冻的小麦根添加到含有154 mg·L-1二硫代三糖醇、0.05 mol·L-1 Tris-HCl(pH 7.5)和85.5 mg·L-1的20 mL蔗糖溶液中, 研磨成匀浆.然后, 匀浆通过尼龙布(80 μm)过滤, 尼龙布上的残留物被认为是细胞壁部分; 滤液在5 000 g下离心10 min, 离心管底部的颗粒被指定为细胞器部分; 而上清液被指定为可溶性部分.采用ICP-AES测定各个组分的Cd含量.
1.6 非标记蛋白质组学将2.0 g小麦根在液氮中磨成细粉, 然后在含有2.5% SDS和100 mmol·L-1 Tris-HCl(pH 8.0)的裂解缓冲液中超声处理15 min, 12 000 g下离心15 min.加入2倍体积的丙酮溶液, 沉淀上清液中的蛋白质, 然后将其溶解在8 mol·L-1尿素和100 mmol·L-1 Tris-HCl(pH 8.0)的缓冲液中.12 000 g下离心15 min, 加入10 mmol·L-1 DTT, 37℃反应1 h.然后进行烷基化反应(40 mmol·L-1碘乙酰胺, 25℃下黑暗处理30 min).以1∶50的比例添加胰蛋白酶(酶∶蛋白质, 质量比), 并在37℃下过夜消化混合物.次日, 用TFA将pH降至6.0以结束消化, 然后12 000 g离心15 min, 使用Sep-Pak C18脱盐柱对上清液进行多肽纯化, 洗脱液真空干燥并储存在-20℃备用.数据采集在配备纳米喷雾源的混合四极TOF LC-MS/MS质谱仪(TripleTOF 5600, SCIEX)上进行.将约2 μg肽溶解在MS加载缓冲液(0.1%甲酸)中, 通过自动进样器加载到C18柱上(5 μm, 5×0.3 mm, Agilent Technologies), 然后洗脱到C18分析柱(75 μm×150 mm, 3 μm particle size, 10 nm pore size, Eksigent)中.使用流动相A(3% DMSO, 97% H2O, 0.1%甲酸)和流动相B(3% DMSO, 97% ACN, 0.1%甲酸)建立100 min的梯度.恒定流速设置为300 nL·min-1.使用2.3 kV的喷雾电压、20 PSI的幕气和150℃的界面加热器温度获取数据.使用MaxQuant软件(V1.6.2.10)和Andromeda数据库对来自TripleTOF 5600的原始数据进行分析.使用默认参数对照UniProt Triticum aestivum蛋白质数据库搜索光谱文件.使用无标签量化模式, 最小比率计数设置为1, 并检查运行间匹配功能.在蛋白质和肽水平上用1%的FDR筛选搜索结果.基于具有相同或相似氨基酸序列的蛋白质共享相似功能的原理, 使用BLASTed算法针对NR数据库中指定的分类单元ID对从蛋白质组分析中获得的蛋白质序列进行分析.
1.7 荧光定量PCR验证选取茉莉酸生物合成相关酶基因(OPR, OPR-F：5′-ACAGGGAGGAAGGGAAC AAGG-3′, OPR-R：5′-TTGGGCAGGTCAGGGTTAGC-3′)和谷胱甘肽S-转移酶(tauGST, GST-F：5′- AAGAGATTGTCGGTG TCAGTTTGG -3′, GST-R：5′-CGGCGTGTCCTGTTTA GAGAATAG-3′)进行验证上述蛋白质组学的结果.使用TransZol植物试剂(TransGen Biotech)提取小麦根的RNA, 并使用带有gDNA擦除器(TaKaRa)的PrimeScriptTM RT试剂盒进行反转录[23].
1.8 数据处理采用SPSS 17.0软件进行数据统计分析, 用Microsoft Excel 2010进行绘图.
2 结果与分析 2.1 菌株YX6在小麦根的定殖检测结合平板梯度稀释法和16S rRNA测序来检测菌株YX6在小麦根表面的定殖情况. 由表 1可知, CK和Cd处理组中肠杆菌属菌株的数量都在100 CFU·g-1以下, 而YX6和YX6+Cd处理组中肠杆菌属菌株的数量都在35 000 CFU·g-1以上. 这表明菌株YX6能够在小麦根表面大量地定殖.
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表 1 菌株YX6在小麦根表面的定殖数量1)/CFU·g-1 Table 1 Number of strain YX6 colonizing the wheat root surface/CFU·g-1 |
2.2 不同处理对小麦干重的影响
图 1显示了Cd、YX6和YX6+Cd处理对小麦生长的影响.对照处理组中小麦根的干重为9.14 g·pot-1, 小麦茎叶的干重为13.83 g·pot-1.与对照相比, Cd处理抑制了小麦的生长, 显著降低了小麦根(19.81%)和叶片(38.15%)的干重.菌株YX6显著提高了小麦根(48.36%)和叶片(50.01%)的干重.菌株YX6+Cd则显著提高了小麦根(14.44%)和叶片(13.08%)的干重.此外, 与Cd处理相比, YX6+Cd处理显著增加了小麦根系(42.71%)和叶片(82.83%)的干重, 表明菌株YX6在Cd胁迫下仍能促进小麦生长.
