2022, Vol. 43
2. 湟源县草原站, 西宁 812100;
3. 青海省草原总站, 西宁 810008
, LI Xi-lai1
, JIN Li-qun1,2 , ZHAO Yu-rong1 , LI Cheng-yi1 , ZHANG Jing1 , SONG Zi-han1 , SU Xiao-xue1 , LIU Kai3
2. Huangyuan County Grassland Station, Xining 812100, China;
3. Qinghai Provincial Grassland Station, Xining 810008, China
高寒生态系统是陆地生态系统中最重要的组成部分之一, 能够提供许多生态服务, 对陆地生态系统的碳(C)和氮(N)循环有重要作用[1, 2].近几十年来, 由于畜牧业的快速发展, 牲畜数量远远超过了草原承载能力[3], 导致高寒草甸退化[4].高寒草甸草毡层剥离形成退化斑块[5, 6], 改变了植物组成, 降低植物多样性以及地上和地下生物量[7, 8], 同时也影响了土壤养分循环[9, 10], 导致土壤细菌群落多样性发生变化[11].以往研究主要关注植物群落和土壤性质等方面的变化[1, 12], 有学者研究了草地退化过程和细菌变化特点[11, 13], 忽视了不同类型退化斑块植被和土壤的差异性, 同时不同类型退化斑块土壤细菌群落组成和多样性特征也尚未得到研究.有研究表明, 不同类型退化斑块之间存在恢复演替关系, 活动斑块在无高原鼠兔(Ochotona curzoniae)干扰条件下会在1~2 a内演替至非活动斑块, 从非活动斑块演替至恢复斑块, 至少需要3~5 a时间; 而要进一步演替至高寒草甸, 至少需要10 a或者更长时间[14, 15], 但是该演替过程中细菌群落变化特征还不清楚.
土壤细菌作为数量最多的微生物类群, 是土壤有机质和凋落物的最重要分解者, 在调节生物地球化学循环、驱动生物圈能量流和物质循环方面发挥着重要作用[16~19], 在决定退化草地的发展方向上起着关键作用[20].例如, 重氮营养菌和溶磷菌等细菌可以提高土壤养分的可用性, 促进植物生长, 从而促进退化草地的恢复[21, 22].相反, 硝化菌、反硝化细菌和植物病原体增加了土壤氮(N)流失和植物疾病的风险, 从而加剧了草地退化[23].此外, 土壤细菌群落对环境变化异常敏感, 因此常被作为生态系统变化的指示物种.因此, 研究土壤细菌的组成将有助于人们更好地理解草地退化和恢复过程, 并有助于人们预测和控制退化草地的发展.土壤基质持续性、温度和湿度等物理和化学特性以及地上植被等因素的变化将引起土壤细菌群落发生变化[24, 25].土壤pH、碳氮比(C ∶N)和植被类型通常被认为是土壤微生物分布模式变化的主要驱动因素[26, 27].例如, 在青藏高原高海拔地区进行的研究中, 发现土壤pH是影响细菌群落结构的主要因素.也有学者认为, 气候是细菌多样性和结构组成的重要影响因子, 例如较低的年平均温度、较短的生长季节和较慢的养分周转率均不利于植被和细菌生长[28, 29].降水、土壤pH、温度和植被对细菌的影响与海拔高度变化密切相关[30], 不同海拔地区规律可能存在一定差异.近些年, 海拔与细菌群落组成和多样性之间的关系的研究还未得出一致结论.有研究发现, 细菌结构多样性变化与海拔变化具有一致性[31], 安前东等[32]发现微生物多样性随海拔变化显著下降.但在黄河源区海拔变化下细菌结构多样性变化及影响因子尚不清楚.
本文选取不同海拔高寒草甸退化斑块的土壤细菌为研究对象, 采用MiSeq高通量测序方法, 分析土壤细菌多样性, 并探讨海拔变化和退化对土壤细菌群落组成的影响.此外, 土壤细菌较植物对环境变化更敏感[33], 了解微生物分布特点有助于帮助了解土壤生态系统健康状态.因此, 对不同海拔的土壤细菌多样性的研究, 能够更好地了解青藏高原高寒草甸生态系统土壤细菌的地理分布模式和不同海拔梯度土壤细菌群落变化的驱动力, 有利于阐明环境变化过程中细菌变化特点, 以期为全球气候变化高寒草甸土壤生态系统功能的预测提供理论依据.