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同一小麦组织不同小写字母表示处理之间有显著差异(P<0.05) 图 1 不同处理对小麦各组织干重的影响 Fig. 1 Effects of different treatments on the dry weight of wheat roots and leaves |
在未添加Cd的处理下, CK处理组中小麦根的ω(Cd)为0.04 mg·kg-1, YX6处理组中小麦根的ω(Cd)为0.03 mg·kg-1, Cd含量均非常低.而在小麦叶中未检测到Cd含量.在3 mg·L-1Cd胁迫下, 小麦根和叶中ω(Cd)分别为2.43 mg·kg-1和1.14 mg·kg-1, 而菌株YX6的接种则显著降低了小麦根(48.56%)和叶(61.41%)中的Cd含量(表 2), 说明水培条件下菌株YX6具有阻控小麦对Cd吸收的能力.此外, 与无菌株的对照相比, 菌株YX6显著降低了小麦根(26.59%)和叶片(29.43%)吸收的Cd总量.
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表 2 不同处理对小麦Cd吸收的影响1) Table 2 Effects of different treatments on Cd uptake by wheat |
2.4 不同处理对小麦根和叶抗氧化酶活性的影响
植物中的抗氧化酶是抵抗外界胁迫的重要物质, 能够保护植物组织在逆境胁迫下正常生长.选取SOD和POD作为代表探究菌株YX6的接种对小麦根部抗氧化酶活性的影响, 结果如图 2所示.对照组小麦根的SOD酶活为364 U·g-1, POD的酶活为7.22 U·g-1, Cd的添加则显著提高了小麦根SOD(47.80%)和POD的酶活(144%), 表明小麦根在遭受到Cd胁迫时, 会进行自我调节, 提高SOD和POD的活性.而菌株YX6的接种对小麦根SOD和POD的酶活无显著影响.与单独Cd胁迫相比, Cd胁迫下接种菌株YX6显著降低了SOD(19.15%)和POD(32.96%)的酶活, 表明菌株YX6的接种降低了Cd对小麦造成的压力, 缓解了Cd毒害, 从而使小麦无需再额外表达过量的抗氧化酶.同样的对于小麦叶来说, 与CK处理相比, Cd的添加则显著提高了SOD(59.15%)和POD(79.59%)的酶活.而与单独Cd胁迫相比, Cd胁迫下菌株YX6的接种显著降低了SOD(26.74%)和POD(25.01%)的酶活.
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同一小麦组织不同小写字母表示处理之间有显著差异(P<0. 05) 图 2 不同处理对小麦SOD和POD酶活的影响 Fig. 2 Effects of different treatments on SOD and POD activities in wheat |
菌株YX6具有分泌精胺和亚精胺的能力, 因此会对小麦根和叶内多胺(腐胺+精胺+亚精胺)的含量造成一定的影响.由图 3可知, 对照组小麦根的ω(多胺)为38.42 mg·kg-1, 叶的ω(多胺)为18.38 mg·kg-1.Cd的添加对小麦根和叶的多胺含量无显著影响, 而菌株YX6的接种则显著提高了小麦根(104%)和叶(169%)多胺的含量.此外, 与单独接种YX6相比, Cd胁迫下, 菌株YX6的接种也显著提高了小麦根(32.01%)和叶(35.27%)多胺的含量.多胺既是一种促生物质, 可以促进小麦的生长, 也是一种抗氧化物质, 可缓解Cd对小麦的毒害.菌株YX6通过分泌多胺, 促进了小麦的生长, 提高了小麦抗Cd的能力.
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同一小麦组织不同小写字母表示处理之间有显著差异(P<0.05) 图 3 不同处理中小麦组织多胺含量 Fig. 3 Polyamine content of wheat tissue in different treatments |
YX6和YX6+Cd处理对Cd在小麦根系不同组织(细胞壁、细胞器和可溶性部分)中分布的影响如图 4所示.在3 mg·L-1 Cd胁迫下, 小麦根细胞壁、细胞器和可溶性部分Cd的比例分别为26.63%、51.64%和22.45%.而与单独Cd处理相比, 菌株YX6的接种显著降低了小麦根细胞器(20.04%)和可溶性部分(39.33%)中Cd的比例, 显著增加了小麦根系细胞壁(69.92%)中Cd的比例.这说明菌株YX6能增加Cd在小麦根细胞壁中的积累, 从而抑制Cd从根外向根内的转运.此外, 菌株YX6在根系表面吸附了大量的Cd, 从而进一步阻止了其他Cd进入根内.
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不同小写字母表示处理之间有显著差异(P<0.05) 图 4 Cd在小麦根中亚细胞的分布比例 Fig. 4 Distribution proportion of Cd at the subcellular level in wheat roots |
采用无标记蛋白质组学方法鉴定了不同处理下的小麦根的蛋白质表达情况, 并鉴定筛选了一些差异表达蛋白(differentially expressed proteins, DEPs).分析共分为3组：A组, Cd处理组/对照组(Cd/CK); B组, 菌株YX6+Cd处理组/对照组(YX6+Cd/CK); C组, 菌株YX6+Cd处理组/Cd处理组(YX6+Cd/Cd), 结果如图 5所示.A、B和C组中分别有132、165和112个DEPs.在A组中, 87个DEPs被上调表达, 45个DEPs被下调表达.在B组中, 102个DEPs被上调表达, 63个DEPs被下调表达.在C组中, 72个DEPs被上调表达, 40个DEPs被下调表达.对这些DEPs进行功能注释(Gene ontology functional annotation, GO), 所有DEPs的功能共分为三类：生物过程(biological processes)、细胞成分(cellular components)和分子功能(molecular functions)(图 5).在生物过程中, A、B和C组的DEPs主要参与细胞过程、刺激反应和生物调节.其中, 重点是对外界胁迫的差异蛋白, 主要涉及氧化还原酶活性蛋白、谷胱甘肽S-转移酶活性蛋白和金属硫蛋白(具有重金属结合活性的4B蛋白)等被上调表达.在细胞成分中, A、B和C组的DEPs主要参与细胞部分、细胞器、细胞器部件和含蛋白质复合物和膜部分.在分子功能方面, A、B和C组的DEPs主要参与抗氧化活性、催化活性、结合锚定和转运活性.
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图 5 不同处理下的小麦根差异表达蛋白 Fig. 5 Differentially expressed proteins in wheat roots under different treatments |
基于所有已鉴定蛋白质的背景, 在https://www.uniprot.org/上输入每个DEPs的登录号, 进行查找每个DEPs的功能, 同时对其Go富集条目进行分析, 找出P < 0.05的富集条目, 结果如表 3所示.对A组(Cd/CK)的DEPs进行差异条目富集分析, P < 0.05条件下共有3个显著富集条目, 主要包括外封装结构(external encapsulating structure)、过氧化物酶活性(peroxidase activity)和氧化还原酶活性(oxidoreductase activity).通过查询这些DEPs的分子功能, 主要涉及清除H2O2和应对环境胁迫, 如氧化应激、FMN结合、氧化还原酶活性、过氧化物酶活性、电子转移活性、铁硫簇结合.这一结果表明, Cd胁迫会刺激小麦根产生更多的抗氧化酶等, 增强小麦抗Cd胁迫的能力.对B组(YX6+Cd/CK)的DEPs进行差异条目富集分析, P < 0.05条件下共有3个显著富集条目, 主要包括蛋白质-DNA复合物(protein-DNA complex)、DNA包装复合物(DNA packaging complex)和转移酶活性(transferase activity).这些DEPs的功能主要与DNA结合、蛋白质异源二聚体活性、ATP结合、转移酶活性和金属离子结合有关.结果表明, 与空白对照相比, Cd胁迫下, 菌株YX6保护了小麦根系的DNA免受损伤, 提高了DNA复制和蛋白质翻译水平, 从而提高了小麦根系的活力.对C组(YX6+Cd/Cd)的DEPs进行差异条目富集分析, P < 0.05条件下共有5个显著富集条目, 分别为蛋白质-DNA复合物、DNA包装复合物、细胞间转运(intercellular transport)、过氧化物酶活性和转移酶活性.这说明在Cd胁迫下, 菌株YX6增加了小麦根系中DNA修复、抗氧化酶相关蛋白的表达, 从而提高了小麦对Cd的抗性和耐受性.
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表 3 小麦根的差异蛋白的显著性富集条目分析1) Table 3 Analysis of significant enrichment items of DEPs in wheat roots |
2.9 差异蛋白的代谢通路分析
对差异蛋白进行代谢通路(Kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)富集分析, 筛选P < 0.05的富集代谢条目, 结果如表 4所示.A组有4条显著富集的代谢途径：矿物质吸收、次生代谢物的生物合成、谷胱甘肽代谢和糖酵解/糖异生.这说明小麦根通过谷胱甘肽会上调表达, 以此应对Cd的胁迫.同时也会消耗更多的能量, 来抵抗Cd的胁迫.B组有3条显著富集的代谢途径：α-亚麻酸代谢、细胞色素P450对外源性物质的代谢和植物激素信号转导.C组有5条显著富集的代谢途径：次生代谢物的生物合成、苯丙烷生物合成、α-亚麻酸代谢、植物激素信号转导和谷胱甘肽代谢.值得注意的是, 在含有菌株YX6的处理组中, 均有α-亚麻酸代谢和植物激素信号转导途径, 而这两条途径均与缓解小麦Cd胁迫密切相关.Cd胁迫下, 菌株YX6增加了12-氧代二烯酸还原酶和4-香豆酸辅酶A连接酶4的表达量, 这两种酶分别催化12-氧代二烯酸转化为OPC8和OPC8辅酶A, 表明菌株YX6可使小麦根系合成更多的茉莉酸.此外, 在Cd胁迫下, 菌株YX6还上调表达了ABA转运蛋白合成基因PYP/PYL 1.78倍.这些结果表明, 菌株YX6提高了小麦根系的激素水平, 增强了小麦根系对Cd的抗性.