1 材料与方法 1.1 研究区域概况研究地点位于青海省果洛藏族自治州甘德县(33°33′N, 99°36′E), 分别选取海拔4 013 m和4 224 m的高寒草甸阳坡滩地(<5°)进行调查取样, 各调查样地面积约10 hm2.甘德县年平均气温为-2.3℃, 年降水量为542 mm, 不同海拔地区草地类型均为高寒草甸.主要植被有矮生嵩草(Kobresia humilis)、垂穂披碱草(Elymus nutans)、草地早熟禾, 密花香薷(Elsholtzia densa)、四数獐牙菜(Swertia tetrapteta)和细叶亚菊(Ajania tenuifolia)等.
1.2 研究方法 1.2.1 样地选择和植被调查方法2020年8月, 在青海省果洛藏族自治州甘德县不同海拔的2个研究区, 利用样方法调查植被特征.将每个样地分为3个采样区, 在不同采样区内随机选取不同类型退化斑块.一般分为活动斑块、非活动斑块和恢复斑块等3类斑块, 主要依据植被类型和植被总盖度进行斑块分类, 活动斑块区由于高原鼠兔频繁活动, 植被难以建植, 活动斑块植被盖度几乎为0; 非活动斑块是由于高原鼠兔停止扰动活动1~2 a后形成的斑块, 具有少量一、二年生杂类草植物如密花香薷(Elsholtzia densa)和细叶亚菊(Ajania tenuifolia)等, 植被盖度在20% ~40%; 恢复斑块是非活动斑块进一步自然生态恢复形成的斑块, 主要以莎草科植物如苔草(Carex supina)为优势物种, 伴生少量乳白香青(Anaphalis lactea)等多年生杂类草, 植被盖度>40%, 见宋梓涵[14]的研究, 各类斑块见图 1.在两个样地中随机选取不同类型退化斑块进行植被调查, 样方面积为0.25 m2, 各类斑块分别重复4次.利用目测估算样方内植被总盖度和经济类群(禾本科、莎草科、杂类草)盖度, 利用栅格计数法估算苔藓盖度[34], 齐地面刈割法测定高寒草甸经济类群植物鲜量.
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(a)、(b)、(c)和(d) 分别为活动斑块、非活动斑块、恢复斑块和高寒草甸 图 1 3种类型退化斑块和高寒草甸 Fig. 1 Three types of degraded patches and alpine meadows |
植被特征调查后, 按照对角线在样方内随机布置3个样点, 挖取土壤(深度0~10 cm)混装于自封袋中, 将同一样区相同类型斑块的4个调查样方土壤样本两两混合为1个样本, 每个样区同类型斑块的土壤构成2个样品, 每个样地相同类型斑块均可以获得6个土壤分析样本, 用于分析土壤化学性质.微生物土壤样品取样方法如下：为避免微生物感染使用原位土擦拭取样药匙, 然后在调查样方内按照对角线随机布置5个样点, 挖取表层(深度0~5 cm)土壤样品装于5 mL冻存管中, 将同一样区4个调查样方的微生物土壤两两混合为1个样本, 同样每个样地各类型斑块均获得6个微生物土壤样本.将获得的微生物土壤样品暂时保存在4℃便携式冰箱内, 带回实验室于-80℃冰箱保存.用于测定土壤化学性质的土壤样品, 带回实验室阴干备用.
利用AA3连续流动分析仪(德国, SEAL)测定土壤全氮(total nitrogen, TN)、铵态氮(ammonium nitrogen, NH4+-N)、全磷(total phosphorus, TP)和速效磷(available phosphorus, AP), 利用火焰光度法测定土壤全钾(total potassium, TK), 利用电位法测定土壤pH.