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表 4 各个处理组差异蛋白的代谢通路分析的显著富集条目1) Table 4 Significantly enriched pathways of the DEPs based on KEGG analysis in each treatment |
2.10 荧光定量PCR验证
采用荧光定量PCR技术, 选择OPR和tauGST两个基因的表达量验证蛋白质组学的准确性.结果表明, YX6+Cd处理组的OPR基因表达水平比Cd治疗组高1.79倍, YX6+Cd处理组的tauGST基因表达水平比Cd治疗组高0.74倍.而在蛋白质组学中, 与对照相比, YX6+Cd处理组中茉莉酸生物合成相关酶和谷胱甘肽S-转移酶的表达量也分别上调表达1.21倍和0.58倍.总的来说, 基因和蛋白质表达的趋势是相似的.
3 讨论 3.1 多胺促进小麦生长和消减小麦Cd吸收水培试验结果表明, 小麦根和叶片在含有3 mg·L-1Cd的溶液中吸收了大量Cd, 而产多胺细菌YX6的接种可以降低小麦根和叶片中Cd的含量, 表明菌株YX6可以作为重金属钝化剂, 阻控小麦对Cd的吸收, 确保Cd污染条件下小麦的安全生产.作为一种优良的重金属钝化剂, 重金属固定植物促生细菌已被证明能抑制小麦和水稻等作物对重金属的吸收[24~26].有研究分离到1株Cd抗性菌株Pseudomonas sp. B7, 在溶液中吸附去除Cd的效率达到了100%, 且具有阻控大白菜吸收Cd的能力[27].Cd在小麦根中的分布表明, 菌株YX6在小麦根表面吸收了大量的Cd, 并诱导Cd在根的细胞表面积累, 从而阻止了Cd向根内的转运.多胺是一类具有较强生物活性的小分子脂肪族含氮碱, 可以作为“第二信使”, 参与植物胁迫的信号调控, 从而缓解逆境胁迫对植物的伤害[28, 29].YX6和YX6+Cd处理下的小麦各组织多胺含量高于对照组和Cd处理组的, 表明菌株YX6的接种能够提高小麦组织中多胺的含量, 以应对Cd胁迫, 主要是因为菌株YX6能够分泌亚精胺和精胺, 因此小麦吸收了更多的外源亚精胺和精胺.Soudek等[30]研究表明外源多胺可以增强作物对重金属的抗性.Alzahrani等[31]的研究也表明外源喷施腐胺、亚精胺和精胺, 能够提高小麦对Cd的抗性和抑制小麦对Cd的吸收.产多胺细菌分泌的多胺能够被小麦吸收, 因此提高了小麦根和叶中多胺的含量.但蛋白质组学数据中没有多胺代谢相关蛋白的变化, 主要是由于小麦吸收的外源多胺直接参与调控了小麦根系蛋白质的表达(如上调DNA修复和激素表达相关蛋白), 可能没有涉及小麦自身多胺的合成变化, 所以小麦自身多胺合成代谢相关的蛋白的表达没有变化.此外, 其他研究也表明多胺可以通过多种途径缓解植物重金属毒害：①作为抗氧化物质或者增强抗氧化系统缓解重金属诱导的氧化胁迫.例如, 多胺本身可以作为抗氧化物质清除活性氧降低Cd和Cu对小麦的氧化损伤[32]; ②减少植物体内金属离子的积累.例如, 外源精胺和亚精胺可以减少Cd吸收积累而缓解水稻Cd胁迫损伤[33]; ③多胺还可以与油菜素内酯互作调控植物激素代谢以及与抗性相关的基因表达, 提高萝卜对Cu胁迫的耐性[34].此外, 本研究发现Cd胁迫下, 导致小麦根的SOD、POD酶活比CK处理显著提高, 而菌株YX6处理组小麦根的SOD和POD酶活与CK处理组小麦根的SOD和POD酶活相比无显著差异, 主要是因为小麦根在遭受到Cd胁迫时, 会进行自我调节, 提高自身SOD和POD的活性, 进而抵抗外源Cd的胁迫.而YX6细菌处理后, 由于YX6一方面会阻控Cd进入到小麦根内, 降低了小麦受到Cd的毒害.另一方面YX6能够分泌多胺, 植物吸收了外源的多胺后, 也能够抵抗Cd的胁迫.此时也就不再需要小麦自身SOD和POD活性的提高.
3.2 Cd胁迫下产多胺细菌调控小麦根与DNA修复和激素产生的相关蛋白的表达非标定蛋白质组学显示Cd胁迫下菌株YX6提高了小麦根中与DNA复制和植物激素产生相关的蛋白质的表达, 增强了小麦根系对Cd的抗性, KEGG代谢途径分析表明, 谷胱甘肽代谢、α-亚麻酸代谢和植物激素信号转导显著丰富.在重金属胁迫下, 植物中活性氧物种(O2-、·O2-、·OH和H2O2)的代谢平衡被破坏, 导致活性氧的过度积累[35, 36].活性氧的积累会损害植物的DNA, 主要表现为碱基变化、碱基错配、插入或缺失、嘧啶组合、DNA加合物、DNA链断裂和甲基化损伤[37].植物细胞受到Cd和Pb胁迫时, DNA复制、蛋白质翻译和错误折叠易发生, 导致错误折叠的蛋白质占据空间并浪费资源, 严重影响植物的正常生理生化过程.在菌株YX6存在下, 小麦根系中的蛋白质DNA复合物和DNA包装复合物显著富集.这表明菌株YX6通过调节DNA修复来抑制小麦对Cd的吸收.在这些胁迫下, 植物细胞改变其过程以避免DNA损伤, 错误折叠的蛋白质必须被植物降解和运输.因此, 与单独Cd处理相比, 菌株YX6保护了小麦根系的DNA免受损伤, 改善了DNA复制和蛋白质翻译, 提高了小麦根系的活力和抵御Cd胁迫的能力.
α-亚麻酸经过脂氧合酶途径可以生成茉莉酸和茉莉酸甲酯.作为信号传导物质, 茉莉酸和茉莉酸甲酯参与植物的重金属和低温等逆境的抗逆反应[38].在植物应对重金属胁迫时, 茉莉酸和茉莉酸甲酯通过提高抗氧化酶的活性和光合作用来促进作物生长.茉莉酸和茉莉酸甲酯也可以增加还原型谷胱甘肽和抗坏血酸来缓解植物的重金属胁迫.有研究指出, 外源茉莉酸甲酯可以诱导植物细胞防卫基因的表达, 缓解重金属对植物的损害[39].陈俊[40]以秋茄幼苗为研究对象, 对Cd胁迫下的秋茄幼苗使用茉莉酸甲酯并分时间段采样, 测量叶绿素含量、丙二醛和抗氧化物质含量等指标, 结果显示茉莉酸甲酯可以有效缓解Cd对秋茄生长的抑制.Chen等[41]研究发现施加10 μmol·L-1茉莉酸甲酯和100 μmol·L-1茉莉酸, 可以有效降低植物组织内金属硫蛋白的表达, 减少重金属向地上部位的运输, 从而有效地缓解重金属的毒害作用.Cd胁迫下, 菌株YX6使小麦根内催化OPC8转化为OPC8-CoA的4-coumarate-CoA ligase-like 4显著上调了1.76倍, 说明菌株YX6的接种促使小麦根生成更多的茉莉酸, 进而缓解了Cd的胁迫.脱落酸(ABA)能够提高植物的抗逆性的作用早已引起人们的关注.ABA在植物体内属于含量少但作用巨大的一种激素, 逆境胁迫时, ABA浓度会升高并诱导植物体代谢过程发生变化, 起到抵抗逆境的作用[42].在本研究中, 菌株YX6能够使ABA转运基因PYP/PYL的表达显著上调1.68倍, 提高了小麦对Cd的抗性.Hsu等[43]研究发现Cd胁迫下, 与Cd敏感品种水稻相比, 耐Cd水稻根部中ABA的含量显著増加, 说明ABA在植物耐Cd胁迫中发挥一定作用.ABA可以通过调控植物的抗氧化系统来抵抗Cd的胁迫.Li等[44]指出绿豆在Cd处理下其体内的GSH的含量显著下降, 但是添加ABA之后, 绿豆体内的GSH含量能够显著提高.说明ABA能够调控Cd胁迫下由ROS积累引起的氧化应激.此外ABA也可通过调控植物整合肽的合成和调节维持植物水分平衡, 从而帮助植物适应Cd胁迫[45, 46].
4 结论(1) 水培试验表明与单独Cd处理相比, Cd胁迫下产多胺细菌Enterobacter bugandensis YX6的接种显著提高了小麦根和叶片中多胺的含量, 降低了小麦根和叶中Cd的含量.
(2) 与单独Cd处理相比, YX6+Cd处理显著降低了小麦根细胞器中和可溶性部分中Cd的比例, 增加了小麦根系细胞壁中Cd的比例.