1.2.3 微生物测定DNA提取：使用Power Soil DNA Isolation Kit(MoBio Laboratories, Carlsbad, CA)试剂盒提取基因组DNA, 并使用Nanodrop检验DNA质量和浓度.PCR扩增：按指定扩增区域, 合成带有barcode的特异引物, 使用KAPA 2G Robust Hot Start Ready Mix及引物进行PCR扩增(扩增区域为16S rRNA的V3~V4区, 引物为336F, 806R), PCR扩增总体系为25 μL.使用1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增目的条带大小(170 V, 30 min), 并使用磁珠法进行自动化纯化.MiSeq文库构建：按照Pooling比例, 对没有错位碱基的融合引物PCR产物取一定体积Pooling成一个上机文库, 并使用2%琼脂糖胶对文库片段进行筛选.筛选后的文库片段经Qubit检测定量, 取一定量文库加入10 μL End repair & Add A进行末端修复加A尾, 再加入33.5 μL Adaptor Ligation Mix进行加测序接头的连接, 并对文库进行纯化回收.然后加入接头引物、酶及Mix进行PCR富集完成文库构建.最后, 对文库进行PCR产物纯化.上机测序：文库在Illumina MiSeq平台上机测序.以上过程均委托北京奥维森基因科技有限公司完成.
PICRUSt功能预测分析：本文采用PICRUSt2对细菌OTUs丰度进行标准化, 对比KEGG数据库的信息, 获得各功能基因的丰度, 推测微生物群落的功能信息[35].
1.2.4 数据处理与分析本文利用Microsoft Excel对数据进行整理, 利用SPSS 19.0对不同海拔同类型斑块植被、土壤特征、细菌OTUs数量和微生物多样性进行T检验分析, 使用双尾检测, 当P<0.05时差异显著; 利用SPSS 19.0对相同海拔不同类型斑块植被、土壤特征、细菌OTUs数量、微生物多样性和不同功能相关的细菌丰度进行单因素方差分析, 使用双尾检测, 当P<0.05时差异显著.利用Excel对细菌门、属的水平上相对丰度进行统计并绘制柱状图.利用R4.0对微生物、植被和土壤特征进行冗余分析(redundancy analysis, RDA), 并绘图.
2 结果与分析 2.1 不同类型斑块植被和土壤化学性质特征由表 1可知, 相同海拔的非活动斑块和恢复斑块植被总盖度、禾本科盖度、莎草科盖度和生物结皮盖度均显著低于高寒草甸(P<0.05).恢复斑块杂类草盖度最低, 不同海拔恢复斑块杂类草盖度差异不明显, 分别为11.67%和11.83%.不同海拔相同类型斑块的禾本科盖度相差不显著.不同海拔高寒草甸莎草科盖度差异不明显(48% ~53%), 恢复斑块中莎草科盖度随海拔升高显著降低(P<0.05).海拔4 224 m处非活动斑块的莎草科盖度最低, 仅为0.92%, 与海拔4 013 m之间差异不显著.两海拔地区的非活动斑块、恢复斑块的生物结皮盖度均显著低于高寒草甸(P<0.05), 非活动斑块中的生物结皮盖度随海拔升高整体呈下降趋势, 恢复斑块和高寒草甸生物结皮特征随海拔变化不明显.随着海拔升高非活动斑块和恢复斑块地上生物量显著降低(P<0.05), 但高寒草甸差异不显著.
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表 1 不同海拔不同退化斑块植被特征1) Table 1 Vegetation characteristics of different degraded patches at different altitudes |
由表 2可知, 海拔4 013 m的退化斑块中, 恢复斑块土壤ω(TN)最高, 为1.77 g ·kg-1, 显著高于活动斑块和非活动斑块, 但与高寒草甸含量相比差异显著(P<0.05).海拔4 224 m样地中三类退化斑块TN均显著低于高寒草甸(P<0.05).不同海拔的活动斑块ω(TP)均最低, 分别为0.74 g ·kg-1和1.12 g ·kg-1, 均显著低于非活动斑块和恢复斑块(P<0.05).就TK而言, 海拔4 013 m不同斑块和高寒草甸TK差异不显著; 海拔4 224 m的非活动斑块TK最高, 高寒草甸最低, 且差异显著(P<0.05).不同海拔地区的高寒草甸NH4+-N均显著高于同海拔地区的三类退化斑块(P<0.05).海拔4 013 m处活动斑块ω(AP)最高, 为2.12 mg ·kg-1, 海拔4 224 m地区高寒草甸ω(AP)最高, 为6.01 mg ·kg-1.除非活动斑块外, 其他类型退化斑块和高寒草甸TN土壤化学特征, 随海拔升高均呈下降趋势.活动斑块和非活性斑块的TP随海拔升高显著升高, 恢复斑块和高寒草甸显著下降(P<0.05).随着海拔升高, 三类退化斑块NH4+-N均显著下降(P<0.05).除活动斑块以外, 其他退化斑块和高寒草甸AP随海拔升高显著增加(P<0.05).随海拔升高, pH均呈升高趋势, 不同海拔的活动斑块之间差异不显著, 其他类型斑块均有显著差异(P<0.05).