(3) 在Cd胁迫下, 菌株YX6的接种提高了小麦根系中与DNA修复和激素(脱落酸和茉莉酸)合成相关蛋白的表达, 进而提高了小麦对Cd的抗性和耐受性.
| [1] |
崔祥芬, 张琴, 田森林, 等. 中国稻田土壤镉污染及务农性暴露概率风险[J]. 中国环境科学, 2021, 41(8): 3878-3886. Cui X F, Zhang Q, Tian S L, et al. Status of paddy soil Cd pollution and probabilistic health risk via agricultural contact in China[J]. China Environmental Science, 2021, 41(8): 3878-3886. |
| [2] |
彭瑜, 王海娟, 王宏镔. 农田土壤砷、镉协同钝化修复的研究进展[J]. 土壤, 2021, 53(4): 692-699. Peng Y, Wang H J, Wang H B. Advances in synergistic passivation remediation of arsenic and cadmium in farmland soil[J]. Soils, 2021, 53(4): 692-699. |
| [3] | Ren S Y, Song C Q, Ye S J, et al. The spatiotemporal variation in heavy metals in China's farmland soil over the past 20 years: a meta-analysis[J]. Science of the Total Environment, 2022, 806. DOI:10.1016/j.scitotenv.2021.150322 |
| [4] |
孟晓飞, 郭俊娒, 杨俊兴, 等. 河南省典型工业区周边农田土壤重金属分布特征及风险评价[J]. 环境科学, 2021, 42(2): 900-908. Meng X F, Guo J M, Li R H, et al. Spatial distribution and risk assessment of heavy metal pollution in farmland soils surrounding a typical industrial area of Henan province[J]. Environmental Science, 2021, 42(2): 900-908. |
| [5] |
秦宁, 阿依博塔·吐尔逊别克, 刘运炜, 等. 中国居民饮用水镉暴露非致癌风险的年龄分层权重[J]. 环境科学, 2022, 43(4): 1863-1872. Qin N, Ayibota T, Liu Y W, et al. Non-carcinogenic risk assessment of cadmium exposure through drinking water in Chinese residents based on age-stratification weight[J]. Environmental Science, 2022, 43(4): 1863-1872. |
| [6] |
管伟豆, 肖然, 李荣华, 等. 土壤镉污染北方小麦生产阈值及产区划分初探[J]. 农业环境科学学报, 2021, 40(5): 969-977. Guan W D, Xiao R, Li R H, et al. Investigations on the derivation of a safe wheat-producing threshold of soil Cd content and classification of Cd contaminated wheat-producing areas in northern China[J]. Journal of Agro-Environment Science, 2021, 40(5): 969-977. |
| [7] | Wang Y L, Xing W Q, Liang, X F, et al. Effects of exogenous additives on wheat Cd accumulation, soil Cd availability and physicochemical properties in Cd-contaminated agricultural soils: a meta-analysis[J]. Science of the Total Environment, 2022, 808. DOI:10.1016/j.scitotenv.2021.152090 |
| [8] |
任超, 任彧仲, 王浩, 等. 镉胁迫下不同小麦品种对镉的积累特性[J]. 环境科学, 2022, 43(3): 1606-1619. Ren C, Ren Y Z, Wang H, et al. Cadmium accumulation characteristics of different heat varieties under cadmium stress[J]. Environmental Science, 2022, 43(3): 1606-1619. |
| [9] |
赵娜娜, 彭鸥, 刘玉玲, 等. 不同形态硫叶面喷施对水稻镉积累影响[J]. 农业环境科学学报, 2021, 40(7): 1387-1401. Zhao N N, Peng O, Liu Y L, et al. Effect of foliar spraying different forms of sulfur on cadmium accumulation in rice[J]. Journal of Agro-Environment Science, 2021, 40(7): 1387-1401. |
| [10] | Haider F U, Wang X K, Farooq M, et al. Biochar application for the remediation of trace metals in contaminated soils: implications for stress tolerance and crop production[J]. Ecotoxicology and Environmental Safety, 2022, 230. DOI:10.1016/j.ecoenv.2022.113165 |
| [11] |
张雅荟, 刘月敏, 王常荣, 等. 伯克氏菌Y4对水稻幼苗镉损伤和镉吸收的影响[J]. 环境科学, 2022, 43(4): 2142-2150. Zhang Y H, Liu Y M, Wang C R, et al. Effects of Burkholderia sp. Y4 on cadmium damage and uptake in rice seedlings[J]. Environmental Science, 2022, 43(4): 2142-2150. |
| [12] |
杨忠蓝, 曾希柏, 孙本华, 等. 铁氧化物固定土壤重金属的研究进展[J]. 土壤通报, 2021, 52(3): 728-735. Yang Z L, Zeng X B, Sun B H, et al. Research advances on the fixation of soil heavy metals by iron oxide[J]. Chinese Journal of Soil Science, 2021, 52(3): 728-735. |
| [13] |
韩辉, 王晓宇, 蔡红, 等. 重金属固定植物促生细菌的筛选及其阻控小麦富集重金属效应[J]. 环境科学, 2019, 40(7): 3339-3346. Han H, Wang X Y, Cai H, et al. Isolation of heavy metal immobilizing and plant growth-promoting bacteria and its effects on reducing heavy metal accumulation in wheat[J]. Environmental Science, 2019, 40(7): 3339-3346. |
| [14] | Qiao S Y, Zeng G Q, Wang X T, et al. Multiple heavy metals immobilization based on microbially induced carbonate precipitation by ureolytic bacteria and the precipitation patterns exploration[J]. Chemosphere, 2021, 274. DOI:10.1016/j.chemosphere.2021.129661 |
| [15] | Wang Y, Li Z H, Wu J J, et al. Abscisic acid-catabolizing bacteria: a useful tool for enhancing phytoremediation[J]. Science of the Total Environment, 2022, 812. DOI:10.1016/j.scitotenv.2021.151474 |
| [16] | Tirry N, Tahri Joutey N, Sayel H, et al. Screening of plant growth promoting traits in heavy metals resistant bacteria: prospects in phytoremediation[J]. Journal of Genetic Engineering and Biotechnology, 2018, 16(2): 613-619. |
| [17] | Chakdar H, Thapa S, Srivastava A, et al. Genomic and proteomic insights into the heavy metal bioremediation by cyanobacteria[J]. Journal of Hazardous Materials, 2022, 424. DOI:10.1016/j.jhazmat.2021.127609 |
| [18] | Zhang W H, He L Y, Wang Q, et al. Inoculation with endophytic Bacillus megaterium 1Y31 increases Mn accumulation and induces the growth and energy metabolism-related differentially-expressed proteome in Mn hyperaccumulator hybrid pennisetum[J]. Journal of Hazardous Materials, 2015, 300: 513-521. |
| [19] | Li K F, Pidatala V R, Shaik R, et al. Integrated metabolomic and proteomic approaches dissect the effect of metal-resistant bacteria on maize biomass and copper uptake[J]. Environmental Science & Technology, 2014, 48(2): 1184-1193. |
| [20] |
韩辉, 蔡红, 王晓宇, 等. 产多胺细菌阻控空心菜富集Cd和Pb效应[J]. 中国环境科学, 2020, 40(6): 2692-2699. Han H, Cai H, Wang X Y, et al. Screening of polyamine-producing bacteria and their effects on reducing Cd and Pb accumulation in Ipomoea aquatica[J]. China Environmental Science, 2020, 40(6): 2692-2699. |
| [21] |
林绍艳, 张芳, 徐颖洁. 植物中多胺含量超高效液相色谱法的建立[J]. 南京农业大学学报, 2016, 39(3): 358-365. Lin S Y, Zhang F, Xu Y G. The establishment of UPLC method for measuring polyamines content in plants[J]. Journal of Nanjing Agricultural University, 2016, 39(3): 358-365. |
| [22] | Wu Z P, McGrouther K, Chen D L, et al. Subcellular distribution of metals within Brassica chinensis L. in response to elevated lead and chromium stress[J]. Journal of Agricultural & Food Chemistry, 2013, 61(20): 4715-4722. |
| [23] | Fisher K A, Yarwood S A, James B R. Soil urease activity and bacterial ureC gene copy numbers: effect of pH[J]. Geoderma, 2017, 285: 1-8. |
| [24] | Pramanik K, Mandal S, Banerjee S, et al. Unraveling the heavy metal resistance and biocontrol potential of Pseudomonas sp. K32 strain facilitating rice seedling growth under Cd stress[J]. Chemosphere, 2021, 274. DOI:10.1016/j.chemosphere.2021.129819 |
| [25] | Sharma P, Chaturvedi P, Chandra R, et al. Identification of heavy metals tolerant Brevundimonas sp. from rhizospheric zone of Saccharum munja L. and their efficacy in in-situ phytoremediation[J]. Chemosphere, 2022, 295. DOI:10.1016/j.chemosphere.2022.133823 |
| [26] |
马莹, 王玥, 石孝均, 等. 植物促生菌在重金属生物修复中的作用机制及应用[J]. 环境科学, 2022, 43(9): 4911-4922. Ma Y, Wang Y, Shi X J, et al. Mechanism and application of plant growth-promoting bacteria in heavy metal bioremediation[J]. Environmental Science, 2022, 43(9): 4911-4922. |
| [27] | Wu S J, Zhou Z J, Zhu L, et al. Cd immobilization mechanisms in a Pseudomonas strain and its application in soil Cd remediation[J]. Journal of Hazardous Materials, 2022, 425. DOI:10.1016/j.jhazmat.2021.127919 |
| [28] | Yang K X, Xi Z A, Zhang Y X, et al. Polyamine biosynthesis and distribution in different tissues of Agaricus bisporus during postharvest storage[J]. Scientia Horticulturae, 2020, 270. DOI:10.1016/j.scienta.2020.109457 |
| [29] |
张灵, 陶亚军, 方琳, 等. 植物多胺的代谢与生理研究进展[J]. 植物生理学报, 2020, 56(10): 2029-2039. Zhang L, Tao Y J, Fang L, et al. Metabolism and physiological function of polyamine in plants[J]. Plant Physiology Journal, 2020, 56(10): 2029-2039. |
| [30] | Soudek P, Ursu M, Petrová Š, et al. Improving crop tolerance to heavy metal stress by polyamine application[J]. Food Chemistry, 2016, 213: 223-229. |