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表 2 不同海拔不同类型退化斑块土壤化学性质 Table 2 Soil chemical properties of different degraded patches at different altitudes |
2.2 不同海拔不同类型斑块土壤微生物OTUs数量分析
利用Venn图分析发现(图 2), 不同海拔不同类型退化斑块中OTUs总数量差异不明显, 分别为8 224个和8 155个.海拔4 013 m处的三类退化斑块和高寒草甸共有细菌OTUs数量最多, 为3 192个, 占细菌OTUs总数的38.81%[图 2(a)]; 海拔4 224 m处共有的细菌OTUs数量较少, 为2 762个, 占细菌OTUs总数的34.03%[图 2(b)].随着海拔的升高, 活动斑块独有的OTUs占比逐渐增加, 海拔4 013 m的活动斑块独有细菌OTUs为395个, 占细菌OTUs总量的4.80%, 随海拔升高, 活动斑块独有的细菌OTUs数量增加为570个, 占细菌OTUs总量的7.02%.恢复斑块、非活动斑块和高寒草甸独有OTUs占比海拔变化特征不明显.
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图 2 不同退化斑块和高寒草甸土壤细菌OTUs数量 Fig. 2 OTUs number of soil bacteria of different degraded patches and alpine meadows at different altitudes |
不同海拔、不同类型斑块土壤细菌门水平相对丰度分布特征见图 3.从中可知, 不同海拔不同斑块优势细菌门是变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteriota)和酸杆菌门(Acidobacteriota), 其中海拔4 013 m的高寒草甸的相对丰度分别为27.78%、22.57%和22.48%.活动斑块、非活动斑块和恢复斑块的放线菌门相对丰度低于高寒草甸, 但酸杆菌门相对丰度高于高寒草甸.海拔升高后, 主要优势细菌门没有发生变化, 但是其相对丰度发生了较大差异.随着海拔升高, 非活动斑块、恢复斑块和高寒草甸变形菌门相对丰度增加, 海拔4 224 m分别为29.16%、30.63%和28.62%.除恢复斑块外, 其他类型斑块放线菌门相对丰度随海拔升高而变大.分析发现, 随着海拔的升高, 各类斑块的酸杆菌门相对丰度降低, 其中活动斑块和非活动斑块之间差异较大, 海拔4 224 m地区的活动斑块和非活动斑块的酸杆菌门相对丰度要高于海拔4 013 m地区的同类型斑块约6%.
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(a)海拔4 013 m, (b)海拔4 224 m 图 3 土壤细菌门水平上相对丰度 Fig. 3 Relative abundance of bacteria at phylum level |
分析不同海拔和不同类型斑块土壤细菌属水平的相对丰度发现(图 4), 不同海拔的高寒草甸和各类斑块土壤中未鉴定出的细菌属比例最高, 随海拔升高, 未鉴定出的细菌属相对丰度降低, 海拔4 224 m非活动斑块地区占比最低, 为9.96%. RB41 、鞘脂单胞菌属(Sphingomonas)和慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)在鉴定出的细菌属中占绝对优势.海拔4 224 m的非活动和恢复斑块中RB41 相对丰度分别为4.88%和5.41%, 高于同海拔地区的高寒草甸(4.77%), 但活动斑块中RB41 相对丰度低于高寒草甸.随海拔的升高, 各类型斑块RB41 相对丰度下降, 其中恢复斑块和高寒草甸降低程度最大.不同海拔非活动斑块的鞘脂单胞菌属相对丰度最高, 分别为5.11%和2.76%.随海拔升高, 不同类型斑块的鞘脂单胞菌属相对丰度均降低.慢生根瘤菌属在不同海拔不同类型斑块中表现出较大差异.随着海拔的升高, 活动斑块和恢复斑块慢生根瘤菌属相对丰度降低, 但非活动斑块表现出相反趋势.退化导致慢生根瘤菌属相对丰度下降, 海拔4 013 m的活动和非活动斑块的慢生根瘤菌属相对丰度相似, 是高寒草甸的一半; 海拔4 224 m的活动斑块慢生根瘤菌属相对丰度仅是高寒草甸的1/3.海拔4 013 m不同类型斑块的节杆菌属(Arthrobacter)相对丰度均小于1%, 但在海拔4 224 m地区, 节杆菌属相对丰度显著高于海拔4 013 m的杆菌属相对丰度, 该地区中活动斑块相对丰度最低, 高寒草甸最高, 分别为0.88%和7.7%, 随着斑块的恢复演替其相对丰度逐渐增加.