| [31] | Alzahrani Y, Rady M M. Compared to antioxidants and polyamines, the role of maize grain-derived organic biostimulants in improving cadmium tolerance in wheat plants[J]. Ecotoxicology and Environmental Safety, 2019, 182. DOI:10.1016/j.ecoenv.2019.109378 |
| [32] | Hsu Y T, Kao C H. Cadmium-induced oxidative damage in rice leaves is reduced by polyamines[J]. Plant and Soil, 2007, 291(1-2): 27-37. |
| [33] | Groppa M D, Tomaro M L, Benavides M P. Polyamines and heavy metal stress: the antioxidant behavior of spermine in cadmium- and copper-treated wheat leaves[J]. BioMetals, 2007, 20(2): 185-195. |
| [34] | Choudhary S P, Bhardwaj R, Gupta B D, et al. Epibrassinolide induces changes in indole-3-acetic acid, abscisic acid and polyamine concentrations and enhances antioxidant potential of radish seedlings under copper stress[J]. Physiologia Plantarum, 2010, 140(3): 280-296. |
| [35] |
王若男, 乜兰春, 张双双, 等. 植物抗重金属胁迫研究进展[J]. 园艺学报, 2019, 46(1): 157-170. Wang R N, Nie L C, Zhang S S, et al. Research progress on plant resistance to heavy metal stress[J]. Acta Horticulturae Sinica, 2019, 46(1): 157-170. |
| [36] | Berni R, Luyckx M, Xu X, et al. Reactive oxygen species and heavy metal stress in plants: impact on the cell wall and secondary metabolism[J]. Environmental and Experimental Botany, 2019, 161: 98-106. |
| [37] | Song J L, Zou X Y, Liu P D, et al. Differential expressions and enzymatic properties of malate dehydrogenases in response to nutrient and metal stresses in Stylosanthes guianensis[J]. Plant Physiology and Biochemistry, 2022, 170: 325-337. |
| [38] | Kamran M, Wang D, Alhaithloul H A S, et al. Jasmonic acid-mediated enhanced regulation of oxidative, glyoxalase defense system and reduced chromium uptake contributes to alleviation of chromium (VI) toxicity in choysum (Brassica parachinensis L.)[J]. Ecotoxicology and Environmental Safety, 2021, 208. DOI:10.1016/j.ecoenv.2020.111758 |
| [39] |
鲜靖苹, 王勇, 张平. 外源茉莉酸甲酯对镉胁迫下多年生黑麦草种子萌发及幼苗生理的影响[J]. 西北师范大学学报(自然科学版), 2019, 55(6): 74-82. Xiao J P, Wang Y, Zhang P. Effects of exogenous methyl jasmonate on seed germination and physiological characteristics of Loliumperenne under cadmium stress[J]. Journal of Northwest Normal University (Natural Science), 2019, 55(6): 74-82. |
| [40] |
陈俊. 外源茉莉酸酮酯对红树幼苗重金属抗性的调控作用研究[D]. 上海: 华东师范大学, 2014. Chen J. Regulatory effect of exogenous jasmonates on heavy metal resistance of mangrove seedling[D]. Shanghai: East China Normal University, 2014. |
| [41] | Chen J, Yan Z Z, Li X Z. Effect of methyl jasmonate on cadmium uptake and antioxidative capacity in Kandelia obovata seedlings under cadmium stress[J]. Ecotoxicology and Environmental Safety, 2014, 104: 349-356. |
| [42] | Lu Q, Weng Y N, You Y, et al. Inoculation with abscisic acid (ABA)-catabolizing bacteria can improve phytoextraction of heavy metal in contaminated soil[J]. Environmental Pollution, 2020, 257. DOI:10.1016/j.envpol.2019.113497 |
| [43] | Hsu Y T, Kao C H. Role of abscisic acid in cadmium tolerance of rice (Oryza sativa L.) seedlings[J]. Plant, Cell and Environment, 2003, 26(6): 867-875. |
| [44] | Li S W, Leng Y, Feng L, et al. Involvement of abscisic acid in regulating antioxidative defense systems and IAA-oxidase activity and improving adventitious rooting in mung bean[Vigna radiata (L.) Wilczek]seedlings under cadmium stress[J]. Environmental Science and Pollution Research, 2014, 21(1): 524-537. |
| [45] | Zehra A, Choudhary S, Wani K I, et al. Exogenous abscisic acid mediates ROS homeostasis and maintains glandular trichome to enhance artemisinin biosynthesis in Artemisia annua under copper toxicity[J]. Plant Physiology and Biochemistry, 2020, 156: 125-134. |
| [46] |
刘栋栋. 硫化氢与脱落酸缓解植物镉胁迫的机制研究[D]. 西安: 西北农林科技大学, 2021. Liu D D. Mechanism of hydrogen sulfide and abscisic acid to alleviate cadmium stress in plants[D]. Xi'an: Northwest A&F University, 2021. |