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(a)海拔4 013 m, (b)海拔4 224 m 图 4 土壤细菌属水平上相对丰度 Fig. 4 Relative abundance of bacteria at genus level |
由表 3可知, 随着海拔的升高, 活动斑块土壤细菌Chao1指数变化微弱, 但恢复斑块和高寒草甸显著增加(P<0.05).退化增加了Chao1指数, 不同海拔的活动斑块土壤细菌Chao1指数均显著大于高寒草甸(P<0.05), 而恢复斑块与高寒草甸土壤细菌Chao1指数相差较小, 所以退化高寒草甸恢复过程中, 土壤细菌Chao1指数也逐渐接近高寒草甸.海拔4 013 m的样地中, 活动斑块和非活动斑块土壤细菌物种数显著高于高寒草甸, 数量分别为3 402.12和3 088.75.随海拔升高, 各类斑块物种数增加, 除非活动斑块外, 其他类型斑块之间差异显著(P<0.05).同类斑块的Shannon和Simpson指数海拔变化特征不明显.
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表 3 退化斑块土壤细多样性 Table 3 Soil chemical properties of different degraded patches at different altitudes |
2.5 不同类型斑块土壤细菌群落功能特征
对不同海拔不同斑块土壤细菌功能预测发现(表 4), 海拔4 013 m的退化斑块(活动斑块、非活动斑块和恢复斑块)土壤中光合作用的细菌丰度较健康高寒草甸高, 与海拔4 224 m处的变化趋势一致.分析有关细菌和光合生物固碳作用细菌丰度发现, 海拔4 013 m的各类斑块之间差异不显著, 海拔4 224 m的活动斑块最高, 分别为1.30%和1.15%, 显著高于高寒草甸(P<0.05).海拔4 013 m的高寒草甸和恢复斑块的甲烷代谢相关的细菌丰度最高, 分别为0.36%和0.35%, 显著高于活动斑块和非活动斑块(P<0.05), 海拔4 224 m的高寒草甸甲烷代谢相关的细菌丰度显著高于活动斑块(P<0.05), 但三类退化斑块之间差异不显著.分析青霉素和头孢菌素生物合成相关的细菌丰度发现, 海拔4 013 m活动斑块和非活动斑块著高于高寒草甸(P<0.05), 海拔4 224 m的各类斑块之间差异不显著.海拔升高引起细菌固碳途径相关细菌丰度降低, 不同海拔的非活动斑块和高寒草甸之间差异显著(P<0.05), 不同海拔对氮代谢和甲烷代谢相关细菌丰度差异不大.各类斑块有关分泌系统作用的细菌丰度随海拔升高而下降, 除恢复斑块外, 其他类型斑块之间差异显著(P<0.05).海拔升高引起恢复斑块和高寒草甸中青霉素和头孢菌素生物合成功能表达相关细菌丰度显著升高(P<0.05).
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表 4 不同类型斑块土壤细菌功能预测/% Table 4 Prediction of soil bacterial function in different types of patches/% |
2.6 不同类型斑块土壤细菌群落与植被和土壤特征关系
通过冗余分析探讨优势细菌门、属和多样性和植被与土壤之间的关系发现(图 5), 不同海拔地区引起土壤细菌变化的关键影响因子不同.在门水平上[图 5(a)], 海拔4 013 m地区植被关键因子是生物结皮盖度和莎草科盖度, 主要的土壤因子是全氮含量, 其中生物结皮盖度与放线菌门和绿弯菌门呈正比, 与变形菌门和酸杆菌门负相关, 全氮表现出相似规律.随着海拔升高, 主控因子发生变化, 杂类草盖度和生物量对细菌群落结构影响较大, 而在土壤特征中除全氮外, 速效磷和pH也是关键影响因子, 全氮与速效磷含量与放线菌门、绿弯菌门正相关, 与变形菌门和酸杆菌门负相关.pH分别与绿弯菌门、放线菌门和酸杆菌门呈负相关关系[图 5(b)].属水平上, 海拔4 013 m地区, 生物量和RB41和鞘脂单胞菌属负相关, 土壤特征中, 全钾为主控因子, 与RB41呈负相关, 与鞘脂单胞菌属正相关[图 5(c)].随着海拔升高, 莎草科、杂类草盖度和全钾、速效氮转变为重要因子[图 5(d)].分析环境因子与细菌多样性发现[图 5(e)和5(f)], 生物结皮对不同海拔细菌多样性影响较大, 与海拔4 013 m的Chao1和物种数呈负相关关系, 但与海拔4 224 m的Chao1和物种数呈正相关关系.土壤中pH在不同海拔地区均属于重要影响因子, 与海拔4 013 m的Chao1和物种数呈正相关, 与海拔4 224 m的Chao1和物种数呈负相关.全钾对海拔4 224 m的细菌多样性影响较大, 对海拔4 013 m的细菌多样性影响不大.所以, 海拔不仅能够改变土壤细菌的关键影响因子, 还会改变环境因子与土壤微生物之间的关系.
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(a)和(b)分别表示不同海拔门水平上优势细菌相对丰度和环境因子RDA分析, (c)和(d)分别表示在不同海拔属水平优势细菌相对丰度和环境因子RDA分析, (e)和(f)分别表示不同海拔细菌多样性和环境因子RDA分析; Prote表示Proteobacteria, Bacte表示Bacteroidota, Actin表示Actinobacteriota, Chlor表示Chloroflexi, Acido表示Acidobacteriota, Brady表示Bradyrhizobium, Uncul_Aci_Bac表示Uncultured_Acidobacteria_Bacterium, Uncul_Bac表示Uncultured_Bacterium, Obs_spe表示Observed_species, Goods_cov表示Goods_coverage, Totall_cov表示总盖度, Grasscov表示禾本科盖度, Sedge_cov表示莎草科盖度, BSCs_cov表示生物结皮盖度; 红色箭头表示环境因子, 黑色箭头代表细菌相对丰度和多样性指数 图 5 土壤细菌多样性与土壤和植被特征的RDA分析 Fig. 5 Results from RDA to explore the relationship among the bacterial diversity, soil properties, and vegetation characteristics |
退化斑块恢复演替过程中(活动斑块→非活动斑块→恢复斑块→高寒草甸), 土壤细菌群落特征发生了明显的变化.不同类型斑块和高寒草甸土壤细菌群落的优势类群基本相同.本研究发现, 在门水平上, 变形菌门和酸杆菌门是最具优势的分类群(图 3), 其结果与孙华方等[33]和Zhang等[36]的研究结果一致.变形菌门内的很多微生物不仅可以通过异养过程获得能量, 该门下的很多属可以从太阳光中获得能量进行代谢[37], 多样化的能量利于途径有利于变形菌门在自然界中广泛存在.酸杆菌门具有独特的寡营养特性、低温下较高的代谢活性和快速利用有机物等特性, 在高寒地区能够通过分泌大量β-葡萄糖苷酶和纤维二糖水解酶等碳氮分解关键酶获得能量供自身生长, 成为高寒地区土壤主要的优势菌门[38, 39].但在属水平上, 不同类型斑块之间具有显著差异.本研究发现, RB41、鞘脂单胞菌属和慢生根瘤菌属是属水平上最具优势的分类群(图 4), 该结果与李成一等[40]的研究结果相似.但不同类型斑块相对丰度不同, 随着退化斑块的植被恢复, RB41和慢生根瘤菌属处于逐渐恢复中. 虽然不同海拔恢复斑块的慢生根瘤菌属相对丰度较活动斑块和非活动斑块高, 但是依然显著低于高寒草甸, 所以退化斑块细菌群落恢复到高寒草甸还需要较长时间.慢生根瘤菌属主要通过利用铵盐和硝酸盐等, 或者与植被根系形成根瘤固定大气中的氮元素等方式, 对土壤中或者大气中氮素的分布产生很大影响[41, 42], 草地退化引起的慢生根瘤菌属相对丰度减少, 可能是导致高寒草甸土壤氮素流失的关键过程, 尤其在海拔较高地区.本研究中的退化斑块如恢复斑块和非活动斑块土壤中土壤全氮含量显著低于高寒草甸土壤的试验结果(表 2), 进一步得到了验证.有学者指出, 鞘脂单胞菌属和节杆菌属对降解复杂有机污染物有显著作用[43, 44], 本研究发现鞘脂单胞菌属在活动斑块中具有较大丰度, 有利于降解斑块土壤中顽固有机物, 以此缓解活动斑块碳源短缺.节杆菌属也受到斑块植被恢复演替的影响, 随着植被恢复演替土壤养分丰富, 促进了节杆菌属的恢复.所以, 斑块正向演替有利于微生物生长, 促进土壤结构和功能恢复.
除斑块类型外, 海拔也是影响细菌微生物多样性的重要因子[45, 46].本研究发现, 随着海拔的升高主要优势菌门的相对丰度发生了显著变化, 如变形菌门相对丰度随着海拔的升高而升高.可能是因为不同海拔地区的气候(降水和积温)具有显著差异性, 进而引起变形菌门相对丰度发生变化.一般来说高海拔地区严酷的环境会影响微生物的生长.然而, 高海拔地区变形菌门相对丰度较低海拔地区大, 这可能与高海拔地区高寒草甸土壤中的积累的大量有机质和矿物质营养有关.肖烨等[47]也发现细菌与有机质含量之间有显著正相关关系.Siles等[48]发现海拔升高会降低细菌多样性, 本文并没有得到一致的结果.本研究发现, 细菌Chao1指数和物种数量随海拔的升高而增大(表 3), 提高了土壤细菌群落结构的复杂性, 有利于细菌群落维持稳定.在高海拔地区, 一些如Deinococcota门和节杆菌属等抗逆强的微生物逐渐出现, 研究表明, Deinococcota门能够抵抗氧化应激和辐射[49, 50], 而节杆菌属通过产生更多功能性冷适应蛋白[51], 更能适应高海拔环境.Deinococcota门中的MBNT15具有硝酸盐还原代谢潜力[52], 所以Deinococcota门的出现可能对土壤有效氮在海拔分布上产生影响.
3.2 植被和土壤对不同类型斑块土壤细菌多样性的影响土壤细菌是土壤中活性很强的一类活性生物, 其生长活动易受到外界因素影响.RDA分析表明, 海拔4013 m的不同类型斑块中, 细菌多样性分布主要受到全氮、生物结皮和莎草科植物的影响.养分作为主要的能量来源直接影响细菌代谢和分布, 养分组成的不同会导致细菌分布具有差异.李成一等[40]和徐学池等[53]的研究发现, 氮元素的增加有利于草地优势细菌生长, 本文得出相似结论.本研究发现, 随着退化斑块的恢复演替, 土壤全氮含量变大(表 2), 放线菌也表现出增加的趋势, 同时RDA结果也表明全氮含量与放线菌具有正相关关系, 可能是因为氮肥不仅能够促进植被生长, 增加土壤碳源, 同时也能够平衡土壤C/N, 平衡土壤养分结构, 有利于放线菌生长.但变形菌和绿弯菌门表现出不同变化趋势.在活动和非活动斑块土壤中变形菌和绿弯菌门相对丰度均较高寒草甸大, 可能是因为该两类细菌门下有许多光自养类型的细菌如紫细菌利用菌绿素a和b、类胡萝卜素等色素是进行光合作用[37], 进而能够更容易在养分较少的环境中生存.同时细菌物种数也表现出一致规律(表 3), 较多数量的自养型细菌有利于降低养分缺少对微生物的影响.pH是决定细菌多样性沿海拔梯度变化的最重要因素[54, 55].本文也得出相似结论, 可能是因为土壤pH对土壤变量如酶活性、离子浓度、有机碳特征等有显著影响[56~58], 所以pH可能通过影响土壤环境显著改变微生物群落分布.
土壤细菌群落不仅受土壤有效养分的调控, 还受植物特性的影响[59].本研究发现, 海拔4013 m地区, 植被特征如总盖度和杂类草盖度是细菌群落结构多样性的主要影响因子(图 5), 退化导致植被盖度和生物量降低, 从而导致凋落物的来源减少, 致使微生物碳源减少, 导致慢生根瘤菌属减少, 所以不同类型退化斑块的慢生根瘤菌属相对丰度低于高寒草甸.随着海拔升高, 莎草科盖度成为影响慢生根瘤菌属的关键因子, 这可能是由于莎草科植物大量的凋落物和根系分泌物, 均为慢生根瘤菌属的生长提供了充足的碳源.虽然植物和土壤性质均是影响土壤细菌群落组成的重要驱动因素, 但有研究表明土壤性质的影响大于植物特性的影响[60, 61].本文在海拔4 224 m地区发现相似规律, 可能是因为土壤是细菌生长的基质, 能够直接对细菌产生影响.RDA对细菌多样性分析发现, 生物结皮和禾本科盖度对细菌多样性的增加有显著促进作用.有研究发现, 生物结皮对养分的积累和理化性质的改善有显著作用[62], 所以生物结皮可能通过影响土壤养分和改善土壤结构, 间接促进细菌多样性的恢复.此外, 生物结皮具有显著的保水功能, 也能够促进细菌群落的恢复[63, 64].细菌群落的变化在受到植被土壤影响的同时, 也对维持土壤和植被的稳定性有很重要的作用.有研究发现, 微生物能够影响土壤中养分变化和促进酶活性的恢复, 如放线菌通过增强碳降解相关的酶活性从而对土壤中的活性有机碳组分的分布产生很大影响[65], 进而也会对植被养分的利用产生影响.所以, 细菌与植被和土壤的耦合结构, 是一种互相影响和互相促进的自然进化系统.
3.3 不同类型斑块土壤细菌功能预测目前, 对于高寒草甸退化斑块土壤功能变化的研究较少, 草地退化和退化斑块恢复演替过程中植被和土壤特征的变化, 均会引起细菌多样性的变化, 进而引起细菌群落功能的改变.分析不同斑块土壤细菌功能变化发现, 不同类型退化斑块土壤中有关固碳功能的细菌丰度均高于健康的高寒草甸, 所以退化现象可能有助于土壤细菌碳功能提高, 进而应对土壤碳源减少的不良影响.甲烷是重要温室气体中的一种, 本研究发现, 草地退化引起了甲烷氧化细菌丰度降低, 可能会降低高寒草甸土壤甲烷氧化潜力.草地退化导致生物量和土壤养分明显减少[66], 使甲烷氧化细菌可利用的碳源和能量也减少, 导致甲烷氧化细菌生长受到限制, 本研究得到了一致的结果, 即退化斑块CH4氧化细菌丰度显著低于高寒草甸(P<0.05).微生物主要通过分泌胞外酶或者有机酸对土壤环境产生影响, 细菌胞外分泌通路直接影响细菌功能表达[18].本文发现, 退化斑块中有关土壤微生物分泌功能的细菌丰度高于健康草甸, 可能是因为土壤退化引起了细菌物种数量的增加(表 3), 同时增加了有关该功能的细菌丰度, 也增加了胞外物分泌途径, 这些将有利于退化土壤的功能恢复.因此, 在高海拔地区需要深入研究草地土壤退化对细菌变化的影响.
4 结论(1) 高海拔地区草地土壤退化会显著降低禾本科盖度和土壤养分含量.由于退化斑块恢复演替过程中生物结皮、禾本科和莎草科植物的基本特征与高寒草甸相差甚远, 所以退化斑块将需要更长时间才能恢复至健康高寒草甸状态.
(2) 3种退化斑块土壤优势细菌门均是变形菌门、放线菌门和酸杆菌门.土壤退化程度和海拔升高降低了放线菌门相对丰度, 增加了酸杆菌门的相对丰度.其中RB41 、鞘脂单胞菌属和慢生根瘤菌属为主要优势细菌属, 斑块退化降低了三者的相对丰度.细菌物种数随海拔和草地退化程度升高而增加, 但细菌多样性指数没有显著变化.草地斑块的正向演替有利于土壤微生物生长, 促进土壤结构和功能恢复.
(3) 植被特征如生物结皮盖度、生物量是海拔4 013 m地区细菌结构多样性的主要影响因子.随着海拔的升高, 土壤因子如全氮、全钾和pH对细菌结构多样性的影响力大于植被特征.
(4) 3种退化斑块的碳固定相关的细菌丰度高于健康高寒草甸, 但CH4氧化细菌相对丰度显著低于高寒草甸, 所以草地退化刺激了土壤固碳功能细菌相对丰度的增加, 但降低了土壤细菌的CH4氧化潜力.
致谢: 阿卓毛世吉、林春英和张宇航等在采样和实验方面提供帮助, 在此一并致谢！
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